Name: a simple and efficient method for in vivo cardiac-specific gene manipulation by intramyocardial injection in mice
Uploaded: 2018-04-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
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この作品は、著名な若手学者 (81625002)、国家自然科学基金、中国の (81470389、81270282、81601238)、プログラムの上海学術研究リーダー (18XD1402400)、上海市の国立科学基金によって支えられました。教育委員会 Gaofeng 臨床医学助成 (20152209)、上海 Shenkang 病院開発センター (16CR3034A)、上海交通大学 (YG2013MS42)、上海 Jiao はさみ大学大学院医学 (15ZH1003、14XJ10019)上海セーリング プログラム (18YF1413000) と蚌埠市医科大学 (Byycx1722) の大学院イノベーション プログラム。私たちの研究室で彼の以前のヘルプ、博士 Erhe Gao に感謝します

すべての動物実験は、実験動物の使用に関する健康ガイドラインの国家機関によるとを実施し、研究所の動物倫理委員会で承認されました。男性 c57bl/6 j マウス (8-10 週齢) は、すべての実験のために使用されました。マウスは、24 の ° C ± 4 ° C、水や食料を無料での 12 h 明暗周期下で病原体フリーの条件の下で収容されました。
1 アデノ ウイルス溶液の調製
<ol><li>精製されたアデノ ウイルス ソリューションの到着後、-80 ° C のフリーザーでソリューションを保存します。 注: 実行可能なマウスのアデノ ウイルス注入を行った。アデノウイルスベクターの無菌性を確保するため、アデノ ウイルス (エンコード ルシフェラーゼ、VDR、またはターゲットに VDR shRNA) 調製し、, 市販9,10を精製しました。</li>
	<li>操作の日、-80 ° C のフリーザーから精製されたアデノ ウイルス ソリューション (3 x 1010プラーク形成単位 [pfu]/mL) を取り出すし、氷上アデノ ウイルスのベクトルのソリューションを解凍します。</li>
	<li>フェイス マスク、滅菌手袋、滅菌ガウンを着た。</li>
	<li>50 μ L の準備手術前日に滅菌されているハミルトン注射器。 注: 滅菌、ハミルトン注射器はガーゼに包まれ、高温・高圧滅菌器で配置。「ソリッドの滅菌」のモードが選ばれ、滅菌が「スタート」ボタンを押すことによって開始されました。</li>
	<li>精製されたアデノ ウイルス ソリューションの完全な融解後スプレーの 75% エタノール、アデノ ウイルス ソリューションを含む管、層流無菌フードにアデノ ウイルス ソリューションを移動します。</li>
	<li>層流無菌フードでは、ハミルトンのシリンジに 30 G の針の添付ファイルに続く針なしハミルトン注射器を使用して 50 μ L アデノ ウイルス ソリューションを吸引します。</li>
	<li>上方に 30 G の針とシリンジを保持、アデノ ウイルス ソリューション (針の先端から最初のソリューションの滴の外観で確認) と針が塗りつぶされるまで注射器のピストンがゆっくりと。 注: それは 30 G の針を合わせて約 45 μ L ソリューションをかかりますので、今はほとんどないソリューションが表示されるシリンジで。</li>
	<li>上記準備された注射器を使用して、別の 30 μ L のアデノ ウイルス ソリューションを慎重に吸引、その後の使用のための氷に緩くおおわれた注射器。</li>
</ol>2. 麻酔や手術の準備
<ol><li>イソフルラン気化器に 20 mL イソフルランを追加、イソフルラン気化器を酸素ボンベに接続します。</li>
	<li>バルブを開き、酸素を聞かせてイソフルラン気化器に酸素タンクからフローします。イソフルラン気化器で酸素フロー モニター経由で 2 L/分で酸素流量を維持します。</li>
	<li>イソフルラン気化器に接続されているプラスチック製のケージで 2 分間 100% 酸素 (2 L/分) で 4% イソフルランとマウスの麻酔を誘導します。</li>
	<li>プラスチック製ケージから麻酔下マウスを取り出しと層流無菌フードでは、腹臥位でのプラスチック製プラットフォーム上に固定、鼻の円錐形によって 100% 酸素 (2 L/分) で 2% イソフルレンで麻酔を維持します。</li>
	<li>つま先ピンチ応答の不在によって適切な麻酔を確認します。</li>
	<li>角膜を乾燥から保護するためにそれぞれの目に滅菌眼クリームを適用します。</li>
	<li>胸部と上腹部を剃る。1 分削除脱毛クリーム坊主のサイトに市販の脱毛クリームを適用し、残りのぬれたガーゼで毛皮。</li>
	<li>ヨウ素クロルヘキシジンによる消毒剤 (例えば entoiodine) の 3 のスクラブと手術部位 (左胸の下の部分) を消毒します。滅菌ドレープで手術部位をカバーしてください。</li>
</ol>3. 心筋内注射マウスの心臓におけるアデノ ウイルス
<ol><li>手袋を脱ぐし、滅菌手袋の新しいペアに置きます。</li>
	<li>外科はさみのペア、マイクロ モスキート止血鉗子を滅菌し、高の操作の前に日に針ホルダー温・高圧滅菌器 (手順 1.4 注記参照)。</li>
	<li>剣と腋窩を結ぶ線に沿って 0.5 cm の皮膚切開を行います。大胸筋と小胸筋とマイクロ モスキート止血鉗子を解剖ぶっきらぼう。</li>
	<li>大胸筋と小胸筋の取り消しによって肋間スペースを公開します。貫通し、マイクロ モスキート止血で第 4 肋間スペース (または観察によって広い肋間スペース) を開きます。</li>
	<li>そっと胸の壁の右側に押すことによって非利き手の人差し指でハートを外部化する切開に向けて心を押してください。</li>
