Name: assembly and purification of prototype foamy virus intasomes
Uploaded: 2018-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
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1. 熱処理 vDNA の
<ol><li>結合 1 X 10 のバッファー (10 X 10 株式: 100 mM トリス-HCl、pH 8.0、1 M NaCl 10 mM EDTA)、10 μ M 10 μ M とオリゴ 1 (5' 3' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG、100 μ M 在庫) オリゴ 2 (5' 3' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA, 100 μ M 在庫) 1.5 mL の最終巻で.60 0.2 mL ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) チューブに分注 25 μ L。 注: アプリケーションによっては、オリゴマーは基本 13 1 オリゴの 5' 端から内部アミノ酸 T として fluorophores が付いてまたは 5' 端または Oligo 2 のタグに修正されるかもしれません。変更したオリゴマーは、アニールする前に、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) で精製する必要があります。我々 は、10 倍のインタソーム アセンブリ効率が低下 5' 末端 Cy3 や Cy5 蛍光標識オリゴ 2 を発見しました。内部の蛍光ラベリング組立効率を削減していません。</li>
	<li>アニール時間と温度、たちを使用して: 1 サイクル 94.0 ° C、3 分で 99 サイクル (94.0 ° C 1 分、93.6 ° C 1 分) サイクルあたり 0.8 ° C によって両方の温度を減少させる (最後のサイクルは 14.8 ° C 1 分、14.4 ° C 1 分)、4.0 ° C で保存します。</li>
	<li>すべての 60 のチューブからアニーリング反応を組み合わせます。2 0.5 mL 3 kDa 分子量カットオフ (MWCO) 超遠心フィルター濃度単位を 500 μ L をロードします。室温 (RT) で 10 分間 14,000 × g で遠心機で遠心分離による焼鈍 vDNA を集中します。 注: 未透過ボリュームは各濃度単位 〜 50 μ L をする必要があります。</li>
	<li>流れを破棄します。各フィルター ユニットに残りの焼なまし材 vDNA の 250 μ L を追加します。スピンを繰り返し、流れを破棄します。450 μ L TE の 3 回を洗浄することによりバッファーの TE バッファー (10 mM トリス-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA) に交換。</li>
	<li>フィルター ユニットと右で 2 分間 1,000 x g でスピンを反転します。各フィルター ユニットの最終未透過ボリュームは、〜 50 μ L. retentates と 1.5 mL スクリュー キャップ チューブへの転送を組み合わせるべき。</li>
	<li>VDNA の 260 nm の紫外線 (UV) の吸光度を測定します。この値を使用して、最終的なモル DNA 濃度を計算します。この vDNA の吸光係数 (ε260) が 622,803 cm-1 M-1で、その分子量は-20 ° C で 23,972 の da ストア。</li>
</ol>2. インタソーム組み立て
<ol><li>可能であれば、小さな部屋に可変サーモスタットとインタソーム組み立てを実行します。約 18-22 ° C にサーモスタットを調整します。 注: 我々 の経験で 4 ° C でのインタソーム組み立ては非効率的です。</li>
	<li>撹拌プレート上の攪拌棒を 2 L のビーカーに透析バッファー (20 mM ビス トリス プロパン、pH 7.5、200 mM の NaCl、2 mM ジチオトレイトール (DTT)、25 μ M ZnCl2) の 1 の L を準備します。少なくとも 6 時間 18-22 ° C の部屋でバッファーを平衡します。</li>
	<li>Intasomes を組み立て、50 mM ビス トリス プロパン、pH 7.5、500 mM の NaCl、120 μ M PFV で、150 μ L の総ボリュームで 50 μ M の vDNA を組み合わせます。 注: PFV のヌクレアーゼ活性7、8を汚染の無料する必要があります。PFV の濃度が 200 μ L に最終巻を増やすことは可能だしは、150 μ L のボリュームで 120 μ M に合わせて希釈も。この手順の重要な要因は、vDNA (2.4: 1,) へのモル比を維持するためにクロマトグラフィーの中に可視化する十分なコンプレックスを持っています。</li>
	<li>10 mm 6-8 kDa MWCO 透析チューブの二重蒸留水 (ddH2O)、または最高の純度水を持つクリップ 〜 10 センチの部分をきれいに。チューブの一方の端をクリップします。 注: 透析チューブは、ラボのスペースから可能な汚染を防ぐために慎重に取り扱う必要があります。</li>
	<li>15 mL の透析チューブ洗浄バッファー (50 mM ビス トリス プロパン、pH 7.5、500 mM の NaCl) を確認します。1-2 の mL 洗浄バッファーで 3 回透析チューブの中をすすいでください。ピペット チップ薄膜ゲルと可能な限り洗浄バッファーの多くを削除します。</li>
	<li>必要に応じて、薄いゲル読み込みヒントは管の端に達する可能性がありますので、透析チューブをカットするのにきれいなかみそり刃やメスを使用します。</li>
	<li>ピペット チップを読み込む薄いゲルと透析チューブ ステップ 2.3 からインタソーム組み立てを転送します。チューブ内に導入された空気の量を最小限に抑え、透析チューブの開放端をクリップします。透析バッファーにチューブを置きます。</li>
	<li>Dialyze チューブの回転が渦ではない穏やかな攪拌と一晩 (16-20 h)。透析の管が水中に、モバイルであることを確認します。約 1 時間後、チューブ内表示されている沈殿物を観察します。 注: Cy3 や Cy5 蛍光ラベル vDNA で沈殿物はより明白です。これは分類される端と内部でラベル付けされた蛍光 vDNA の両方に当てはまります。</li>
</ol>3. インタソーム可溶化
<ol><li>準備 2 つの広いきれいな表面に新しい剃刀やメス刃を 200 μ L チップの端から 2-4 ミリメートルを削除することによってピペット チップを産んだ。 注: ヒントは、3.3、3.5 の手順で使用されます。</li>
	<li>透析チューブを透析バッファーから削除します。クリップ近くチューブの端に残っている透析バッファーとインタソーム サンプルの希釈を防ぐために、余分な透析のバッファーを削除するのに小さなピペット チップとマイクロ ピペットを使用します。透析チューブの一方の端からクリップを削除します。</li>
	<li>使用広いステップ 3.1 氷の上 1.5 mL チューブに透析チューブの中の沈殿物を含むサンプルを転送するからピペット チップを産んだ。回収素材の容量に注意してください。総容積は通常 ~ 140 μ L です。</li>
	<li>沈殿物のサンプルは、200 mM の NaCl;在庫 5 M NaCl 溶液の適切なボリュームを追加して 320 mM の NaCl の最終的な集中に塩を増やします。たとえば、150 μ L のサンプル、追加 3.9 μ L 5 M NaCl と 1.1 μ L ddH2O 155 μ。 転送氷バケツの最終巻の 4 ° c の冷たい部屋にサンプル。</li>
