Este trabalho foi financiado pelo fundo nacional de ciência para ilustres jovens estudiosos (81625002), Nacional Natural Science Foundation da China (81470389, 81270282, 81601238), programa de Shanghai acadêmica líder de pesquisa (18XD1402400), Shanghai Municipal Apoio educação Comissão Gaofeng medicina clínica Grant (20152209), centro de desenvolvimento do Hospital de Shenkang de Shanghai (16CR3034A), Universidade do Tong de Shanghai Jiao (YG2013MS42), Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (15ZH1003 e 14XJ10019), Programa de navegação de Shanghai (18YF1413000) e programa de pós-graduação inovação da faculdade de medicina de Bengbu (Byycx1722). Agradecemos sua ajuda anterior Dr. Erhe Gao em nosso laboratório.

Todas as experiências em animais foram realizadas de acordo com os institutos nacionais de saúde orientações sobre o uso de animais de laboratório e foram aprovadas pelo Comitê de ética Animal do Instituto. Camundongos C57BL/6J machos (8-10 semanas de idade) foram usados para todos os experimentos. Os ratos foram alojados em condições de livre de patógeno a 24 ° C ± 4 ° C, sob um ciclo claro/escuro de 12-h, com livre acesso à água e comida.
1. preparação da solução de adenovírus
<ol><li>Após a chegada da solução purificada adenovírus, conservar a solução em um freezer-80 ° C. Nota: A injeção de adenovírus foi realizada em ratos viáveis. Para garantir a esterilidade do vetor adenovírus, o vírus adenoide (codificação do luciferase, VDR ou shRNA alvo VDR) foram preparadas e purificado comercialmente9,10.</li>
	<li>No dia da operação, retire a solução purificada adenovírus (3 x 1010 placa formando unidades [pfu] /mL) do congelador a-80 ° C e descongelar a solução do vetor de adenovírus no gelo.</li>
	<li>Veste uma máscara, luvas estéreis e vestido de estéril.</li>
	<li>Preparar um 50 µ l seringa Hamilton que foi esterilizada no dia antes da operação. Nota: Para a esterilização, a seringa Hamilton foi envolto em gaze e colocada em um esterilizador de pressão de alta temperatura/alta. O modo de "Esterilização para o sólido" foi selecionado e esterilização foi iniciada pressionando o botão "start".</li>
	<li>Após o descongelamento completo da solução purificada adenovírus, pulverizar o tubo contendo solução de adenovírus com 75% de etanol e mover a solução de adenovírus em uma capa de fluxo laminar estéril.</li>
	<li>Em uma capa de fluxo laminar estéril, Aspire solução de adenovírus 50 µ l utilizando a seringa Hamilton sem uma agulha, seguida de penhora de uma agulha 30G à seringa Hamilton.</li>
	<li>Segurar a seringa com a agulha de 30g para cima e empurre suavemente o êmbolo da seringa até que a agulha é preenchida com solução de adenovírus (confirmada pelo aparecimento das primeiras gotas de solução de ponta da agulha). Nota: Demora aproximadamente 45 µ l solução para preencher a agulha 30G, então agora quase nenhuma solução é visível na seringa.</li>
	<li>Use a seringa preparada acima para Aspire cuidadosamente com outra solução de adenovírus 30 µ l e coloque a seringa vagamente tampada no gelo para uso subsequente.</li>
</ol>2. anestesia e preparação operativa
<ol><li>Adicionar 20 mL isoflurano em um vaporizador de isoflurano e conectar o vaporizador de isoflurano para um tanque de oxigênio.</li>
	<li>Abra a válvula e deixe o oxigênio fluxo do tanque de oxigênio para o vaporizador de isoflurano. Manter a taxa de fluxo de oxigênio a 2 L/min, através de um monitor de fluxo de oxigênio no vaporizador de isoflurano.</li>
	<li>Induzi a anestesia do mouse com 4% de isoflurano em 100% de oxigênio (2 L/min) por 2 min em uma gaiola de plástico ligada ao vaporizador de isoflurano.</li>
	<li>Tirar o mouse anestesiado da jaula de plástico e fixá-lo em uma plataforma de plástico na posição de bruços em uma capa de fluxo laminar estéril e manter a anestesia com isoflurano de 2% em 100% de oxigênio (2 L/min) através de um cone de nariz.</li>
	<li>Confirme a anestesia adequada pela ausência de resposta de pitada de dedo do pé.</li>
	<li>Aplique o creme oftálmico estéril para cada olho para proteger as córneas de secagem.</li>