	<li>優しく非利き手の親指と人差し指で外在の心臓を保護します。</li>
	<li>支配的な手で満ちているアデノ ウイルス (図 1) ハミルトン シリンジを介して 3 つのサイト (左心室の腹、背、左右壁) で左心室の心筋に 30 μ L アデノ ウイルス ソリューションの合計を挿入します。</li>
	<li>注入が完了したら、すぐに胸腔内の空間に心を配置します。</li>
	<li>手動で胸壁を皮膚切開部位に向かって軽く押す、胸腔内の空気を避難させます。 注: 成功した空気避難は主要な胸びれと追放された空気によって引き起こされるマイナーな胸筋の羽ばたきによって証明されることができます。</li>
	<li>5-0 シルク縫合糸で水平マットレス縫合で皮膚を閉じます。 注: 大胸筋と小胸筋がない縫合する、彼らは解剖だけぶっきらぼう、彼らの解剖学的構造、操作を通じてそのまま。</li>
</ol>4. 術後管理
<ol><li>二度毎日操作11の後最初の 48 時間の術後の痛みを軽減する皮下注射を介してブプレノルフィン (3 mg/kg) を管理します。</li>
	<li>手術後、完全に回復するまですぐに熱パッド (37 ° C) の上のマウスを維持します。それは完全に回復した後ケージにマウスを配置します。</li>
	<li>ハミルトンの使用済み注射器、高温・高圧滅菌器で 30 G 注射針滅菌 (手順 1.4 注記参照)。シャープス コンテナーの滅菌の 30 G の注射針を収集します。</li>
</ol>5. 心臓ルシフェラーゼ発現を測定するin Vivoイメージング
<ol><li>アデノ ウイルス注入後の 5 日目、ルシフェリン ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) で 15 mg/ml の新鮮な在庫ソリューションを準備します。0.2 μ m のフィルターを通してソリューションをフィルターします。</li>
	<li>150 mg/kg 体重でルシフェリン溶液注入目を覚ましマウス腹腔内ベンゼン。</li>
	<li>イメージング システムを入れます。</li>
	<li>自動イメージング システムの自己診断後、「発光」として画像モードを選択し、次の設定を行う: 露出: 自動;ビニング: 8;FStop: 1;励起: ブロック;排出: オープン。</li>
	<li>ルシフェリン注射後 10 分で抱水クロラール注入 (300 mg/kg 体重) によるマウスを麻酔します。つま先ピンチ応答の不在によって適切な麻酔を確認します。</li>
	<li>カメラに向けて胸を温水イメージング ステージ上腹臥位での麻酔下のマウスを固定します。</li>
	<li>画像 (各マウスの 1 画像) を収集し、胸の周りの利益 (率 ROI) の同一円測定領域を描画することによって信号の強さを数値化します。</li>
	<li>画像のコレクションの後マウスを犠牲にし、次のセクションで説明したように、組織を収集します。</li>
</ol>6. 組織の収穫
<ol><li>ウイルス注入 (図 1 b) 後の異なる時間ポイントで 4% イソフルランとマウスを麻酔の維持と鼻の円錐形によって 2% イソフルレン麻酔・腹臥位でのプラスチック製プラットフォーム上に固定します。</li>
	<li>前頸部で正中腹壁切開を行います。肩甲舌骨と胸鎖乳突筋の取り消しによって右総頚動脈を公開します。</li>
	<li>Transecting 右総頚動脈と血を流してによってマウスを犠牲に。</li>
	<li>腹部の正中腹壁切開を行います。鎖骨中央線上に沿って胸郭の両側から肋骨を切り、横隔膜のトランセクトします。</li>
	<li>剣を持ち上げることによって心を公開します。上行大動脈を見つけるし、血管周囲の脂肪組織を慎重に取り外します。</li>
	<li>Cannulate 大動脈と逆行性 4 ° C リン酸緩衝液 (PBS) の 0.5 ml、1 mL の注射器に接続されている 30 G 針で心臓を灌流します。</li>
	<li>灌流後、中心部を切除、左と右の心室に分割します。肝臓、肺と脾臓を切除します。</li>
	<li>冷 PBS (4 ° C) で、2 つの洗後液体窒素の極低温バイアルで収集されたすべての組織を個別に格納します。</li>
</ol>7. タンパク質発現の定量
<ol><li>均質化のバッファーを準備するには、1: 100 の比率で市販の換散バッファーにプロテアーゼ阻害剤のカクテルを追加します。処理されるサンプルの数に基づいて容量を計算します。その後の使用のための 4 ° C で準備された均質化バッファーを保持します。</li>
	<li>液体窒素タンクから組織を取る。組織の高精度スケール (組織の各部分の約 60 mg) 重量を量る。</li>
	<li>組織を新しい 1.5 mL 遠心チューブに転送します。すぐに遠心チューブに 200 μ L の均質化のバッファーと冷却 1.5 mm 鋼球 (4 ° C) を追加します。</li>
	<li>冷却 (4 ° c) マイクロ遠心チューブ用の研削盤、自動体内金属ホルダーをセキュリティで保護し、次の設定でコンピューターを起動することによって均質化を開始: 周波数: 70 Hz時間: 120 秒。</li>
	<li>均質化後、(16,000 × g, 4 ° C)、ホモジネートを遠心し、100 μ L ピペットを新しい 1.5 mL チューブに上清を慎重に転送。</li>
	<li>追加読み込みバッファーし、1:4 の割合で上清タンパク質溶液 (5 x) と 100 ° C で 5 分間でタンパク質を変性します。</li>
	<li>心臓や他の臓器組織に蛋白質の表現のレベルの西部のしみの分析 (結果を図 2および図 3に示す代表) によって監視されてさらにプロトコルに従って前述の12。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yancy, C. 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著者が明らかに何もありません。