	<li>使用広いステップ再懸濁します、ピペッティングにより沈殿物を可溶化し 3.1 からピペット チップを産んだ。少なくとも 1 h. の沈殿物のほとんどは、解決策に行く必要があります観察に 20 分ごとを繰り返します。 注: 沈殿物を再懸濁しますにピペッティング停止できる沈殿物が時間ポイント間もはや著しく低下が明らかであるとき。VDNA ラベルはありませんかと内部のラベルは、沈殿物は目視検査に基づく ~ 90% 削減します。沈殿物はのみ 〜 20% 減の vDNA と分類される Cy5 端の場合vDNA と分類される蛍光体の端を沈殿物のほとんどが可溶化しません。効果的に可溶化沈殿物の量は可変して経験的に決定する必要があります。</li>
</ol>4. インタソーム浄化
<ol><li>250 mL サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) の連続したバッファー (20 mM ビス トリス プロパン、pH 7.5、320 mM の NaCl、10% グリセロール) を準備します。滅菌フィルター バッファー 0.2 μ m フィルター ユニット、4 ° C で保存します。 注: すべての精製工程は 4 ° C の冷たい部屋で実行されます。</li>
	<li>架橋アガロース SEC カラムの平衡 (直径 = 10 mm 長さ = 300 mm; ボリュームをベッド = 24 mL; サンプル ボリューム = 25 500 μ L; 最大圧力 = 1.5 MPa; 排除限界分子量 = 4 × 107 Da; 分離分子量 5 および 5,000 kDa 間マットの表を参照してください。資料) 秒 0.4 mL/min の流量で連続したバッファーを持つ。 注: この浄化は Superose 12 10/300 GL など Superose 6 増加、44 kDa から 300 kDa を効果的に分離することができる場合、異なるサイズ排除カラムに適応があります。Superose 12 10/300 GL が低い解像度ピークのより多くの重複に 。逆に、Superose 6 増加より高い解像度を持つし、良い分離を提供します。</li>
	<li>任意の残りの沈殿物をペレットへの 4 ° C で 10 分間の 14,000 x g でおよび microfuge のインタソーム サンプルを遠心します。上清を慎重に取り外します。上清 200 μ L 注入ループ (〜 200 μ L を保持できるチューブ) をロードします。秒の列にサンプルを適用します。 注: より小さい負荷ボリュームで SEC のより高い解像度は、します。</li>
	<li>秒を実行するバッファーし、270 μ L の 95 分画を収集 25 mL で溶出 SEC クロマト グラムで 3 A280/A260ピーク (図 1) が表示されることを確認します。 注: 最初の集計 (~9.0 - 11.5 mL 溶出)、続いて PFV テトラマー インタソーム ピーク (~12.0 - 14.75 mL 溶出) と無料 vDNA ピーク (~15.0 - 18.0 mL) PFV のモノマーをする必要があります。</li>
</ol>5. 統合鎖伝達アッセイ、分数の選択、およびストレージ
<ol><li>各インタソーム ピーク画分および 50 の 2 μ L を組み合わせて ng 3 kb スーパー プラスミド DNA (ストック濃度は 50 ng/μ L) 最終的な反応量 15 μ L の反応バッファー (10 mM ビス トリス プロパン、pH 7.5、110 mM の NaCl、5 mM MgSO4, 4 μ M ZnCl2, 10 mM DTT) に。5 分の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>ない追加 PFV インタソームをネガティブ コントロールが含まれます。0.75 μ L プロティナーゼ K との反応 (20 mg/mL 原液) および 0.75 μ L SDS を停止 (10% 原液)。1 h. ストア サンプル後の分析のための-20 ° C で必要に応じての 55 ° C で孵化させなさい。 注: このアッセイは、統合アクティビティの定性的な評価です。この試金の前に、各画分のインタソーム モル濃度は決定されていません。統合鎖伝達アッセイに含まれる分数を格納できる統合まで (夜の記憶を含む) 氷の上活動を確認し、選択した分数は避けよう。ここで我々 は pMP2、pUC19 デリバティブ9を使用します。我々 はまた正常に 5.4 kb のプラスミド pcDNA 3.1 を使用しています。解決できるプラスミド リラックス円、直線とスーパー フォームは、統合のためターゲットとして使用する可能性があります。</li>
	<li>0.1 G/ml エチジウム ブロマイド (EtBr、10 mg/mL 原液)10で 1 × TAE バッファー (40 mM トリス酢酸、1 mM EDTA) の量 (w/v) agarose のゲルあたり 120 mL の 1% の重量を準備します。アガロース溶液を溶かすし、15 cm × 10 cm ゲル鋳造トレイにそれを注ぐ。5 mm 幅、0.75 mm 厚の井戸と 15 も櫛を挿入します。 注: 狭い井戸は 1.5 mm 厚の井戸と比較してより良いバンド解像度を得られます。</li>
	<li>常温で固化するゲルを許可します。0.1 μ g/ml の EtBr 1 × TAE でゲルを浸します。</li>
	<li>5.2 から各統合の反作用に 3 μ L の 50% のグリセロールを追加します。ゲルに全体の反作用ボリュームをロードします。1 μ L のサンプル; のいずれかの側の車線に 10 kb DNA サイズ マーカー (150 ng/μ L ストック濃度) を読み込むつまり、DNA サイズ マーカーはサンプル レーンを逃げする必要があります。</li>
	<li>外側の車線、6 μ L オレンジ G 染料 (0.25% オレンジ G、30% のグリセロール) をロードします。定電圧、周囲温度 1 h またはオレンジ G 染料前ゲルの端に到達するまでに 10 V/cm (100 V) でゲルを実行します。</li>
	<li>すぐに EtBr (532 nm 励起、610 nm 発光フィルター) を検出する蛍光スキャナーの agarose のゲルをイメージします。適切な fluorophore 設定もイメージの蛍光ラベル vDNAs を使用した場合 注: たとえば、cy5 の組合せを検出する分類される DNA、633 nm の励起と 670 nm 発光フィルターを使用してイメージ。~ 3 kb で協調統合製品 (CI、線形 DNA) サイズに該当する実行、未反応スーパー プラスミド (SC) を高速化 (~ 2 kb) を実行し、半サイト統合製品 (HSI、リラックスした環状 DNA) 遅い (~3.5 kb) を実行する必要があります。〜 40 で未反応の vDNA サイズに該当する実行 bp。</li>
	<li>イメージング ソフトウェア7各レーンのバンドを定量化します。DNA は、CI、HSI、または SC; 各レーンの割合を計算します。vDNA は、この計算には含まれません。 注: 統合の効率、またはリニア製品に変換 SC の分数を協調統合製品 (CI) のピクセル ボリューム 3 つのバンド (HSI + CI + SC) の総画素量で割ることによって求めた。Intasomes は蛍光ラベルである場合、HSI と CI の製品は蛍光を用いた測定も可能性があります。</li>
	<li>最も協調された統合アクティビティを持っている分数を選択します。 注: 我々 の経験で、統合協調ピークは 4 量体 PFV intasomes として識別された蛋白質のピークと一致します。これらの画分のそれぞれの A280を測定し、最終のインタソーム濃度を計算します。ここで説明した 2 つの vDNAs を持つ野生型 PFV での四量体の ε280が 908,339 cm-1M-1で、分子量は 225.5 kDa。濃度は、SEC クロマト グラム ピークとストランド転送アッセイの同じパターンに従う必要があります。</li>
	<li>5 μ 因数で各分画を配布し、スナップ液体窒素で凍結します。因数-80 ° C で保存します。ストレージの端数は通常 200-600 nM の間です。</li>
</ol>

