修飾RNAは、心臓および他の器官への遺伝子導入のための新しい方法である。このプロトコルは、心筋梗塞後の心臓に一過性の所望の遺伝子を送達する正確なアプローチを提供する。この方法は心筋梗塞に限らず、虚血再灌流、および横大動脈収縮モデルにも適用できる。
修飾RNAは、いくつかのヒト臨床試験で使用されています。しかし、この方法を用いて、遺伝子が心臓に移されるという標準化されたプロトコルはない。視覚デモンストレーションは、研究者が心臓の適切な場所で修飾されたRNAを正しく注入することを可能にする。
プロセドゥルのデモンストレーションは、博士研究員のアジット・マガドゥムと、私たちの研究室の動物監督者エレナ・チェプルコです。modRNAで以前に調製された濃度に基づいて、100マイクログラムの注入に必要なmodRNAの量を計算する。スクロースとクエン酸塩溶液の等しい量を作ります。
次に、計算されたmodRNAの体積を加え、注入量を60マイクロリットルにする十分な生理食塩水を加えます。動物を麻酔した後、腹側を上に置き、口を実験者に向けます。次に、気管内挿管を行うことにより開放気道を維持し、舌をそっと引き出す。
首の角度を調整して挿管経路をまっすぐにし、挿管カニューレを押し込みます。マウスの胸部の動きを観察し、両方の肺が酸素を受け取っていることを確認します。呼吸数は毎分約120回の呼吸である必要があります。
LADライゲーションを開始するには、マウスを右側に慎重に回します。皮膚を持ち上げ、3番目と4番目の肋骨の間で左の胸部切裂術を行う。鋭利な物体で肺に触れることなく、胸郭を慎重に開けます。
胸腔を開いた状態に保つために切開部にレトラクタを置き、心臓の明確な眺めを提供する。次に、肺を切開の端まで移動させ、心臓を覆っている心膜嚢の一部を取り除く。肺動脈と左耳結部の間に位置する深部光赤色血管であるLADを慎重に特定する。
単一のシルク縫合糸で近位LADをリゲートします。インスリン注射器を使用して、合計60マイクロリットルのmodRNA溶液を心臓に送達する。3つの異なる部位で、筋肉内に20マイクロリットルを注入する。
ライゲーションの両側に1つの部位と心臓の頂点に1つ。修飾されたRNAを正しい部位に注入する最良の方法は、LADの閉塞後の顕微鏡下で組織の変色を観察することである。また、注入されたとき、循環に心臓室に到達するために組織に深く入りすぎないでください。
胸部切開部を層で閉じます。最初の使用は、肋骨を適応させるために6-0シルクランニング縫合糸でした。その後、5-0シルクランニング縫合糸を使用して皮膚を閉じます。
回復段階では、カニューレを取り除き、自発的な呼吸を可能にする。意識が回復するまで、動物を加熱パッドの上に置きます。完全に目が覚めていくまで、動物を放置しないでください。
術後の痛みを管理するには、3日間12時間間隔でブプレノルフィンを皮下注射する。体重1キログラム当たり0.1ミリグラムの用量で。CFWマウスにおけるルシファーゼモRNAのLADライゲーションおよび注入の24時間後、トランスフェクションは、生物発光イメージングシステムを用いたルシファーゼタンパク質発現をチェックすることによって検証された。
ルシファーゼシグナルは、対照マウスを比較する画像において、ルシファーゼモドRNAを注射したマウスに対して明確に検出することができる。ルシファーゼシグナルの定量化は、処置マウスにおいて対照マウスよりも有意に高いタンパク質発現を示す。Cre modRNA発現は、トランスジェニックROSA26 mTmGマウスにおける翻訳および生体分布を確認することによって検証された。
手術およびcre modRNA注射の24時間後、心筋細胞マーカー、心臓トロポニンI、および核マーカーDAPIによる免疫染色のために芸術を固定および処理した。緑色の心筋細胞の出現により、クレ発現が成功した。マージされた画像は、2つの可視注射部位の周りのcre活性化細胞を示しています。
青は核染色DAPIです。修飾されたRNAプラットフォームは、様々な臓器で単一の遺伝子または遺伝子の組み合わせを提供することができます。したがって、遺伝性疾患の矯正、または体内の有益なメカニズムの活性化などの治療目的に使用することができる。
修飾RNAのユニークな薬物動態は、その注射直後に遺伝子機能を評価することを可能にします。これにより、研究者は梗塞の最初の数時間で変化するシグナル伝達経路を標的にすることができます。