現在のレポートに示します Gaoらによって心筋梗塞誘導法から変更された心臓の発現ウイルスベクターの心筋内注入法が変更されました。13現在、体内特性特定遺伝子の機能のほとんどを含むノックアウト、トランスジェニック マウス3,14,15,16,17 の世代、高価な時間のかかる、労働集約型であります。また、遺伝子ベクターまたは全身またはローカル注入による siRNA の配信も広く循環器病研究4,5,7の遺伝子操作の練習します。特に、心筋内注入は、特定の状況下での心臓の遺伝子操作の置き換えができない: サイトが注入が必要 (例えば、心筋梗塞モデルにおけるボーダー ゾーン注入) を監督するとき11;期間限定の遺伝子操作が必要 (例えば、アデノ ウイルス注入) ときです。ここでは、変更された心筋内注入法が簡単な時間の節約、および非常に効率的なことを示した。
プロトコルの中で重要なステップとトラブルシューティングします。
このプロトコルの成功した操作は、いくつかの重要な手順を注意しなければなりません。吸引ウイルス、ハミルトン シリンジと接続されている針内にある空気を避難する必要があります、前に局所心筋傷害また更に死以外空気を心筋に注入される可能性があります。この問題を避けるためには、十分なウイルス量でいっぱい使える - ハミルトン注射器配置しないでくださいプランジャー端を下方に、これは自発的に金属のプランジャーの重力によって空気を吸引がありますので。麻酔は深い麻酔は術後回復を遅らせる可能性があり、深刻な深い麻酔は、死を引き起こす可能性があります注意深く監視する必要があります。十分な麻酔の後中心がない外部化胸部キャビティから力によって重篤な肺の傷害が生じるので。確かに、適切な心臓の外部化は、心の穏やかなプッシュのみを必要とし、抵抗も不適切な方向に向けてプッシュ可能性があります。
技術の制限:
挿管の手順に必要な時間が短縮されます、この技術での除去は、死を避けるために比較的制限された時間ウィンドウ内にある心筋内注入のプロシージャの終わるべきであることを示唆しています。心は、私たちの経験によると、30 人以上のない外部必要があります s、これは死亡率を増加し、手術後の回復が遅くなりますので。したがって、ここで説明したプロトコルの最初の試みには、挿管の使用の使用をお勧めします。別の制限は、心筋内注入7の従来の方法にも存在するこの方法で配信されるウイルスのベクトルの不均等な配分です。さらに、ここで説明する方法が役より別の心疾患モデル18,19,20の確立によって続くことができる、無傷の心の中の心臓特異的遺伝子操作 21,22,23。これらのマウス可能性があります手順を容認しないので、梗塞心などの傷ついた心にエージェントを提供する現在のメソッドの使用は限られているかもしれません。
既存のメソッドの意義:
従来の心筋内注入は、挿管および機械的人工換気24を必要とし、高速マウス ハートビートによる注射部位を見つけるが困難になります。これらの問題を操作時間13時間遅れによってもたらされるバリエーションが増えてさらに延長します。ここで示した修正手法はクイック、手動で外部化された心臓を保護することによってサイトの正確な注入の場所をことができます。全体的に、その後の研究を大幅に増強します。また、挿管および機械的人工換気の除去は修正法をほぼすべての研究室にアクセスできるようにします。

