著者は、細菌のストレス応答と永続性 (BASP) ノボ ノルディスク財団とルンドベック財団、中心を通ってデンマークの国立研究財団 (DNRF120) からの助成金で賄われました。

1 トランスポゾン ライブラリのコレクション 注: ミニ Tn 10 に複製された染色体 DARS2 の軌跡-トランスポゾン (pNKBOR) に NKBOR 21 の結果を基。NKBOR:: DARS2 (pJFM1)。pNKBOR オンライン 22 が得られます。pNKBOR は、イニシエーター蛋白質 π をレプリケーション 23 R6K ベース自殺ベクトルです。プラスミド pJFM1 つまり、pir 遺伝子の染色体コピーを含む 大腸菌 の菌株 (例えば Dh5α λ pir) に複製することができます。しかし、pJFM1 は、Pir 欠損または MG1655 に変換されると、pJFM1 をレプリケートできません、NKBOR のランダムな挿入によって生成されたカナマイシン耐性クローンの選択につながる:: 細菌の染色体に DARS2。わかりやすくするためは、これらを DARS2 挿入と呼びます。方法論の図式の 図 1 を参照してください。
<ol><li>準備 electrocompetent MG1655 Δ DARS2 積極的に成長してから細胞のホストゲノム スープ (LB) 37 ° C 24 で成長しています</li>。
	Electrocompetent MG1655 Δ に <li>Electroporate pJFM1 DARS2、ゴンザレス ら によると 24 electrocompetent 大腸菌 MG1655 Δ <ol><li>40 (水の 1 μ L) で pJFM1 の追加 1 μ μ DARS2 中古冷蔵、滅菌の 0.2 cm ギャップ キュベットにこの混合物を転送。キュベットをエレクトロポレーション室に挿入します。18 Electroporate kV、500 Ω、25 μ F。時定数は ~5.0 ms をする必要があります、アーク放電は発生しません</li>。
		<li>流体培養基 LB に予め温めておいた 1 mL、15 mL の試験管に転送で再によって細菌懸濁液をすばやく回復します</li>。
		<li>抗生物質選択なしの 30 分の 37 ° C で気泡の成長条件の下での孵化によって回復細胞ができます。50µg/mL カナマイシンを添加した LB 寒天培地プレート上に細菌をプレートし、37 ° C で一晩インキュベートします</li>。
	</ol></li> <li>、エレクトロポレーションからコロニーをカウント: 1 つのコロニーは 1 つの染色体のトランスポゾン挿入に等しいと見なされます 。
	注: 目、コロニー カウンターは、コロニーが数えることができます。コロニーの数、各クローンの染色体にあるトランスポゾンを分離する平均距離に反比例します</li>。
	流体培養基 LB のそれぞれに追加の 1 mL <li>プレートし、すべてのコロニーを洗い流して; 流体培養基 LB の 1 mL は 〜 100,000 コロニーを洗浄するための十分な必要があります。流体培養基 LB の細菌濃度を増加する同じ 1 mL を再利用します。同じ 50 mL のチューブですべてのコロニーをプールします</li>。
	<li>渦管凍結開始材料と (t = 0)。それを凍結、氷の上の 50% のグリセロールの 1 mL の細胞懸濁液の 1 mL を混ぜます。10 分のドライアイスにチューブを転送します。文化が固定されている一度は-80 ° C のフリーザーにそれらを転送します 。
	注: 50,000 CFU/mL 以上の細胞濃度はこの段階で予想します</li>。
</ol> 2。LB の競争実験 <ol><li>融解氷-80 ° C からトランスポゾン ライブラリ。ピペッティングでミックスします</li>。
	<li>10 ml LB の 15 mL の試験管にトランスポゾン ライブラリの転送 100 μ L.</li>
	<li>固定相への 37 ° C で 8 時間の連続振動 (250 rpm)、曝気、細胞の成長 (すなわち、 外径 600 〜 4.0 を =)。必要に応じて、生育条件にこれらのパラメーターを調整します</li>。
	<li>は、すべて 〜 10 世代、新鮮な prewarmed 中に連続転送によって細菌の人口を反映します。以前の固定相文化の 10 μ L を新鮮なポンドの 10 mL に転送する、静止した段階別の 8 h の成長によってこれを行う (すなわち、 外径 600 〜 4.0 を =). 
	注: 開始と終了の光学密度は同じ、1,000 倍希釈対応 〜 10 世代の成長する (2 10 = 1,024)。細菌の人口が新鮮な prewarmed 媒体に直接反映したり、0 - 4 保存 ° C (氷上) し、次の日を反映します。ポンドがここでは、できるだけ (22 分近く倍加時間) 時間の短い多くの細胞の doublings を確保するために使用されたします</li>。
