このプロトコルは、共生細菌、この場合、特にバークホルデリア上で遺伝子操作を行い、昆虫宿主を植民地化するために不可欠な遺伝子を同定するのに有用である。トランスポゾン挿入シーケンシングは、1回の実験で同時に多数の条件的に必須遺伝子を同定するための強力なツールです。滅菌フードの下でカナマイシンとDAPを補充LB培地の10ミリリットルで大腸菌ドナーの新鮮なドナー培養を接種することから始めます.
5ミリリットルのKB培地中の受取細胞にバークホルデリア・グラディオリを接種する。250 RPMのシェーカーで一晩摂氏30度で培養をインキュベートします。一晩増殖した後、遠心分離は、各培養物の4ミリリットルを9で、600倍Gで6分間細胞をペレットし、上清を捨てる。
無菌フードの下で、ペレット化された細胞培養物をDAPを含むKB培地で洗浄する。そして最後に、KBプラスDAP培地の4ミリリットルで培養を別々に再中断する。新鮮な15ミリリットルのチューブに、洗浄された大腸菌ドナー細胞の250マイクロリットルを、洗浄されたバークホルデリア・グラディオリ株Aレシピエント細胞の1ミリリットルと混合する。
DAPを含むKB寒天プレート上のこの共役細胞混合物の10マイクロリットルをスポットする。プレートを室温で無菌フードに邪魔されずに1時間放置します。12〜18時間摂氏30度のコンジュゲーションスポットでプレートをインキュベートします。
インキュベーションの後、滅菌フードの下のプレートに1X PBSの2〜4ミリリットルを加え、細胞スクレーパーを使用して寒天から成長した細菌の共役スポットを放出します。次いで、コンジュゲートされた細胞を2つのミリリットルマイクロフュージチューブにピペット混合する。ペレットは、9で遠心分離により細胞を、2分間Gを600回回行う。
上清を捨て、ペレットを1ミリリットルで2回洗浄します。最終ペレットを1,200マイクロリットルの1X PBSで再懸濁します。よく混合し、カナマイシンを補った大きなKB寒天プレートに細胞混合物の100マイクロリットルを広げ、一晩摂氏30度でインキュベートします。
3つのプレート上のトランスコンジュガントコロニーの総数をカウントし、全てのプレートで得られた変異体の概数を計算するために外挿する。代表的なライブラリーを得る可能性を高めるには、コロニーの総数がゲノム内の遺伝子の総数よりも数倍高いことを確認してください。結合の成功を確認するために、原稿に記載されている10〜20個のサンプルコロニーを用いて挿入カセットを標的とするPCRを行う。
無菌フードの下で、寒天に1〜2ミリリットルの1X PBSを加えることによって、プレートからコロニーを削ります。プレートから削り取った細胞混合物を50ミリリットルのチューブにプールします。ライブラリを完全に混合し、プールされた変異体ライブラリの1ミリリットルをいくつかのクライオチューブに分割する。
チューブに70%グリセロールの1ミリリットルを加え、マイナス80°Cで保存します。L.絨毛の卵クラッチを選択し、クラッチに100個以上の卵が含まれている場合に継続する卵の数を数えます。卵クラッチ全体を殺菌するには、200マイクロリットルの70%エタノールを加え、卵を5分間静かに洗い、エタノールを取り除き、卵をオートクレーブ水で2回洗います。
12%漂白剤の200マイクロリットルを加え、30秒間ゆっくりと卵を洗います。すぐに漂白剤を取り出し、200マイクロリットルのオートクレーブ水で卵を再び3回洗います。PBSで洗浄された変異体ライブラリーのマイクロリットル当たり6細胞に2回10回を使用して殺菌された卵クラッチの卵を感染させる。
感染したカブトムシの幼虫の孵化の2日後、1.5ミリリットルマイクロフュージチューブあたり100秒のインスター幼虫を集め、マイナス80度で貯蔵する。in vitro対照ライブラリーを生成するために、カナマイシンを含む10ミリリットルのKB培地中の変異体ライブラリーのマイクロリットル当たり2倍10の250マイクロリットルを6個の細胞に接種する。in vivoおよびin vitro成長変異体ライブラリーからDNAを抽出した後、超音波処理器とDNAを共有する。