<ol>
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N., Hare, S., Cherepanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+retroviral+integration+from+X-ray+structures+of+its+key+intermediates.">The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates.</a> Nature. 468 (7321), 326-329 (2010).</li><li>Maskell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+retroviral+integration+into+nucleosomes.">Structural basis for retroviral integration into nucleosomes.</a> Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

レトロ ウイルスをポリコームタンパク統合を実行し、ウイルスのライフ サイクルを続行するウイルスのゲノム DNA との複合体を形成します。テトラマー、octamers、または可能性が高いため多量11,12,13,14インタソームあたり単量体の数があります。PFV intasomes は、組換えウイルスのゲノム DNA を模した二本鎖 DNA オリゴマーとの四量体の両端3.されてこれらの intasomes は、構造と動的研究3,5,13,14で使用されています。
PFV intasomes のアセンブリは、低い塩分濃度に比較的高い塩濃度バッファーから透析中に発生します。PFV intasomes を含む沈殿物の層でこの結果します。塩濃度の増加によって可溶性に、intasomes。PFV では最大 225 μ M5濃度で単量体が示されています。複合体はの単量体から分離されたし、無料の SEC の vDNA6秒バッファーにグリセロールを含める PFV intasomes の浄化を変更しました。グリセロールのアクティビティ (図 4) を失うことがなく将来使用するため凍結 PFV intasomes できます。
このプロトコルのいくつかの主要な機能があります。蛋白質の浄化は、しばしば低温で実行されます、我々 発見した経験的 PFV のインタソーム組み立ては 4 ° C で効率的でないこと。代わりに、アセンブリの透析は、18-22 ° C の範囲で発生。また、組換え細菌ヌクレアーゼ7,8の汚染は無料です PFV を使用することが重要です。最後に、vDNA での比率はアセンブリの重要な要因です。蛋白質の集中の開始ここで推奨より低いが、vDNA の濃度は比例して低下する必要があります。低濃度で PFV intasomes をアセンブルすることが可能ですが、複合体は高秒分離検出のための十分な集中をする必要があります。
このメソッドは、ラベルまたはラベル付き vDNA と PFV intasomes の使用可能性があります。我々 は、蛍光やビオチン6vDNA が効率的にラベル付けされることを発見しました。他の小さい分子のラベルも可能です。Cy5 の fluorophore の場合は vDNA と分類されるその端 10 倍減少ピーク濃度との組み立てられた intasomes の収量の減少を見つけます。ただし、内部的に Cy5 標識 vDNA ラベルのない vDNA に同等の収量があります。このアセンブリのメソッドは、ポイント突然変異または PFV の4のトランケーション変異にも使えます。による臨床的に関連するターゲットに HIV-1 の伝達阻害剤 (所) 薬のストランド PFV が阻害されるので、これら PFV intasomes を使用して INSTIs3の機構を解明することが可能。さらに、中の HIV-1 の所耐性変異は、組み換え PFV intasomes と薬剤耐性の研究を許可する PFV で保存されている残基で発生します。