	<li>競争の各 100 世代後、付けて-80 ° c の 5 つの 1 mL サンプル (ステップ 3.3 で説明します).</li>
	<li>個々 のトランスポゾンの挿入を含むセルとフィットネスの差が小さい場合は、期間を保つ、競争の長い; ここでは、700 世代 (t = 700) 使用された</li>。
</ol> 3。競争期間実験を監視する南しみ分析 <ol>特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) の拡大を実行してしみ (1 kb、NKBOR 部)、サザンのプローブ <li>準備: NKBOR_Probe_FW: gatgttggacgagtcggaat と NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt。
	初期変性 <ol><li>加温 30 98 ° C で s。次に、10 の 98 ° C で 35 サイクルを実行 s、60 ° C、30 s、および 45 のための 72 ° C s。最後の拡張使用 72 ° C で 10 分間 
		注: PCR の反作用のテンプレートだった精製 pNKBOR プラスミド 21</li>。
		<li>スミス 25 によると任意プライマーを用いた α [32 P] dATP の結果 PCR のフラグメントのラベルします</li>。
	</ol></li> <li>Løbner 欧米とフォン Freiesleben 26 によると総細胞 DNA を備える t t まで 0 と選択した時点を = = 競争の世代を推定 700</li>。
	<li>ダイジェスト Pvu プローブによって覆われていない領域でのみ一度関心の領域を含む NKBOR をカット、私の全細胞の DNA; Pvu の 1 単位使えます基板 DNA の完全にダイジェスト 1 μ g にします 。
	メモ: プローブの挿入部位によって、様々 な長さの染色体 DNA と共に、トランスポゾンの一部を含むフラグメントが認識されます</li>。
	<li>南しみ Løbner 欧米とフォン Freiesleben 26 によると 0.7% の agarose のゲルを使用してを実行します</li>。
</ol> 4。適者生存のクローンの同定 ウォーキング、前述のハリソン ら によって <ol><li>使用簡単な遺伝子 27, 700 推定世代競争の後 (LB の版に分離) 単一のクローンから DARS2 挿入サイトを識別するために他のバンドすべてトランスポゾン挿入をカバーするためにより多くの分離、サザンブロット上。
	PCR テンプレート用 <ol><li>分離株のゲノム DNA。50 μ G/ml カナマイシンを含む LB 寒天培地プレートに細菌を広げるし、37 ° C で一晩インキュベートします。流体培養基 LB の 37 ° c で一晩シングル コロニーを成長しその後オートクレーブに蒸留水を 200 μ L に 20 μ L を転送 (または、ステップ 3.2 のように、DNA の浄化を使用)。
		<ol><li>ミックスする渦。100 ° C でミックスを熱の 10 min と max 速度で 5 分間遠心するを保存する将来の使用のための-20 ° C でライセートのセル</li>。
		</ol></li> <li>好みのトランスポゾンでアニールする 3 つの入れ子になったプライマーを設計 (PCR 戦略のグラフィック表現の 図 2 を参照). 
		注: はプライマー 3 の入れ子にある知られている 5 に最も近いように入れ子にプライマーの設計 &#39; トランスポゾン DNA、続いてネスト プライマー 2 と 1 の終わり。入れ子になっているプライマー 3 と 5 の間隔 &#39; 知られている t の終わりransposon DNA は、(特定の染色体トランスポゾン挿入部位を見つける) に未知の dna 既知の DNA からシーケンス リード スルーのため十分なはずです。NKBOR 次の入り込まれたプライマーは使用された: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg、および pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg。知られている制限酵素の認識部位を含むランダム プライマーも使用されます。結果を確保するため、1 つは少なくとも 2 つの異なるランダムなプライマーを使用する必要があります。制限酵素 (e.g.,Sau 3AI、Hin dIII) の制限のサイトは 3 時位置にする必要があります &#39; を終了し、10 のランダムな塩基によって先行 5 &#39; - NNNNNNNNNNGATC - 3 &#39; と 5 &#39; - NNNNNNNNNNAAGCTT - 3 &#39;、プライマーそれぞれ、ソウ 3AI サイト (GATC) と Hin dIII サイト (AAGCTT) を含む、N = A、T、G、または C</li>