心臓病は、罹患率と死亡率の世界1,2の主要な原因です。心筋梗塞、心不全などの命にかかわる心臓疾患の効果的な治療戦略の欠如は、基になるある集中的な探査と新しい治療オプション3の身分証明書を集めています。これらの科学的な探検の心臓特異的遺伝子操作は広く使われている4,5です。心臓遺伝子操作ゲノム編集強力な転写活性化因子のようなエフェクター ヌクレアーゼ (TALEN) を使用することによって達成することができ、定期的に空間の短い回文繰り返し (CRISPR) をクラスター化 CRISPR 関連タンパク質 9 (Cas9)/ツール、または異所性の遺伝物質 (例えば興味の蛋白質をコードする遺伝子を運ぶウイルスのベクトル) の配信6。生きているマウスに正確と時空間のゲノムの変更が許可されるゲノム編集、それはまだ6時間のかかり、労働集約的な練習。また、ウイルスのベクトルまたは小さな干渉 RNA (siRNA) 複雑な配信が日常的に心臓特異的遺伝子操作は6を実行しました。
成体マウスの心にウイルス ベクター配信は約 2 つの戦略によって達成される: 全身またはローカル注入。Cardiotropic 血清型 AAV9 など通気の全身投与は心筋特異的遺伝子操作7の非侵襲的です。ただし、このメソッドは、効率的な情報伝達と遺伝子発現に必要なベクトルの比較的高い量を必要とする、筋肉や肝臓7非標的臓器の重要な伝達があります。ローカル ウイルス注入は、心筋や冠動脈内配信7によって実現されます。冠動脈内の配信は、心筋内注入と比較して心の中でウイルスのより均等に配分をもたらします。ただし、この手法の欠点は、全身循環し、標的臓器8、および操作中に圧力測定器をその要件の伝達ウイルスのベクトルのうち急速洗浄です。対照的に、ウイルスを均等に失敗した心筋と同様に、サイト固有の配信でもより良いウイルス保持心筋内注入によりベクトル7です。小動物、冠動脈内の配信は技術的に困難、全身性 AAV9 注入と心筋がより一般的に用いられる4,5,7を実行します。全身注入が簡単に実行できますが、従来の心筋内注入機械換気と開胸を必要とする、広範な組織の損傷を引き起こすと時間がかかる。
本報告では、時間を節約、簡単な非常に効率的な心筋内注入法について説明しました。アデノ ウイルス shRNA VDR、ターゲットや VDR、ルシフェラーゼのエンコーディングは、心臓遺伝子発現を操作する注入しました。一度マスター、このメソッドはセルまたはマウスの心臓の他の材料の注入と同様、遺伝子操作の使用できます。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow sterile hood</td><td>Fengshi Animal Experimental&amp;nbsp; Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China)</td><td>FS-CJ-2F</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>75005282</td><td></td></tr><tr><td>Tissue grinding machine</td><td>Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)</td><td>Scientz-48</td><td></td></tr><tr><td>High temperature/high pressure sterilizer</td><td>Hirayama (Saitama, Japan)</td><td>HVE-50</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane vaporizer&amp;nbsp;</td><td>Matrix (Orchard Park, USA)</td><td>VIP3000</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&amp;nbsp; Lumina III imaging system</td><td>PerkinElmer (Waltham, USA)</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>Precision&amp;nbsp;balance</td><td>Sartorius (G&amp;ouml;ttingen, Germany)</td><td>28091873</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instruments&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf pipette (100 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf (Westbury, USA)</td><td>&amp;nbsp;4920000059</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf pipette (10 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf (Westbury, USA)</td><td>&amp;nbsp;4920000113</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.&amp;nbsp;</td><td>JD4020</td><td>Curved tip</td></tr><tr><td>Hamilton syringe</td><td>Hamilton (Nevada, USA)</td><td>80501</td><td>Volume 50 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>Micro-mosquito hemostat</td><td>F.S.T (Foster City, USA)</td><td>13011-12</td><td>Curved, tip width 1.3mm</td></tr><tr><td>Needle holder&amp;nbsp;</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)</td><td>J32110</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>F.S.T (Foster City, USA)</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>1-mL Syringe</td><td>WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials and reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH antibody</td><td>CST (Danvers,&amp;nbsp; USA)</td><td>#2118</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Luciferase antibody</td><td>Abcam (Cambridge, UK)</td><td>ab187340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG</td><td>CST (Danvers,&amp;nbsp; USA)</td><td>&amp;nbsp;#7074</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VDR antibody</td><td>Abcam (Cambridge, UK)</td><td>&amp;nbsp;ab109234</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>PA175056</td><td></td></tr><tr><td>Chloralic hydras</td><td>LingFeng Chemical (ShangHai, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic Vials</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>375418</td><td>1.8 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Depilatory cream</td><td>Veet (Shanghai, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline&amp;nbsp;</td><td>Gibco (Grand Island,&amp;nbsp; USA)</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Entoiodine</td><td>LiKang (Shanghai, China)</td><td>310132</td><td></td></tr><tr><td>EP tube</td><td>Sarstedt (Newton, USA)</td><td>PCR001</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Millipore (Bedford, USA)</td><td></td><td>Pore size 0.2 &amp;micro;m&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Promega (Madison, USA)</td><td>P1041</td><td></td></tr><tr><td>Lysis buffer for western&amp;nbsp; blot</td><td>Beyotime (Shanghai, China)</td><td>P0013J</td><td>Without inhibitors</td></tr><tr><td>Ophthalmic cream</td><td>Apex Laboratories ( Melbourne, Australia))</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco (Grand Island,&amp;nbsp; USA)</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>78438</td><td></td></tr><tr><td>5-0 silk suture</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steel ball</td><td>Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)</td><td></td><td>Width 1.5 mm</td></tr><tr><td>Syringe needle</td><td>Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China)</td><td></td><td>30 gauge&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Warm mat</td><td>Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China )</td><td>NF-GNCW</td><td></td></tr></tbody></table>