宿主のゲノムにウイルスのゲノムの統合は、すべてのレトロ ウイルス1のライフ サイクルの必須のステップです。ウイルス酵素インテグラーゼ (IN は) ホスト DNA にウイルスのゲノム DNA の両端の共有結合に参加する触媒作用を及ぼします。細胞感染の間の統合を仲介事前統合複合体の一部です。組み換え体の二重鎖 DNA オリゴマー ウイルス DNA の両端を模倣した複合体2の in vitroターゲット DNA の統合を実行できます。一般的な統合アッセイの in vitro DNA ターゲットとしてスーパー プラスミドを利用します。プラスミッドを両方ウイルス DNA オリゴマー (vDNA) の統合は、リニア製品の結果し、協調統合 (図 2 a) と呼ばれています。統合分析、体外したリラックスしたサークルの結果ターゲット プラスミドに参加して 1 つだけ vDNA と製品をもたらすことがあります。この半サイト統合製品は、 in vitroアッセイのアーチファクトのように見えます。
組換えと vDNA を生体外の統合、実行可能性がありますが、単量体では関連する可視化に覆い隠さときはダイナミクスの研究や統合複合体の構造のための理想的な試薬。精製された統合の複合体、または「intasomes」が動的 1 分子解析または構造研究のため必要です。PFV のと vDNAs が組み立てられる透析によって比較的高い塩濃度バッファーから低い塩分濃度3,4。透析、沈殿物中のフォーム。この沈殿物が透析から削除され、塩濃度が増加します。高い塩濃度は可溶性沈殿物含む PFV intasomes です。サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) では、intasomes は、精製します。組換えプロトタイプ フォーミー ウイルス (PFV) では最大 225 μ M5濃度でソリューションの単量体として存在する示されています。秒分別は効果的に (44.4 kDa) の単量体 PFV と無料 vDNA (24.0 kDa) から PFV のと 2 つの vDNAs の四量体が含まれています、PFV intasomes (225.5 kDa) を分離します。PFV intasomes は凍結する可能性があり、-80 ° C でのストレージの少なくとも 6 ヶ月間統合アクティビティを保持します。
組換え PFV intasomes は、アミノ酸置換、トランケーション変異またはフルオロまたはビオチン4,6の付いた vDNAs を含むように修正されるかもしれません。精製 PFV intasomes は容易に体外DNA プラスミドのスーパー ターゲットへの統合を実行します。Intasomes で一括生化学的統合アッセイは、阻害剤、または他の化学添加物の突然変異での効果をテストします。ビオチン化 intasomes は、核酸やタンパク質との親和性を調査する使用できます。PFV intasomes は、vDNA の両端またはターゲット上のインタソーム検索を視覚化する全反射蛍光の接合間の時間を測定する磁気ピンセットによる単一分子顕微鏡分析を可能周囲温度機能DNA6。また、PFV intasomes が最初に構造的に特徴付けられる大幅レトロ ウイルス統合3のフィールドに影響を与えます。