		<li>、20 の DNA の使用 200 ng μ L の PCR 反応。30 98 ° C の孵化初期変性の s。30 の 98 ° C で 25 サイクルを実行 s、50 ° C、15 s と 4 分の 72 ° C。最後の拡張使用 72 ° C 10 分使用プライマー プライマー 1 の入れ子になっているとランダムなプライマーのいずれかから成る</li>。
		<li>テンプレートとして 1 μ L の反応は以前を使用して入れ子になったプライマー 2 と 2 番目の増幅から同じ任意プライマーから成るプライマー対を使用します</li>。
		<li>プライマー プライマー 3 のネストと同じ任意プライマーから成ると繰り返しステップ 4.1.4</li>。
		<li>は、1.5% の agarose のゲルとエチジウム ブロマイドで染色に最終的な PCR の反作用から製品を実行します。100-800 bp の範囲でバンドをカットし、抽出キットの製造元によって任意の商業 DNA ゲルを用いた DNA を隔離 &#39; s 方向。水の 15 μ L の DNA を再懸濁します 。
		注: 注意。臭化エチジウムは毒性があり注意して処理する必要があります</li>。
		<li>サンガーを使用して配列のプライマーとしてネスト プライマー 3 前の手順 (手順 4.1.6) で分離帯をシーケンス商業プロバイダーの配列</li>。
	</ol></li> <li>実行 WGS。
	<ol><li>から抽出した DNA の合計実行 WG Frimodt Møller ら 4 で説明されているように競争実験中に収集されたサンプルを選択した</li>。
	</ol></li> <li>シーケンス解析を実行します。
	<ol><li>整列ペアエンド読み取り 150 Ns NKBOR、AF310136.1 1,904 に隣接した &#8230; Bowtie2 28 を用いた種子部分文字列 (S、1、1.15) とあいまいな文字 (L、0, 0.9) の最大数間隔 2,204</li>。
		<li>配向の読み取りを選択し、両方 MG1655 ref に再整列 |NC_000913.3 と NKBOR gb |AF310136 blastN 29 を使用して</li> <li>接合 MG1655 NKBOR で、挿入位置の転位を割り当てる</li>。
	</ol></li></ol> 5。フローサイトメトリー <ol><li>フローサイトメトリー用サンプルを収集します。
	少なくとも 10 世代のため指数関数的成長の段階でそれを維持する <ol><li>バランス各文化です。外径 600 を確認し、それが 0.3 を超えることはありません</li>。
		<li>は、フロー サンプルの 2 種類を収集します。
		<ol><li>リフ-振れのリフ CEF (300 μ g/mL リファンピシン、36 μ g/mL セファレキシン 12.5 mM NaOH に溶解) の 30 μ L を含む 15 mL チューブ文化の 1 mL に転送します。揺れの 4 h の最小値の 37 ° C でそれを残しています 。
			注: リファンピシン直接ブロックないのレプリケーションの継続的なラウンドを終了し続けるようにしながら染色体複製開始します。セファレキシンは、レプリケーション振れ (リフ振れ) および完全に複製された染色体を持つ細胞の蓄積で起因する細胞分裂を防ぐことができます。リファンピシン、セファレキシン 20 治療の時に完全に複製された染色体の数は起源の数と等しい</li>。
			<li>EXP サンプル、転送指数関数的に成長する氷を 1.5 mL チューブに文化の 1 mL</li>
		</ol></li></ol></li> <li>次のようにセルを修正します。4 で 5 分間 15,000 × g で遠心分離によって細胞を収穫 ° C の冷たい 10 mM Tris pH 7.5 100 μ L でペレットを再懸濁し、冷たい 77% エタノール 1 mL を加えます。使用するまで 4 ° c のサンプルを格納します</li>。
	<li>は、次のとおりセルを汚します。上澄み 15 分削除 15,000 × g で遠心分離によって固定セルの 100-300 μ L を収穫し、130 μ でペレットを再懸濁します &#34; DNA 染色液 &#34; (90 μ g/mL ミスラマイシン、20 μ G/ml エチジウム ブロマイド、10 mM MgCl 2、と 10 mM Tris pH 7.5)。暗闇の中、氷の上にサンプルを置くサンプルは 10 分後フローサイトメトリー解析のため準備ができている 