a simple and efficient method for in vivo cardiac-specific gene manipulation by intramyocardial injection in mice

中心部に特に遺伝子操作は、心疾患の病因と治療の可能性の検討を大幅増強します。心臓固有遺伝子デリバリー生体内で一般的全身またはローカルの配信を実現します。尾静脈から全身投与が簡単かつ効率的な組換えアデノ随伴ウイルス 9 (AAV9) を使用して心臓の遺伝子発現を操作します。ただし、このメソッドの効率的な伝達ベクトルの比較的高い量を必要とする、非標的臓器の遺伝子導入可能性があります。ここでは、生体内で心臓特異的遺伝子操作マウスの心筋内注入のシンプルで効率的、かつ時間を節約法について述べる。(換気) なし、麻酔下でメジャーとマイナーの胸筋は切除したぶっきらぼうとマウスの心臓だった第 4 肋間スペースに小さな切開を通してマニュアル外部によって公開されるすぐに。その後、エンコード ルシフェラーゼ (リュック) とビタミン D の受容器 (VDR) または短いヘアピン RNA (shRNA) ターゲットに VDR、アデノ ウイルスは、心筋にハミルトン注射器で注入されました。その後体内イメージングを示したそのルシフェラーゼ中心部に特に正常に発現。さらに、西部のしみの分析は成功の過剰発現またはマウスの心臓における VDR の沈黙を確認しました。一度マスター、細胞やマウスの心臓におけるナノゲルなど他の材料の注入と同様、遺伝子操作、このテクニックが使えます。