<table><tbody><tr><td>DNA Oligomers</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>Custom DNA Oligos</td></tr><tr><td>Tris Ultra Pure</td><td>Gojira Fine Chemicals</td><td>UTS1003</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z677094-24EA</td><td>3 kDa MWCO</td></tr><tr><td>DTT</td><td>P212121</td><td>SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS propane,&gt;=99.0% (titration)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6755-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>Gel-loading tips, 1 - 200 &amp;mu;L</td><td>Corning</td><td>CLS4853-400EA</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &gt; 250mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis tubing clips</td><td>Spectrum Labs</td><td>132734</td><td></td></tr><tr><td>6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing</td><td>Spectrum Medical</td><td>132645</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17517201</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Res Standard Agarose</td><td>AGTC Bioproducts</td><td>AG500D1</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Fisher Scientific</td><td>0-267</td><td></td></tr><tr><td>Hyladder 10kb, 500 lanes</td><td>Denville Scientific</td><td>CB4225-4</td><td></td></tr></tbody></table>

assembly and purification of prototype foamy virus intasomes

A 宿主のゲノムにウイルスのゲノムの統合機能とレトロ ウイルスのライフ サイクルの必要なステップを定義することです。すべてのレトロ ウイルスは、ホスト DNA ストランド転送として知られているウイルスの共有結合を触媒するインテグラーゼ (IN) 酵素をエンコードします。統合では、組換えレトロ ウイルスの inの in vitroモデル化されるとウイルスのゲノムの端を模倣した DNA オリゴマーを可能性があります。密接に発生する生体内で、統合統合反応を要約するためには、削減塩濃度バッファーで透析による組換えと合成オリゴマーから錯体をまとめます。インタソームと呼ばれる、複雑な統合は、サイズ排除クロマトグラフィーによる精製があります。プロトタイプ フォーミー ウイルス (PFV) 場合、インタソームは 4 量体で、2 つの DNA オリゴマーと容易に単量体と無料オリゴマー DNA から分離されています。PFV intasomes の統合効率は、さまざまなダイナミクスを理解する実験条件やレトロ ウイルスの統合の仕組みの下で試金することがあります。

PFV intasomes は組換えのおよび vDNA から組み立てられて。組立後 intasomes は秒 (図 1) で精製しました。各分画の統合アクティビティを測定する、スーパー DNA ターゲットとアガロースゲル電気泳動 (図 2) とします。このゲルは EtBr (および蛍光、蛍光ラベル vDNA が使用されている場合) を検出する蛍光スキャナーでイメージしています。画像解析ソフトを使用して、統合効率 (図 3) を計算するバンド ピクセル ボリュームを使用できます。分数の最高の統合効率は、冷凍保存用スナップです。冷凍の分数は、組み立てられた intasomes の長期的な保存を可能にする統合アクティビティ (図 4) を保持します。任意のラベルの分子と、vDNA 内の位置のインタソーム組立効率 (図 5) があります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57453/57453fig1.jpg"> 図 1: サイズ排除クロマト グラム。PFV のインタソーム組み立ては、アガロース秒で分離されました。この列は集計 (1) vDNA (3) 単量体 PFV のと 2 つの vDNA (2) PFV の 4 量体で構成される PFV インタソームを分離することができます。この例では、650 nm 励起によって検出された内部 Cy5 蛍光ラベルを持つ vDNA を含まれています。Y 軸は光学濃度 (OD) ミリ吸光度の単位 (マウ) を示します。<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57453/57453fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57453/57453fig2.jpg"> 図 2: 秒の分数の統合分析します。(A) 統合鎖転移反応の模式図。左、PFV のインタソームの四量体 (青い円) で、2 vDNA (太い黒のライン)、ターゲット プラスミド (細い黒線) などの漫画。ターゲット プラスミドの超らせん (SC) は描画されません。センターは、1 つの vDNA は、共有ターゲット プラスミドに結合されているとき半分サイト統合 (HSI) 製品の漫画。結合反応は、ニックネームを紹介し、超らせんを緩和します。右、2 つ vDNAs がターゲット DNA に結合された共同統合 (CI) 製品の漫画。この統合製品の両端に vDNAs の線形 DNA の結果します。(B) スーパー プラスミド DNA は、各秒の分数 #49 55 に追加されました。次の孵化、統合反応 deproteinated、EtBr を含む 1% アガロースゲル電気泳動によって分離します。否定的な制御はないタンパク質 (T) が付いているプラスミッド DNA だった。DNA サイズ マーカーが kb 単位で表示されます。スーパー プラスミド (SC) 協調統合製品 (CI)、半サイト統合製品 (HSI)、および vDNA が表示されます。(C) agarose のゲルは、Cy5 の存在をスキャンしました。VDNA、CI と HSI だけ製品が表示されます。<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57453/57453fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57453/57453fig3v2.jpg"> 図 3: 統合アッセイの定量します。図 2の agarose のゲルは、スキャンされ、EtBr (A) と (B) Cy5 の存在を数値化します。(A) EtBr 計算 HSI、CI と SC のバンド ピクセル ボリュームは、ゲルの分析ソフトウェアを使用して得られました。統合効率はだった共同統合製品 (CI) のピクセル ボリュームすべての 3 つのバンド (HSI + CI + SC) の総画素量で割ることによって計算されます。たとえば、EtBr のピクセル値チャンネル #49 分画のバンドのため: 110565.2 SC、25152.56 CI と 6313.04 HSI。分数 #49 の DNA ピクセル値の合計は、142030.8、これらの値の合計です。統合効率は、25152.56 総 DNA 値 0.18 に等しい 142030.8 で割った値の CI ピクセル ボリュームです。(B) Cy5 CI バンド ピクセル ボリュームは任意の単位としてグラフ化されます。分数の統合活動のピークは、個別に検体と冷凍です。この例では、分数 #50 53 が選ばれました。因数は、液体窒素で凍結し、将来の使用に備えて-80 ° C で保存されているスナップインです。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57453/57453fig4.jpg"> 図 4: インタソーム活動凍結の影響。1 秒率の半分は 1 時間-80 ° C で保存して氷の上ゆっくりと解凍し、液体窒素で凍結フラッシュだった。秒画分の残りの半分は冷蔵室で氷で保たれる上半期でした凍結され、解凍中。Intasomes (-) なしの活動を調べたと (+) 凍結/融解。統合効率は、前述のように測定しました。(A) EtBr 統合反応生成物の agarose のゲルを染色します。スーパー プラスミド (SC) 協調統合製品 (CI)、半サイト統合製品 (HSI) と未反応の vDNA を示します。DNA サイズ マーカーが kb 単位で表示されます。(B) EtBr イメージから統合効率の定量。計算は、図 3の凡例で説明されます。凍結・融解に続く統合活動の損失はありません。2 インタソーム準備 5 独立実験平均統合効率を示します。エラーバーは標準偏差を示します。対応のある t 検定分析をもたらした両側 P = 0.011、フリーズ/フリーズ解除可能性がありますが少し強化統合アクティビティを示唆しています。<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57453/57453fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57453/57453fig5.jpg"> 図 5: 分子および位置の影響のインタソーム組み立てのラベルします。PFV のインタソーム アセンブリには、ラベル (赤)、内部のラベルの付いた Cy5 とオリゴ 1 (黒) (青)、Cy5 とオリゴ 2 に分類される端またはビオチン (オレンジ) とオリゴ 2 に分類される端だった vDNAs が含まれています。すべてのアセンブリは、アガロース秒と分かれていた。Y 軸は、マウの外径を示します。クロマト グラムのインタソームの種類ごとの少なくとも 2 の独立したアセンブリの代表であります。10 倍 Cy5 と PFV intasomes の収量を減らす終わりの分類とビオチン 1.8-fold。最後 Cy5 とビオチン アセンブリ高塩 resolubilization (ステップ 3.5) 後残り、サイズ排除カラム上の材料の見掛け上の損失で、その結果著しくより多くの沈殿物があります。ラベル付けされていない vDNA として intasomes の等しい収量につながる Cy5 fluorophore と vDNA の内部ラベルします。<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57453/57453fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