	注: 他の DNA のエチジウム ブロマイドよりも汚れし、ミスラマイシンはまた使用される 30 , 31 をすることができます</li>。
	<li>フローサイトメトリー分析によるセル、相対セル質量と相対的核 DNA 量あたりの起点を特定します。
	<ol><li>実行フローサイトメトリー、 32 を前述のよう。リフ振れと流れの cytometer メーカーを使用して EXP サンプルを実行 &#39; の指示 .ミスラマイシン、エチジウム ブロマイド染色細胞励起波長 395 と 440 nm を使用し、収集 565 上記蛍光 nm。
		<ol><li>携帯番号ヒストグラム対単一パラメーター前方光散乱と 30,000 イベントの最小値のセル番号ヒストグラムと蛍光強度を取得する EXP サンプルを実行相対セル質量と相対の DNA の内容を決定するにはセル信号に対応する</li>。
			<li>使用を前方散乱平均相対を測定するための光単一パラメーターの分布細胞マサチューセッツ州 
			注: 前方散乱光は平均セル質量 20 の尺度</li>。
			<li>平均の DNA を測定する使用蛍光強度単一パラメーター分布コンテンツ 20</li>。
			<li>平均セル質量 20 平均核 DNA 量の比として DNA の濃度を取得します</li>。
		</ol></li> <li>起源細胞 1 個あたりの数を決定します。
		<ol><li>対単一パラメーター蛍光強度を取得する実行リフ振れサンプル セル セル信号に対応する 30,000 のイベントの最小数のヒストグラム</li>。
			<li>それぞれの染色体の数を決定する使用蛍光強度単一パラメーター分布細胞 20</li>。
		</ol></li></ol></li> <li>非同期性指数 (Ai) を計算します。
	<ol><li>計算 Løbner 欧米 ら による記述で、Ai 32、リフ振れサンプルと数式の Ai の蛍光強度の単一のパラメーター分布を使用して (f3 キー + f5 キー + f6 f7) =/(f2 f4 + f8), fx が完全に複製された染色体の x の数と分画細胞。イニシエーションを非同期考慮するとき A &#62; 0.1</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+application+of+transposon-directed+insertion+site+sequencing+to+a+library+of+signature-tagged+mini-Tn5Km2+mutants+of+Escherichia+coli+O157:H7+screened+in+cattle.">Retrospective application of transposon-directed insertion site sequencing to a library of signature-tagged mini-Tn5Km2 mutants of Escherichia coli O157:H7 screened in cattle.</a> J Bacteriol. 193 (7), 1771-1776 (2011).</li><li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn-seq:+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms.">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).</li><li>van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+insertion+sequencing:+a+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms.">Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).</li><li>Jeong, H., Lee, S. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+genome+sequence+of+Escherichia+coli+K-12.">The complete genome sequence of Escherichia coli K-12.</a> Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).</li></ol>