実験プロトコルおよび報告に関する主な手順のいくつかは、図 1に表示されます。アデノ ウイルス エンコード ルシフェラーゼ (Adv ・ リュック) の心筋内注射後 5 日目は、生体内でイメージ投射 adv リュック注入マウスで具体的にあった中心 (図 2 a、 B)、ルシフェラーゼの堅牢な過剰発現と示されました。ウエスタンブロット法 (図 2)、非標的臓器伝達の不在を示唆によって確認されました。対照的に、コントロール マウスにおけるルシフェラーゼ発現が検出されましたないです。ルシフェラーゼの成功の過剰発現と一致して、西部のしみの VDR (adv-VDR) (図 3 a) をエンコード アデノ ウイルスを注入したマウスの左心室内推奨の大幅に増加した VDR 発現解析。さらに、adv shVDR 注入は、VDR 発現左心室 (図 3 b) を大幅削減。対照的に、VDR 発現変更されませんでした大幅も adv VDR 注入マウスやマウスの adv-shVDR 注入 (図 3、 D)、右心室に、アデノ ウイルスだけ左心室筋内に注入されたので。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57074/57074fig1.jpg"> 図 1.マウス心筋注入と遺伝子発現検出プロトコルのスキーマします。(A) 図の左心室の心筋の 3 つの注射部位を示します。(B) の示されたウイルスの注入後マウスの心臓での遺伝子発現の検出のためのプロトコル。ホタルルシフェラーゼの Adv-ルシフェラーゼ: アデノ ウイルスエンコード VDR; AdVDR: アデノ ウイルスAdshVDR、アデノ ウイルス エンコード shRNA VDR を対象とします。(C) 代表的なイメージのマウス心筋内注入法の改良の複数手順を示します。a.市販の脱毛クリームで毛の除去。ポビドン ヨードの 3 スクラブと手術部位のb.殺菌。c.滅菌ドレープで手術部位をカバーします。0.5 cm d.剣と腋窩を結ぶ線に沿って切開e.は、大胸筋と小胸筋とマイクロ モスキート止血鉗子の郭清を鈍らせます。f.心の表出。ハミルトン シリンジを介して左心室の心筋に 30 μ L アデノ ウイルス ソリューションのg.注入。h-5-0 絹糸で巾着縫合により皮膚のi.閉鎖。<a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57074/57074fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57074/57074fig2.jpg"> 図 2.心のルシフェラーゼ発現の検出。(A) 画像コントロール マウスと注入後 5 日ホタルルシフェラーゼ アデノ ウイルス投与マウスの中心の発光信号を示す、イメージング システムによって収集されました。異なるグループに属する (B) 発光信号強度 (n = 3) t検定で統計解析にさらされます。p < コントロール マウスと 0.01。(C) 西部のしみ分析心のルシフェラーゼのタンパク質レベルを示す結果、肺、肝臓、および脾臓で示されるグループ アデノ ウイルス注入後 5 日目 (n = 3)。ルシフェラーゼ発現が Adv リュック注入マウスの心臓で検出されただけ後、は、統計分析が実行されませんでした。ホタルルシフェラーゼの Adv-リュック: アデノ ウイルス。<a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57074/57074fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57074/57074fig3.jpg"> 図 3.心の VDR 発現の検出。(A) 上部パネル: 西部のしみは、0 日、5 日、7 日、adv VDR 注入後 14 日で左心室 (アデノ ウィルスを注入して) 示す VDR レベルをバンドします。底板: 異なるグループに VDR 発現レベルの半定量的解析 (n = 4 時間ポイントごと)。結果は GAPDH に対して正規化され、0 日を基準に変更を倍に変換します。一方向の分散分析 (ANOVA) ボンフェローニの事後テスト (検定想定) 続いてまたは Tamhane 事後テスト (検定とは見なされません) 統計分析を行った。p < 0.05 または * *p < 0 日対 0.01。(B) 上部パネル: 西部のしみは 0 日、3 日、5 日と adv shVDR 注射後 7 日で左心室の示す VDR レベルをバンドします。底板: 異なるグループに VDR 発現レベルの半定量的解析 (n = 4 時間ポイントごと)。p < 0 日対 0.05。(C) 上部パネル: 西部のしみは、0 日、5 日、7 日、adv VDR 注入後 14 日で (場所、アデノ ウイルスが注入されていません) 右心室で示す VDR レベルをバンドします。底板: 異なるグループに VDR 発現レベルの半定量的解析 (n = 4 時間ポイントごと)。(D) 上部パネル: 西部のしみは 0 日、3 日、5 日と adv shVDR 注射後 7 日以内に右心室に示す VDR レベルをバンドします。底板: 異なるグループに VDR 発現レベルの半定量的解析 (n = 4 時間ポイントごと)。<a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57074/57074fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

ここでマウスの心臓特異的遺伝子操作するためのプロトコルを提案する.麻酔下マウス心が第 4 肋間スペースで外部化。その後、特定遺伝子が生体内イメージングと西洋を介してタンパク質発現の測定によって続いて心筋に注射器で注入したアデノ ウイルス ブロット分析です。

シンプルで効率的なマウスの心筋内注入による生体内の心臓特異的遺伝子操作法

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. ...

a-simple-efficient-method-for-vivo-cardiac-specific-gene-manipulation

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

15.8K ビュー.  The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College. ここでマウスの心臓特異的遺伝子操作するためのプロトコルを提案する.麻酔下マウス心が第 4 肋間スペースで外部化。その後、特定遺伝子が生体内イメージングと西洋を介してタンパク質発現の測定によって続いて心筋に注射器で注入したアデノ ウイルス ブロット分析です。

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Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Numerous genetic manipulations and/or intramyocardial injections of genes, proteins, cells, and/or biomaterials are superimposed upon the dimension of time in studies of acute ischemia/ reperfusion injury and chronic remodeling in mice. This video illustrates the microsurgical procedures for ischemia/reperfusion, permanent coronary artery ligation, and intramyocardial injection studies.