組換えレトロ ウイルス ・ ウイルス DNA の両端を模倣した DNA オリゴマー、インタソームと呼ばれる酵素によって実行中の複合体を形成できます。Intasomes は、生化学、構造、および速度論的研究に使えます。このプロトコルは、組み立てるし、プロトタイプ フォーミー ウイルス intasomes を浄化する方法をについて説明します。

アセンブリおよびプロトタイプ フォーミー ウイルス Intasomes の精製

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

5.4K ビュー.  The Ohio State University College of Medicine. 組換えレトロ ウイルス ・ ウイルス DNA の両端を模倣した DNA オリゴマー、インタソームと呼ばれる酵素によって実行中の複合体を形成できます。Intasomes は、生化学、構造、および速度論的研究に使えます。このプロトコルは、組み立てるし、プロトタイプ フォーミー ウイルス intasomes を浄化する方法をについて説明します。

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Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal phase during establishment of infection in a given host. Consequently, study of encapsidation deciphers the information regarding the know-how of the mechanism regulating virus assembly to form infectious virions. Such information is vital in formulating novel methods of curbing virus spread and disease control. Virus encapsidation can be studied in vivo and in vitro. Genome encapsidation in vivo is a highly regulated selective process involving macromolecular interactions and subcellular compartmentalization. Therefore, study leading to dissect events encompassing virus encapsidation in vivo would provide basic knowledge to understand how viruses proliferate and assemble. Recently in vitro encapsidation has been exploited for the research in the area of biomedical imaging and therapeutic applications. Non-enveloped plant viruses stand far ahead in the venture of in vitro encapsidation of the negatively charged foreign material. Brome mosaic virus (BMV), a non-enveloped multicomponent RNA virus pathogenic to plants, has been used as a model system for studying genome packaging in vivo and in vitro. For encapsidation assays in Nicotiana benthamiana plants, Agrobacterium -mediated transient expression, refer to as agroinfiltration, is an efficient and robust technique for the synchronized delivery and expression of multiple components to the same cell. In this approach, a suspension of Agrobacterium tumefaciens cells carrying binary plasmid vectors carrying cDNAs of desiredviral mRNAs is infiltrated into the intercellular space withina leaf using nothing more sophisticated than a 1 ml disposable syringe (without needle). This process results in the transfer of DNA insert into plant cells; the T-DNA insert remains transiently in the nucleus and is then transcribed by the host polymerase II, leading to the transient expression. The resulting mRNA transcript (capped and polyadenylated) is then exported to the cytoplasm for translation. After approximately 24 to 48 hours of incubation,sections of infiltrated leaves can be sampled for microscopyor biochemical analyses. Agroinfiltration permits large numbers (hundreds to thousands) of cells to be transfected simultaneously. For in vitro encapsidation, purified virions of BMV are dissociated into capsid protein by dialyzing against dissociation buffer containing calcium chloride followed by removal of RNA and un-dissociated virions by centrifugation. Genome depleted capsid protein subunits are then reassembled with desired viral genome components or non-viral components such as indocyanine dye.