著者は競合する財務持分を有していません。

ここで使用した方法論は、技術遺伝的要素の最適な genomic 位置に関する難しい質問に答えるための活用します。(トランスポゾンを介した) 遺伝的要素のランダムな挿入、お互いの調査遺伝的要素の最適な位置を選択するに対抗するために作ることができるクローンの何千もの迅速かつ簡単のコレクションを有効に (すなわち、適者生存のクローン)。
ここでは、 ...

遺伝的要素の機能は、ゲノムでの位置によって影響を受けます。細菌、これは主に、隣接遺伝子、ローカル DNA のトポロジー、および/または複製関連遺伝子量のトランスクリプションによって干渉から結果します。特に、DNA 複製と偏析の過程の制御は、少なくとも一部では、非コーディング染色体領域で1とこれらの地域の適切な機能のゲノム位置/コンテキストに依存します。エシェリヒア属大腸菌、例としては、妹に必要なdifサイト染色体の解像度2KOPS シーケンス、染色体分離3に必要なデータ、 DARS1とDARS2の地域、(以下; 適切な染色体複製制御に必要な4). ここでDARS2非コード領域の研究に代表されるランダムな再配置、選択、および与えられた遺伝的要素の最適な遺伝的コンテキストの定量を可能にする手法を提案します。
大腸菌DnaA は、イニシエーター蛋白質 DNA 鎖、単一のレプリケーションの起源、oriC、開くとヘリカーゼ DnaB5,6、7の採用担当。AAA+ (すなわち、多様な活動に伴う Atpase) に属する DnaA タンパク質同様高い ATP、ADP をバインドできます、親和性5。DnaAATPのレベルのピーク開始時8、DnaAATPが上、多量体を形成oriC DNA 両面開口部9を起動します。開始後oriC hemimethylated に複製蛋白質の結合を含むメカニズムによって隔離のため再開始のため一時的に使用できなくされるoriC10,11。隔離中に DnaAATPのレベルは、少なくとも 2 つのメカニズムによって減少: DnaA (ライダー)12,13とデータの規制不活化-依存 DnaAATP加水分解 (DDAH)14 ,15。ライダーと DDAH の両方は、DnaAATPの DnaAADPへの変換を促進します。開始の新ラウンドは、前に DnaAADPは特定 DnaA 再アクティブ化シーケンス (邸宅) に DnaAATPに再活性化される: DARS1およびDARS216,17。染色体データ DARS1、および DARS2地域非コーディング、DnaAATPを調節するシャペロンのような方法で行動/DnaAADP相互変換。複製の起源の外に位置するこれらの地域はいずれかの複雑な DnaA のアセンブリを有効に不活化 (データ;14) または活性化 (DARS1およびDARS2;17) DnaA の。セルのDARS2を削除する質量の 2 倍の時間が、非同期レプリケーション開始15,16,18の結果を変更しません。ただし、 DARS2-フィットネスがある欠損細胞豊富な媒体で両方の継続的な成長の競争の間にまたはマウス腸18の植民地化の確立の間にそうしないと同質遺伝子野生型に比べてコスト。これは非同期/起源濃度の些細な変更が細菌フィットネスにマイナスの影響であることを示します。大腸菌染色体の対称性 (すなわち、 2 長さがほぼ等しいレプリケーション腕)19を維持する選択的な圧力があります。データ、 DARS1、およびDARS2領域に同じ相対的な間隔があるoriCすべて大腸菌株シーケンス18染色体サイズの大きな変化にもかかわらず。
ここでは、その機能に最適な染色体の位置の同定の例としてエシェリヒア属大腸菌のDARS2領域を用いてください。DARS2が NKBOR トランスポゾンと結果 NKBOR に挿入された:: その後ランダムに MG1655 のゲノムに挿入DARS2トランスポゾン ΔDARS2。我々 はこのように細胞のコレクションを生成された、それぞれの所有しているDARS2は染色体上の別の場所に配置します。体外競争実験、コレクション内のすべてのセルがプール、ポンドで推定 700 世代のための持続的な成長の間に互いに競ったかを行った。競争実験の結果監視/決定された南しみ、簡単な遺伝子を歩いて、全ゲノム シーケンス (WGS; を使用して図 1)。簡単な遺伝子を踏んで解決エンドポイント クローンは細胞周期のパラメーターを評価するフローサイトメトリーにより特徴づけられた.フローサイトメトリー解析、セル サイズ、DNA コンテンツ、および開始同期が多数のセルを測定できます。フローサイトメトリー、単一セルの流通過提供が、同時に放出される蛍光、DNA 含量の測定を収集フォトマルによって登録されますし、ステンド グラスの DNA を刺激する適切な波長の光線、細胞は DNA のステンド グラスします。前方散乱光は、細胞質量20の指標です。
ここでは提示の in vitro競争の実験、染色体の位置および遺伝的要素のゲノムのコンテキストの重要性に関連する質問に対処するため使用されます。メソッドは、公平な使いやすいです。