心筋梗塞のマウスモデルにおける冠動脈結紮および心筋内注入

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

医学

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising treatment option for heart disease, owing to its efficiency and exceptional therapeutic effects. In an effort to repair the damaged tissue post-MI, various studies have employed DNA-based or viral gene therapy but have faced considerable hurdles due to the poor and uncontrolled expression of the delivered genes, edema, arrhythmia, and cardiac hypertrophy. Synthetic modified mRNA (modRNA) presents a novel gene therapy approach that offers high, transient, safe, nonimmunogenic, and controlled mRNA delivery to the heart tissue without any risk of genomic integration. Due to these remarkable characteristics combined with its bell-shaped pharmacokinetics in the heart, modRNA has become an attractive approach for the treatment of heart disease. However, to increase its effectiveness in vivo, a consistent and reliable delivery method needs to be followed. Hence, to maximize modRNA delivery efficiency and yield consistency in modRNA use for in vivo applications, an optimized method of preparation and delivery of modRNA intracardiac injection in a mouse MI model is presented. This protocol will make modRNA delivery more accessible for basic and translational research.

This protocol presents a simple and coherent way to transiently upregulate a gene of interest using modRNA after myocardial infarction in mice.

心筋梗塞マウスモデルにおける修飾mRNAの導入

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

遺伝学

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue revascularization and cell survival. In addition, further observations revealed that specific stem cells, such as cardiac stem cells, mesenchymal stem cells and cardiospheres have the ability to integrate within the surrounding myocardium by differentiating into cardiomyocytes, smooth muscle cells and endothelial cells.
Here, we present the materials and methods to reliably deliver noncontractile cells into the left ventricular wall of immunodepleted mice. The salient steps of this microsurgical procedure involve anesthesia and analgesia injection, intratracheal intubation, incision to open the chest and expose the heart and delivery of cells by a sterile 30-gauge needle and a precision microliter syringe.
Tissue processing consisting of heart harvesting, embedding, sectioning and histological staining showed that intramyocardial cell injection produced a small damage in the epicardial area, as well as in the ventricular wall. Noncontractile cells were retained into the myocardial wall of immunocompromised mice and were surrounded by a layer of fibrotic tissue, likely to protect from cardiac pressure and mechanical load.

Intramyocardial cell delivery in murine models of cardiovascular diseases, such as hypertension or myocardial infarction, is widely used to test the therapeutic potential of different cell types in regenerative studies. Therefore, a detailed description and a clear visualization of this surgical procedure will help to define the limits and advantages of cardiovascular cell therapeutic analyses in small rodents.

心筋内細胞送達：マウスハーツの観測

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

鳥胚胚心筋細胞の生体内注入にマイクロインジェクション ベース システム

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

発生生物学

Ultrasound-guided Transthoracic Intramyocardial Injection in Mice

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. Experiments involving myocardial injection are currently performed by direct surgical access through a thoracotomy. While convenient when performed at the time of another experimental manipulation such as coronary artery ligation, the need for an invasive procedure for intramyocardial delivery limits potential experimental designs. With ever improving ultrasound resolution and advanced noninvasive imaging modalities, it is now feasible to routinely perform ultrasound-guided, percutaneous intramyocardial injection. This modality efficiently and reliably delivers agents to a targeted region of myocardium. Advantages of this technique include the avoidance of surgical morbidity, the facility to target regions of myocardium selectively under ultrasound guidance, and the opportunity to deliver injectate to the myocardium at multiple, predetermined time intervals. With practiced technique, complications from intramyocardial injection are rare, and mice quickly return to normal activity on recovery from anesthetic. Following the steps outlined in this protocol, the operator with basic echocardiography experience can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

Echocardiography-guided percutaneous intramyocardial injection represents an efficient, reliable, and targetable modality for the delivery of gene transfer agents or cells into the murine heart. Following the steps outlined in this protocol, the operator can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

マウスにおける超音波ガイド下経胸壁心筋内注射

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. ...

エレクトロポレーションに基づくマウス心臓細胞のトランスジェネシス

An Efficient Transgenesis Approach for Gene Delivery in the Mouse Embryonic Heart

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, and fate of these progenitors are vital for the proper development of this organ. The molecular mechanisms that govern the morphogenesis of the heart are essential for understanding the pathogenesis of congenital heart diseases and embryonic cardiac regeneration. Classical approaches to investigate these mechanisms employed the generation of transgenic mice to assess the function of specific genes during cardiac development. However, mouse transgenesis is a complex, time-consuming process that often cannot be performed to assess the role of specific genes during heart development. To address this, we have developed a protocol for efficient electroporation and culture of mouse embryonic hearts, enabling transient transgenesis to rapidly assess the effect of gain- or loss-of-function of genes involved in cardiac development. Using this methodology, we successfully overexpressed Meis1 in the embryonic heart, with a preference for epicardial cell transfection, demonstrating the capabilities of the technique.

著者スポットライト:迅速な遺伝子スクリーニングのための心臓細胞トランスジェネシス

This protocol presents a detailed methodological framework for electroporation-based transgenesis of cardiac cells in developing mouse hearts. The video assets provided here will facilitate learning of this versatile technique.

マウス胚性心臓における遺伝子導入のための効率的なトランスジェネシスアプローチ

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, ...