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

A simple, efficient and robust way to synchronize the delivery of multiple viral components to plant cells via Agrobacterium-mediated transient expression is described. This approach is amenable for studying replication, encapsidation followed by in vitro reassembly of non-viral components into genome depleted optical viral ghosts suitable for biomedical applications.

シンプルで堅牢な<emin vivoでの>と in vitroで</emウイルスの組み立てを学ぶための>アプローチ

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

免疫・感染学

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States alone, an average of 41,400 deaths and 1.86 million hospitalizations are caused by influenza virus infection each year 1. Point mutations in the polymerase basic protein 2 subunit (PB2) have been linked to the adaptation of the viral infection in humans 2. Findings from such studies have revealed the biological significance of PB2 as a virulence factor, thus highlighting its potential as an antiviral drug target.
The structural genomics program put forth by the National Institute of Allergy and Infectious Disease (NIAID) provides funding to Emerald Bio and three other Pacific Northwest institutions that together make up the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease (SSGCID). The SSGCID is dedicated to providing the scientific community with three-dimensional protein structures of NIAID category A-C pathogens. Making such structural information available to the scientific community serves to accelerate structure-based drug design.
Structure-based drug design plays an important role in drug development. Pursuing multiple targets in parallel greatly increases the chance of success for new lead discovery by targeting a pathway or an entire protein family. Emerald Bio has developed a high-throughput, multi-target parallel processing pipeline (MTPP) for gene-to-structure determination to support the consortium. Here we describe the protocols used to determine the structure of the PB2 subunit from four different influenza A strains.

Structure-based drug design plays an important role in drug development. Pursuing multiple targets in parallel greatly increases the chance of success for lead discovery. The following article highlights how the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease utilizes a multi-target approach for gene-to-structure determination of the PB2 influenza A subunit.

インフルエンザポリメラーゼPB2サブユニットの遺伝子の構造決定のためのマルチターゲット並列処理アプローチ

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum (ER) resident proteins implicated in homotypic fusion of the ER. We detail here a method for purifying a glutathione S-transferase (GST) and poly-histidine tagged Drosophila atlastin by two rounds of affinity chromatography. Studying fusion reactions in vitro requires purified fusion proteins to be inserted into a lipid bilayer. Liposomes are ideal model membranes, as lipid composition and size may be adjusted. To this end, we describe a reconstitution method by detergent removal for Drosophila atlastin into preformed liposomes. While several reconstitution methods are available, reconstitution by detergent removal has several advantages that make it suitable for atlastins and other similar proteins. The advantage of this method includes a high reconstitution yield and correct orientation of the reconstituted protein. This method can be extended to other membrane proteins and for other applications that require proteoliposomes. Additionally, we describe a FRET based lipid mixing assay of proteoliposomes used as a measurement of membrane fusion.

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biological membrane fusion is catalyzed by specialized fusion proteins. Measuring the fusogenic properties of proteins can be achieved by lipid mixing assays. We present a method for purifying recombinant Drosophila atlastin, a protein that mediates homotypic fusion of the ER, reconstituting it to preformed liposomes, and testing for fusion capacity.

脂質混合アッセイ用リポソームへの組換えショウジョウバエアラストシンの洗剤支援再構成

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

生化学

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and assay development in virology. The RNA template of nonsegmented negative-sense (NNS) RNA viruses, such as the respiratory syncytial virus (RSV), is not an RNA molecule alone but rather a nucleoprotein (N) encapsidated ribonucleoprotein complex. Despite the importance of the authentic RNA template, the generation and assembly of such a ribonucleoprotein complex remain sophisticated and require in-depth elucidation. The main challenge is that the overexpressed RSV N binds non-specifically to cellular RNAs to form random nucleocapsid-like particles (NCLPs). Here, we established a protocol to obtain RNA-free N (N0) first by co-expressing N with a chaperone phosphoprotein (P), then assembling N0 with RNA oligos with the RSV-specific RNA sequence to obtain virus-specific nucleocapsids (NCs). This protocol shows how to overcome the difficulty in the preparation of this traditionally challenging viral ribonucleoprotein complex.

For in-depth mechanistic analysis of the respiratory syncytial virus (RSV) RNA synthesis, we report a protocol of utilizing the chaperone phosphoprotein (P) for coexpression of the RNA-free nucleoprotein (N0) for subsequent in vitro assembly of the virus-specific nucleocapsids (NCs).

呼吸器間性ウイルスのウイルス特異的ヌクレオカプシドの生成と組み立て

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

勾配遠心によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解で

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It is extremely desirable to pair high-resolution cryo-EM information with dynamic observations as many events occur at rapid timescales - in the millisecond range or faster. Improved knowledge of flexible structures can also assist in the design of novel reagents to combat emerging pathogens, such as SARS-CoV-2. More importantly, viewing biological materials in a fluid environment provides a unique glimpse of their performance in the human body. Presented here are newly developed methods to investigate the nanoscale properties of virus assemblies in liquid and vitreous ice. To accomplish this goal, well-defined samples were used as model systems. Side-by-side comparisons of sample preparation methods and representative structural information are presented. Sub-nanometer features are shown for structures resolved in the range of ~3.5-&#197;-10 &#197;. Other recent results that support this complementary framework include dynamic insights of vaccine candidates and antibody-based therapies imaged in liquid. Overall, these correlative applications advance our ability to visualize molecular dynamics, providing a unique context for their use in human health and disease.