<table><tbody><tr><td>Autoclaved Mili-Q water</td><td></td><td>None</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation Cuvettes, 0.1 cm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P41050</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad MicroPulser Electroporation System</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12780029&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar, powder (Lennox L agar)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22700025</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;Plastic Petri Dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S33580A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&amp;nbsp;CryoTubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V7634&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&amp;micro;L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>dATP, [&amp;alpha;-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 &amp;micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU012H250UC</td><td></td></tr><tr><td>DECAprime II DNA Labeling Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1455</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer&amp;nbsp; SF/MBV/03.32</td><td>Pharmacia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hermle Centrifuge&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; SF/MBV/03.46</td><td>Hermle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ole Dich Centrifuge&amp;nbsp; SF/MBV/03.29</td><td>Ole Dich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorftubes 1.5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorftubes 2.0 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2795</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Merck</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>96% Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16368</td><td></td></tr><tr><td>Trizma HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3253</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Ultra Pure</td><td>BRL</td><td>5509UA</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>2445</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease A type II A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5000</td><td></td></tr><tr><td>Sodiumdodecylsulphate (SDS)</td><td>Merck</td><td>13760</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L 6876</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>405-7</td><td></td></tr><tr><td>0.5M Na-EDTA pH 8.0</td><td>BRL</td><td>5575 UA</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10106801001</td><td></td></tr><tr><td>PvuI (10 U/&amp;micro;L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0621</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>DNA Gel Loading Dye (6X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Borate-EDTA buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>433160</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71687</td><td></td></tr><tr><td>Whatman&amp;nbsp;3MM papers</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA3030931</td><td></td></tr><tr><td>SSC Buffer 20&amp;times; Concentrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Hybond-N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN119B</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll&amp;nbsp;400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8016</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin - Fraction V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85040C</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>Carestream Kodak &amp;nbsp;BioMax &amp;nbsp;light film</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z373494</td><td></td></tr><tr><td>GenElute &amp;nbsp;Gel Extraction Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA1111&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GenElute &amp;nbsp;PCR Clean-Up Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA1020</td><td></td></tr><tr><td>T100&amp;nbsp; Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Serva</td><td>34514.01</td><td></td></tr><tr><td>Cephalexin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4895</td><td></td></tr><tr><td>Mithramycin</td><td>Serva</td><td>29803.02</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>Apogee A10 instrument</td><td>Apogee</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determination of the optimal chromosomal location(s) for a dna element in escherichia coli using a novel transposon-mediated approach

与えられた DNA 要素の最適な染色体位置/フィットネス選択続いてトランスポゾンを介したランダムな挿入によって定められました。細菌、遺伝的要素の機能に関する遺伝的コンテキストの影響は評価することは困難することができます。近隣の遺伝子や複製関連遺伝子投与量から転写干渉位相効果を含むいくつかのメカニズムは、与えられた遺伝的要素の機能に影響があります。ここでは、大腸菌と単純な成長競争を使用して最も有利な場所実験選択の染色体への DNA 要素のランダムな統合を可能にする手法について述べる。メソッドは、ランダムな挿入、結合で適者生存のクローンの選択成長の利点は、実験のニーズに簡単に調整されているプロシージャのよく説明トランスポゾン ベース システムの利点を受け取ります。適者生存のクローンの性質は、複雑な多クローン集団の全ゲノム シーケンスまたは選択されたクローンの迅速同定のため歩きやすい遺伝子によって決定できます。ここでは、 DARS2、エシェリヒア属大腸菌の染色体複製開始を制御する DNA の非コード領域は例として使用されました。複製関連遺伝子の用量の影響を受けるDARS2の機能は知られています。近いDARS2をさらにアクティブになる、DNA の複製の起源に取得します。DARS2がDARS2の染色体に挿入されたランダムに-ひずみを削除します。個々 の挿入を含む結果のクローンはプールされ、何百世代のため互いに競った。最後に、適者生存のクローンは、特徴し、 DARS2元のDARS2の場所の近くに挿入が含まれて発見されました。

南しみはDARS2がトランスポゾン ライブラリでは染色体の中でランダムに配布されたことを確認する行われていた (t = 0) と適者生存のクローンを時間をかけて永続化でしょう。南しみは初期トランスポゾン プールから抽出した DNA を行った (t = 0) と (図 3) の競争の 700 世代からすべての推定 100。ここでは、それぞれの時点から全細胞 DNA は?...

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Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

ここでは、非コーディング DNA 要素のトランスポゾンを介したランダム挿入の力は、その最適な染色体の位置の解決に使用されました。

新規トランスポゾンを介したアプローチを使用してエシェリヒア属大腸菌DNA 要素の最適な染色体の場所の決定

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

7.5K ビュー.  University of Copenhagen. ここでは、非コーディング DNA 要素のトランスポゾンを介したランダム挿入の力は、その最適な染色体の位置の解決に使用されました。

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Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

細菌接合に関与する転写タンパク質の配列特異的分析のための接合交配アッセイ

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

遺伝学

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

サイト固有の細菌染色体工学：ΦC31インテグラーゼを介したカセット取引所（IMCE）

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

生物工学

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons of conjugation frequency under different conditions are required to understand how the conjugative element spreads in nature. However, conventional methods for comparing conjugation frequency are not appropriate for in-depth comparisons because of the high background caused by the occurrence of additional conjugation events on the selective plate. We successfully reduced the background by introducing a most probable number (MPN) method and a higher concentration of antibiotics to prevent further conjugation in selective liquid medium. In addition, we developed a protocol for estimating the probability of how often donor cells initiate conjugation by sorting single donor cells into recipient pools by fluorescence-activated cell sorting (FACS). Using two plasmids, pBP136 and pCAR1, the differences in conjugation frequency in Pseudomonas putida cells could be detected in liquid medium at different stirring rates. The frequencies of conjugation initiation were higher for pBP136 than for pCAR1. Using these results, we can better understand the conjugation features in these two plasmids.