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection fraction (HFrEF). Before they can be considered for use, and implemented in humans, extensive preclinical studies are required in large animal models to evaluate the safety, efficacy, and fate of the injectate (e.g., stem cells) once delivered into the myocardium. Small rodent models offer advantages (e.g., cost effectiveness, amenability for genetic manipulation); however, given inherent limitations of these models, the findings in these rarely translate into the clinic. Conversely, large animal models such as rabbits, have advantages (e.g., similar cardiac electrophysiology compared to humans and other large animals), whilst retaining a good cost-effective balance. Here, we demonstrate how to perform a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection (IMI) technique, which is minimally invasive, safe, well tolerated, and very effective in the targeted delivery of injectates, including cells, into several locations within the myocardium of a rabbit model. For the implementation of this technique, we also have taken advantage of a widely available clinical echocardiography system. After putting in practice the protocol described here, a researcher with basic ultrasound knowledge will become competent in the performance of this versatile and minimally invasive technique for routine use in experiments, aimed at hypothesis testing of the capabilities of cardiac regenerative therapeutics in the rabbit model. Once competency is achieved, the whole procedure can be performed within 25 min after anaesthetizing the rabbit.

Novel therapeutic strategies in cardiac regenerative medicine require extensive and detailed studies in large preclinical animal models before they can be considered for use in humans. Here, we demonstrate a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection technique in rabbits, which is valuable for hypothesis testing the efficacy of such novel therapies.

経皮的造影エコー ガイド心筋と大規模な前臨床モデルで携帯配信

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and living organisms from a wide variety of species. The CRISPR technology has also been explored as novel therapeutics for a number of human diseases. Proof-of-concept data are highly encouraging as exemplified by recent studies that demonstrate the feasibility and efficacy of gene editing-based therapeutic approach for Duchenne muscular dystrophy (DMD) using a murine model. In particular, intravenous and intraperitoneal injection of the recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) has enabled efficient cardiac delivery of the Staphylococcus aureus CRISPR-associated protein 9 (SaCas9) and two guide RNAs (gRNA) to delete a genomic region with a mutant codon in exon 23 of mouse Dmd gene. This same approach can also be used to knock out the gene-of-interest and study their cardiac function in postnatal mice when the gRNA is designed to target the coding region of the gene. In this protocol, we show in detail how to engineer rAAVrh.74-CRISPR vector and how to achieve highly efficient cardiac delivery in neonatal mice.

Here we provide a detailed protocol to carry out in vivo cardiac gene editing in mice using recombinant Adeno-Associated Virus(rAAV)-mediated delivery of CRISPR. This protocol offers a promising therapeutic strategy to treat dystrophic cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy and can be used to generate cardiac-specific knockout in postnatal mice.

心臓の遺伝子がマウスでの編集の CRISPR アデノ随伴ウイルスを介した配信

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

シンプルで効率的なマウスの心筋内注入による生体内の心臓特異的遺伝子操作法

要約

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この動画の章

心筋梗塞のマウスモデルにおける冠動脈結紮および心筋内注入

心筋梗塞マウスモデルにおける修飾mRNAの導入

心筋内細胞送達：マウスハーツの観測

鳥胚胚心筋細胞の生体内注入にマイクロインジェクションベースシステム

マウスにおける超音波ガイド下経胸壁心筋内注射

マウス胚性心臓における遺伝子導入のための効率的なトランスジェネシスアプローチ

マウス胚性心臓における遺伝子導入のための効率的なトランスジェネシスアプローチ

マウス胚性心臓における遺伝子導入のための効率的なトランスジェネシスアプローチ

経皮的造影エコーガイド心筋と大規模な前臨床モデルで携帯配信

心臓の遺伝子がマウスでの編集の CRISPR アデノ随伴ウイルスを介した配信

シンプルで効率的なマウスの心筋内注入による生体内の心臓特異的遺伝子操作法

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心筋梗塞のマウスモデルにおける冠動脈結紮および心筋内注入

心筋梗塞マウスモデルにおける修飾mRNAの導入

心筋内細胞送達：マウスハーツの観測

鳥胚胚心筋細胞の生体内注入にマイクロインジェクション ベース システム

マウスにおける超音波ガイド下経胸壁心筋内注射

マウス胚性心臓における遺伝子導入のための効率的なトランスジェネシスアプローチ

マウス胚性心臓における遺伝子導入のための効率的なトランスジェネシスアプローチ

マウス胚性心臓における遺伝子導入のための効率的なトランスジェネシスアプローチ

経皮的造影エコー ガイド心筋と大規模な前臨床モデルで携帯配信

心臓の遺伝子がマウスでの編集の CRISPR アデノ随伴ウイルスを介した配信

鳥胚胚心筋細胞の生体内注入にマイクロインジェクションベースシステム

経皮的造影エコーガイド心筋と大規模な前臨床モデルで携帯配信