DNAが所望のサイズ範囲に剪定されているかどうかを確認するには、250ボルトで250ボルトで40分間実行される1.6%アガロースゲルでゲルローディング色素と混合した後、未シャレおよび剪定されたDNAの5マイクロリットルを40分間250ボルトで実行した。アダプターの結紮に必要な断片の端を準備するには、まず、3マイクロリットルの酵素ミックスと7マイクロリットルの反応バッファーを50マイクロリットルのせよシレDNAに加え、ピペット処理によってよく混合します。熱した蓋を摂氏75度以上に熱せ、摂氏20度で30分、摂氏65度で30分間インキュベートし、温度を摂氏4度に抑えます。
アダプターライゲーションの場合、ライゲーションマスターミックスの30マイクロリットル、ライゲーションエンハンサーの1マイクロリットル、および希釈されたアダプターの2.5マイクロリットルを、調製工程の終わりの製品に加えます。ピペットで十分に混ぜ、熱い蓋をオフにしてサーモサイクラーで摂氏20度で15分間インキュベートします。15分後、3マイクロリットルの酵素を加える。
ピペットでよく混ぜ、蓋を摂氏47度以上で加熱したサーモサイクラーで摂氏37度で15分間インキュベートします。250塩基対のフラグメントを標的とするアダプター連結DNAのサイズを選択するには、まず磁気ビーズ溶液をボルテックスして、使用前に30分間室温に置きます。結紮されたDNA混合物の96.5マイクロリットルに0.3倍のビーズを加え、十分にピペットで混ぜます。
ビーズ混合物を5分間インキュベートします。チューブを磁気スタンドに置いてビーズを引き下げ、不要なサイズのDNA断片を取り除きます。ビーズを5分間落ち着かせ、透明な上清を新しいマイクロフュージチューブに移します。
上清に0.15倍の新鮮なビーズを加え、よくピペットで混ぜます。ビード混合物を5分間インキュベートし、チューブを磁気スタンドに置き、標的DNAに結合したビーズを引き下げます。5分間待ってから、上清を捨て、ビーズを保管します。
マグネットスタンドにビーズを入れ、200マイクロリットルの新しい80%エタノールを加え、ビーズを邪魔することなくエタノールを廃棄する前に30秒間待ちます。スタンドからチューブを取り出し、0.1X TEまたはLow TEの17マイクロリットルを加え、10回ピペットして混ぜ、室温で2分間インキュベートします。チューブを磁気スタンドに置き、PCR-1用にサイズ選択されたDNAを15マイクロリットル取ります。
ボルテックスストレプトアビジンビーズを室温で少なくとも30分間置きます。ビーズの32マイクロリットルを取り、1X結合し、バッファーを洗浄する500マイクロリットルでそれらを洗浄します。32マイクロリットルの2X結合と洗浄バッファーを加え、ビーズを再中断します。
これに、クリーンアップされたPCR-1製品の32マイクロリットルを加えます。十分に混ぜ合わせ、室温で30分間インキュベートします。ビーズDNA混合物を磁気スタンドに2分間置きます。
ピペットは、挿入エッジを含むビオチンタグ付きDNAとして上清を出し、ビーズ上のストレプトアビジンに結合する。500マイクロリットルの1X結合と洗浄バッファーでビーズを洗浄し、200マイクロリットルの低TEでビーズを洗います。DNA結合ビーズを17マイクロリットルの低TEで再懸濁する。インビボおよびin vitro成長変異体ライブラリーのDNAは、超音波処理器で抽出および断片化され、100と400塩基対の間に及ぶ断片の大部分を示した。バークホルデリア・グラディオリ株Aゲノムの4つのレパコンにわたるトランスポゾン媒介挿入の位置は、ポッド内で観察することができる。
シーケンス出力の概要と、生体内およびin vitroライブラリの3つの反復でヒットしたユニークな挿入および遺伝子の数は、表で観察することができます。覚えておくべきことは、感染時にライブラリの適切な表現を得るために、ホストの植民地化中に母集団のボトルネックサイズを計算することです。また、生体外および宿主における細菌世代の互換性のある数に合わせて調整します。
トランスポゾン変異ライブラリーを生成した後、選択的培地上でスクリーニングして、フェノールの違いに基づいて変異体を回収することができる。したがって、条件に重要な特定の遺伝子を同定することができる。