With an aim to understand the behaviors of various bacterial conjugative DNA elements under different conditions, we describe a protocol for detecting differences in conjugation frequency, with high resolution, to estimate how efficiently the donor bacterium initiates conjugation.

細菌の活用頻度の高解像度の比較

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol for transferring gene deletion mutations from one Escherichia coli strain to another by using generalized transduction with the bacteriophage P1. This method requires that the mutation be selectable (e.g., based on gene disruptions using antibiotic cassette insertions). Such antibiotic cassettes can be mobilized from a donor strain and introduced into a recipient strain of interest to quickly and easily generate a gene deletion mutant. The antibiotic cassette can be designed to include flippase recognition sites that allow the excision of the cassette by a site-specific recombinase to produce a clean knock-out with only a ~100-base-pair-long scar sequence in the genome. We demonstrate the protocol by knocking out the tamA gene encoding an assembly factor involved in autotransporter biogenesis and test the effect of this knock-out on the biogenesis and function of two trimeric autotransporter adhesins. Though gene deletion by P1 transduction has its limitations, the ease and speed of its implementation make it an attractive alternative to other methods of gene deletion.

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Here we present a protocol for the use of pre-existing antibiotic resistance-cassette deletion constructs as a basis for making deletion mutants in other E. coli strains. Such deletion mutations can be mobilized and inserted into the corresponding locus of a recipient strain using P1 bacteriophage transduction.

物品税課税対象の抗生物質耐性カセット P1 伝達による大腸菌の遺伝子の削除を生産

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

密なトランスポゾン挿入ライブラリを使用して細菌活用腸内細菌系統など、大腸菌や赤痢菌の作成

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

免疫・感染学

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

生物学

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can be generated using a transposome. The commercially available, Tn5-derived transposome used in this protocol consists of a linear segment of DNA containing an R6K&#947; replication origin, a gene for kanamycin resistance and two mosaic sequence ends, which serve as transposase binding sites. The transposome, provided as a DNA/transposase protein complex, is introduced by electroporation into the prototrophic strain, Enterobacter sp. YSU, and randomly incorporates itself into this host&#8217;s genome. Transformants are replica plated onto Luria-Bertani agar plates containing kanamycin, (LB-kan) and onto M-9 medium agar plates containing kanamycin (M-9-kan). The transformants that grow on LB-kan plates but not on M-9-kan plates are considered to be auxotrophs. Purified genomic DNA from an auxotroph is partially digested, ligated and transformed into a pir+ Escherichia coli (E. coli) strain. The R6K&#947; replication origin allows the plasmid to replicate in pir+ E. coli strains, and the kanamycin resistance marker allows for plasmid selection. Each transformant possesses a new plasmid containing the transposon flanked by the interrupted chromosomal region. Sanger sequencing and the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggest a putative identity of the interrupted gene. There are three advantages to using this transposome mutagenesis strategy. First, it does not rely on the expression of a transposase gene by the host. Second, the transposome is introduced into the target host by electroporation, rather than by conjugation or by transduction and therefore is more efficient. Third, the R6K&#947; replication origin makes it easy to identify the mutated gene which is partially recovered in a recombinant plasmid. This technique can be used to investigate the genes involved in other characteristics of Enterobacter sp. YSU or of a wider variety of bacterial strains.

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU grows in glucose minimal salts medium. Auxotrophs are generated by transforming it with a transposome which randomly inserts itself into the host genome. Mutants are found by replica plating from complex medium to minimal medium. Interrupted genes are identified by gene rescue and sequencing.