	<li>Depilar o peito e abdômen superior. Aplicar creme depilatório comercialmente disponível para o site raspado para 1 min. Retire o creme depilatório e restante pele com gazes molhadas.</li>
	<li>Esterilize o local cirúrgico (parte inferior esquerda do tórax) com 3 batas de anti-séptico à base de iodo-clorexidina (por exemplo, entoiodine). Cobrir o local cirúrgico com um pano estéril.</li>
</ol>3. Intramiocárdica injeção de adenovírus no coração de rato
<ol><li>Tirar as luvas e colocar um novo par de luvas estéreis.</li>
	<li>Esterilizar o fórceps, uma pinça hemostática micro-mosquito, um par de tesouras cirúrgicas, e um porta-agulha no dia antes da operação em uma alta temperatura/alta pressão esterilizador (ver nota etapa 1.4).</li>
	<li>Faça uma incisão de 0,5 cm de pele ao longo da linha que liga o xifoide e axila. Sem rodeios, disse o peitoral maior e peitorais menores músculos com fórceps e uma pinça hemostática micro-mosquito.</li>
	<li>Expor os espaços intercostais, retraindo o peitoral maior e peitorais menores músculos. Perfurar e abra o quarto espaço intercostal (ou o mais amplo espaço intercostal por observação) com uma pinça hemostática micro-mosquito.</li>
	<li>Empurre o coração em direção a incisão de exteriorizar o coração com o dedo indicador da mão não dominante, pressionando suavemente contra o lado direito da parede torácica.</li>
	<li>Secure suavemente o coração exteriorizado com o dedo indicador e o polegar da mão não dominante.</li>
	<li>Injete um total de solução de adenovírus 30 µ l do miocárdio do ventrículo esquerdo em três locais (parede ventral, dorsal e lateral do ventrículo esquerdo) através da seringa Hamilton repleto de adenovírus (Figura 1) com a mão dominante.</li>
	<li>Após a conclusão da injeção, coloca imediatamente o coração volta para o espaço intratorácicos.</li>
	<li>Manualmente, evacue o ar no espaço intratorácicos pressionando suavemente a parede torácica para o local de incisão da pele. Nota: Evacuação de ar bem sucedido pode ser evidenciada pelo bater do peitoral maior e peitorais menores músculos causados pelo ar expelido.</li>
	<li>Feche a pele por sutura horizontal com uma sutura de seda 5-0. Nota: O peitoral maior e peitorais menores músculos devem não ser suturados, porque eles só sem rodeios são dissecados e suas estruturas anatômicas estão intactas durante toda a operação.</li>
</ol>4. pós-operatórios
<ol><li>Administre a buprenorfina (3 mg/kg) duas vezes diariamente através de injeção subcutânea para reduzir a dor pós-operatória para as primeiras 48 horas após a operação11.</li>
	<li>Após a operação, imediatamente manter os ratos em uma almofada de calor (37 ° C) até que se recuperou totalmente. Coloque o mouse volta para a jaula, depois que ele se recupere totalmente.</li>
	<li>Esterilizar o usado Hamilton seringa e agulha de seringa 30g num esterilizador alta temperatura/alta pressão (ver nota etapa 1.4). Recolha a agulha de seringa esterilizada 30 G em um recipiente de objectos cortantes.</li>
</ol>5. na Vivo Imaging para medir a expressão Luciferase cardíaca
<ol><li>No dia 5 após a injeção de adenovírus, prepare uma solução stock fresca de luciferina em 15 mg/mL em solução salina de tampão fosfato de Dulbecco (DPBS). Filtre a solução através de um filtro de 0,2 µm.</li>
	<li>Intra peritoneally Injete os ratos acordados com a solução de luciferina a 150 mg/kg de peso corporal.</li>
	<li>Ligue o sistema de imagem.</li>
	<li>Depois automático autoteste do sistema de imagem, selecione o modo de imagem como "Luminescentes" e fazer as seguintes configurações: exposição: Auto; Binning: 8; FStop: 1; Excitação: Bloco; Emissão: aberto.</li>
	<li>Em 10 min após a injeção de luciferina, anestesia os ratos por injeção de hidrato de cloral (300 mg/kg de peso corporal). Confirme a anestesia adequada pela ausência de resposta de pitada de dedo do pé.</li>
	<li>Fixe os ratos anestesiados num palco de imagem aquecida na posição de bruços, com o peito voltado para a câmera.</li>
	<li>Recolher imagens (1 imagem para cada rato) e quantificar a intensidade dos sinais desenhando-se as regiões de idêntica medida circular de interesse (ROI) em torno do peito.</li>