Here protocols are described to prepare virus assemblies suitable for liquid-EM and cryo-EM analysis at the nanoscale using transmission electron microscopy.

液体および氷中のウイルス集合体の高解像度イメージングの進歩

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

組換えプロトタイプ フォーミー ウイルス インテグラーゼの浄化中にヌクレアーゼの混入の検出と除去

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell deformation, division, migration, and adhesion. However, studying the dynamics and structure of the actin network in vivo is complicated by the biochemical and genetic regulation within live cells. To build a minimal model devoid of intracellular biochemical regulation, actin is encapsulated inside giant unilamellar vesicles (GUVs, also called liposomes). The biomimetic liposomes are cell-sized and facilitate a quantitative insight into the mechanical and dynamical properties of the cytoskeleton network, opening a viable route for bottom-up synthetic biology. To generate liposomes for encapsulation, the inverted emulsion method (also referred to as the emulsion transfer method) is utilized, which is one of the most successful techniques for encapsulating complex solutions into liposomes to prepare various cell-mimicking systems. With this method, a mixture of proteins of interest is added to the inner buffer, which is later emulsified in a phospholipid-containing mineral oil solution to form monolayer lipid droplets. The desired liposomes are generated from monolayer lipid droplets crossing a lipid/oil-water interface. This method enables the encapsulation of concentrated actin polymers into the liposomes with desired lipid components, paving the way for in vitro reconstitution of a biomimicking cytoskeleton network.

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

In this manuscript, we demonstrate the experimental techniques to encapsulate the F-actin cytoskeleton into giant unilamellar lipid vesicles (also called liposomes), and the method to form a cortex-biomimicking F-actin layer at the inner leaflet of the liposome membrane.

インビトロ 巨大単層小胞内のアクチン細胞骨格の再構成

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

生物工学

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

生物学

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased biosafety and stability over use of live pathogens. Non-infectious and self-assembling, VLPs are used to present structural proteins as immunogens, bypassing the need for live pathogens or recombinant viral vectors for antigen delivery. In this article, we demonstrate the different stages of VLP design and development for future applications in preclinical animal testing. The procedure includes the following stages: selection of antigen, expression of antigen in cell line of choice, purification of VLPs/SVPs, and quantification for antigen dosing. We demonstrate use of both mammalian and insect cell lines for expression of our antigens and demonstrate how methodologies differ in yield. The methodology presented may apply to a variety of pathogens and can be achieved by substituting the antigens with immunogenic structural proteins of the user&#39;s microorganism of interest. VLPs and SVPs assist with antigen characterization and selection of the best vaccine candidates.

Here, we present a protocol for synthesizing virus-like particles using either baculovirus or mammalian expression systems, and ultracentrifugation purification. This highly customizable approach is used to identify viral antigens as vaccine targets in a safe and flexible manner.

ワクチン接種のための発現およびウイルス様粒子の精製

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...

アセンブリおよびプロトタイプフォーミーウイルス Intasomes の精製

要約

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シンプルで堅牢なと in vitroでアプローチ

インフルエンザポリメラーゼPB2サブユニットの遺伝子の構造決定のためのマルチターゲット並列処理アプローチ

脂質混合アッセイ用リポソームへの組換えショウジョウバエアラストシンの洗剤支援再構成

呼吸器間性ウイルスのウイルス特異的ヌクレオカプシドの生成と組み立て

勾配遠心によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解で

液体および氷中のウイルス集合体の高解像度イメージングの進歩

組換えプロトタイプフォーミーウイルスインテグラーゼの浄化中にヌクレアーゼの混入の検出と除去

インビトロ巨大単層小胞内のアクチン細胞骨格の再構成

単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製

ワクチン接種のための発現およびウイルス様粒子の精製

アセンブリおよびプロトタイプ フォーミー ウイルス Intasomes の精製

要約

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シンプルで堅牢なと in vitroでアプローチ

インフルエンザポリメラーゼPB2サブユニットの遺伝子の構造決定のためのマルチターゲット並列処理アプローチ

脂質混合アッセイ用リポソームへの組換えショウジョウバエアラストシンの洗剤支援再構成

呼吸器間性ウイルスのウイルス特異的ヌクレオカプシドの生成と組み立て

勾配遠心によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解で

液体および氷中のウイルス集合体の高解像度イメージングの進歩

組換えプロトタイプ フォーミー ウイルス インテグラーゼの浄化中にヌクレアーゼの混入の検出と除去

インビトロ 巨大単層小胞内のアクチン細胞骨格の再構成

単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製

ワクチン接種のための発現およびウイルス様粒子の精製

アセンブリおよびプロトタイプフォーミーウイルス Intasomes の精製

組換えプロトタイプフォーミーウイルスインテグラーゼの浄化中にヌクレアーゼの混入の検出と除去

インビトロ巨大単層小胞内のアクチン細胞骨格の再構成