の世代<em&gt;エンテロバクター</em&gt;エスピー。 YSU要求株にはトランスポゾン突然変異誘発を用いて

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways that contribute to bacterial fitness under a wide range of environmental conditions. Tn-seq applications are extensive and have not only enabled examination of genotype-phenotype relationships at an organism level but also at the population, community and systems levels. Gram-negative bacteria are highly associated with antimicrobial resistance phenotypes, which has increased incidents of antibiotic treatment failure. Antimicrobial resistance is defined as bacterial growth in the presence of otherwise lethal antibiotics. The &#8220;last-line&#8221; antimicrobial colistin is used to treat Gram-negative bacterial infections. However, several Gram-negative pathogens, including Acinetobacter baumannii can develop colistin resistance through a range of molecular mechanisms, some of which were characterized using Tn-seq. Furthermore, signal transduction pathways that regulate colistin resistance vary within Gram-negative bacteria. Here we propose an efficient method of transposon mutagenesis in A. baumannii that streamlines generation of a saturating transposon insertion library and amplicon library construction by eliminating the need for restriction enzymes, adapter ligation, and gel purification. The methods described herein will enable in-depth analysis of molecular determinants that contribute to A. baumannii fitness when challenged with colistin. The protocol is also applicable to other Gram-negative ESKAPE pathogens, which are primarily associated with drug resistant hospital-acquired infections.

We describe a method to generate saturating transposon mutant libraries in Gram-negative bacteria and subsequent preparation of DNA amplicon libraries for high-throughput sequencing. As an example, we focus on the ESKAPE pathogen, Acinetobacter baumannii, but this protocol is amenable to a wide range of Gram-negative organisms.

高スループットシーケンシングのためのグラム陰性細菌におけるトランスポゾン挿入ライブラリの生成

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways ...

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological processes. Advances in molecular microbiology have seen the emergence of diverse mutagenesis techniques for the manipulation of genes. Among them, transposon-insertion sequencing (Tn-seq) is a valuable tool to simultaneously assess the functionality of many candidate genes in an untargeted way. The technique has been key to identify&#160;molecular mechanisms for the colonization of eukaryotic hosts in several pathogenic microbes and a few beneficial symbionts.
Here, Tn-seq is established as a method to identify colonization factors in a mutualistic Burkholderia gladioli symbiont of the beetle Lagria villosa. By conjugation, Tn5 transposon-mediated insertion of an antibiotic-resistance cassette is&#160;carried out at random genomic locations in B. gladioli. To identify the effect of gene disruptions on the ability of the bacteria to colonize the beetle host, the generated B. gladioli transposon-mutant library is inoculated on the beetle eggs, while a control is grown in vitro in a liquid culture medium. After allowing sufficient time for colonization, DNA is extracted from the in vivo and in vitro grown libraries. Following a DNA library preparation protocol, the DNA samples are prepared for transposon-insertion sequencing. DNA fragments that contain the transposon-insert edge and flanking bacterial DNA are selected, and the mutation sites are determined by sequencing away from the transposon-insert edge. Finally, by analyzing and comparing the frequencies of each mutant between the in vivo and in vitro libraries, the importance of specific symbiont genes during beetle colonization can be predicted.

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

This is an adapted method for identifying candidate insect colonization factors in a Burkholderia beneficial symbiont. The beetle host is infected with a random mutant library generated via transposon mutagenesis, and library complexity after colonization is compared to a control grown in vitro.

ラグリア・ビロサ・カブトムシのバークホルデリア・グラディオリ・シンビエントにおける細菌コロニー形成因子を解明するためのツールとしてのトランスポゾン挿入シーケンシング

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological ...

Real-Time Quantification of the Effects of IS200/IS605 Family-Associated TnpB on Transposon Activity

Here, a protocol is outlined to perform live, real-time imaging of transposable element activity in live bacterial cells using a suite of fluorescent reporters coupled to transposition. In particular, it demonstrates how real-time imaging can be used to assess the effects of the accessory protein TnpB on the activity of the transposable element IS608, a member of the IS200/IS605 family of transposable elements. The IS200/IS605 family of transposable elements are abundant mobile elements connected with one of the most innumerable genes found in nature, tnpB. Sequence homologies propose that the TnpB protein may be an evolutionary precursor to CRISPR/Cas9 systems. Additionally, TnpB has received renewed interest, having been shown to act as a Cas-like RNA-guided DNA endonuclease. The effects of TnpB on the transposition rates of IS608 are quantified, and it is demonstrated that the expression of TnpB of IS608 results in ~5x increased transposon activity compared to cells lacking TnpB expression.

A protocol is outlined to perform live real-time imaging to quantify how the accessory protein TnpB affects the dynamics of transposition in individual live Escherichia coli cells.

トランスポゾン活性に対するIS200/IS605ファミリー関連TnpBの影響のリアルタイム定量

Here, a protocol is outlined to perform live, real-time imaging of transposable element activity in live bacterial cells using a suite of fluorescent ...