	<li>Após a coleta de imagens, sacrificar os ratos e coletar os tecidos, como mencionado na seção a seguir.</li>
</ol>6. colheita de tecidos
<ol><li>Em pontos diferentes de tempo após a injeção do vírus (figura 1B), anestesiar os ratos com 4% de isoflurano, manter a anestesia com isoflurano 2% através de um cone de nariz e fixá-lo em uma plataforma de plástico na posição de bruços.</li>
	<li>Fazer uma incisão ventral no pescoço anterior. Expor a artéria carótida comum direita, retraindo os músculos omohyoid e esternocleidomastoideo.</li>
	<li>Sacrifica os ratos por cruza a artéria carótida comum direita e drenar o sangue.</li>
	<li>Fazer uma incisão ventral no abdome. Corte as costelas de ambos os lados da caixa torácica, ao longo da linha médio clavicular e transecto o diafragma.</li>
	<li>Expor o coração, levantando o xifoide. Encontrar a aorta ascendente e remova cuidadosamente o tecido adiposo perivascular.</li>
	<li>Canule da aorta e perfundir retrogradely o coração com uma agulha 30G anexada a uma seringa de 1 mL, preenchida com 0,5 mL de solução-tampão de fosfato (PBS) 4 ° C.</li>
	<li>Após a perfusão, excisar o coração e dividi-lo nos ventrículos direito e esquerdos. Excisar o fígado, pulmão e baço.</li>
	<li>Depois de duas lavagens em PBS frio (4 ° C), armazene todos os tecidos coletados separadamente em frascos criogênicos em nitrogênio líquido.</li>
</ol>7. determinação da expressão da proteína
<ol><li>Prepare o tampão de homogeneização adicionando coquetel de inibidor de protease em tampão de Lise comercialmente disponível a uma proporção de 1: 100. Calcule o volume total, com base no número de amostras a serem processadas. Mantenha o buffer de homogeneização preparado a 4 ° C para uso posterior.</li>
	<li>Tire os tecidos do tanque de nitrogênio líquido. Pese o tecido em escalas de alta precisão (cerca de 60 mg para cada pedaço de tecido).</li>
	<li>Transferi o tecido para um novo tubo de 1,5 mL microcentrifuge. Imediatamente adicione 200 µ l homogeneização buffer e pré-resfriado esferas de aço 1,5 mm (4 ° C) no tubo de microcentrifugadora.</li>
	<li>Fixar os tubos microcentrifuga em pré-resfriado (4 ° C) suportes de metal em um tecido automático retificadora e começar a homogeneização, iniciando a máquina com as seguintes configurações: frequência: 70 Hz; tempo: 120 s.</li>
	<li>Após a homogeneização, centrifugue o homogeneizado (16.000 × g, 4 ° C) e transferir cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL com uma pipeta de 100 µ l.</li>
	<li>Adicionar o carregamento do buffer solução (5x) à proteína sobrenadante na proporção de 1:4 e desnaturar a proteína a 100 ° C por 5 min.</li>
	<li>Os níveis de expressão de proteínas no coração e outros tecidos de órgãos são mais monitorados pela análise ocidental do borrão (representante resultados são mostrados na Figura 2 e Figura 3) de acordo com o protocolo descrito anteriormente12.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yancy, C. 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Os autores não têm nada para divulgar.

O presente relatório demonstra uma técnica modificada para injeção Intramiocárdica de vetores virais para manipulação do gene cardíaca, que foi modificado de um método para indução do infarto do miocárdio por Gao et al 13 atualmente, na vivo caracterização das funções do gene específico geralmente envolvem a geração de nocaute ou ratos transgénicos3,14,15,16,17 , que é caro, demorado e trabalhoso. Alternativamente, entrega de vetores de gene ou siRNA por injeção sistêmica ou local é também amplamente praticada para manipulação genética em pesquisa cardiovascular4,5,7. Em particular, a injeção Intramiocárdica não pode ser substituída para manipulação do gene cardíaca sob determinadas circunstâncias: quando o local dirigido a injeção é necessário (por exemplo, injeção de zona de fronteira no modelo de infarto do miocárdio)11; Quando manipulação genética duração restrita é necessário (por exemplo, injeção de adenovírus). Aqui, nós mostramos que o método de injeção Intramiocárdica modificado é simples, economia de tempo e altamente eficiente.
Passos críticos dentro do protocolo e solução de problemas:
Para o bom funcionamento do presente protocolo, devem notar-se várias etapas críticas. Antes de vírus de aspiração, o ar dentro da seringa Hamilton e a agulha fixa deve ser evacuada, caso contrário o ar injetado no miocárdio pode causar lesão cardíaca tópica ou até mesmo a morte. Para evitar ainda mais esta questão, ready-to-use seringa Hamilton preenchida com um volume adequado de vírus não deve ser colocada com a extremidade do êmbolo para baixo, porque isto pode espontaneamente Aspire ar pela gravidade do êmbolo metal. Anestesia deve ser cuidadosamente monitorizada, como anestesia profunda pode atrasar a recuperação pós-operação e anestesia severamente profunda pode causar a morte. Após a anestesia adequada, o coração deve não ser exteriorizado fora da cavidade torácica pela força, pois isso pode resultar em lesão pulmonar grave. Com efeito, exteriorização de coração adequada requer apenas um empurrão suave do coração, e qualquer resistência pode indicar empurrando em direção a direção imprópria.
Limitações da técnica:
A eliminação de intubação nesta técnica, o que reduz o tempo necessário para o procedimento, sugere que o procedimento de injeção Intramiocárdica deve ser terminado dentro de uma janela de tempo relativamente limitado para evitar a morte. De acordo com nossa experiência, o coração não deve ser exteriorizado por mais de 30 s, porque isto aumenta a taxa de morte e retarda a recuperação pós-operatória. Portanto, recomenda-se o uso de intubação para as primeiras tentativas do protocolo descrito aqui. Outra limitação é a distribuição desigual de vetores virais, entregado por esse método, que também existe em métodos convencionais de injeção Intramiocárdica7. Além disso, o método descrito aqui é mais útil para a manipulação genética de cardíaco-específicas em corações ilesos, que podem ser seguidas pelo estabelecimento de doença cardíaca diferentes modelos18,19,20, 21,22,23. No entanto, o uso do método atual da produção de agentes para corações feridas como enfartadas corações pode ser limitado, porque estes ratos não podem tolerar o procedimento.
Importância no que diz respeito a métodos existentes:
Injeção Intramiocárdica convencional requer intubação e ventilação mecânica24e torna difícil localizar o local da injeção devido o batimento cardíaco rápido do rato. Estas questões prolongam significativamente a operação tempo13, aumentando assim as variações decorrentes do atraso de tempo. A técnica modificada apresentada aqui é rápida e permite o local do site precisa injeção fixando manualmente o coração exteriorizado; em geral, potenciando significativamente estudo subsequente. Além disso, a eliminação de intubação e ventilação mecânica disponibilizar o método modificado para quase qualquer laboratório.

Doença cardíaca é a principal causa de morbilidade e mortalidade em todo o mundo1,2. A falta de estratégias terapêuticas eficazes para doenças cardíacas fatais e incluindo infarto do miocárdio e insuficiência cardíaca atrai a exploração intensiva de pathomechanisms subjacentes e identificação de opções terapêuticas novela3. Para estas explorações científicas, manipulação genética cardíaco-específicas é amplamente utilizado4,5. Manipulação genética cardíaca pode ser conseguida editando genoma usando a nuclease efetoras como ativador de transcrição poderoso (TALEN) e agrupados regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR) / proteína associada CRISPR 9 (Cas9) ferramentas, ou por entrega de materiais genéticos de gravidez ectópica (por exemplo, vetores de vírus, carregando genes que codificam proteínas de interesse)6. Embora a edição do genoma permite modificações precisas e spatiotemporal genoma em ratos vivos, ainda é uma prática demorada e trabalhosa,6. Alternativamente, manipulação de gene específico cardíaco pelo vírus vetor ou interferindo pequeno entrega complexa de RNA (siRNA) são rotineiramente realizada6.
Entrega de vetor de vírus para o coração de rato adulto é alcançada por aproximadamente duas estratégias: injeção sistêmica ou local. Injeção sistêmica de sorotipo cardiotropic de AAVs como AAV9 é não-invasiva para o gene específico cardíaca manipulação7. No entanto, esse método requer uma quantidade relativamente alta de vetor necessário para transdução eficiente e expressão gênica e pode resultar em significativa transdução do nontarget órgãos tais como o músculo e fígado7. Injeção local de vírus é conseguida por injeção Intramiocárdica ou entrega Intracoronário7. Intracoronário entrega leva a uma distribuição mais uniforme do vírus dentro do coração em comparação com injeção Intramiocárdica. No entanto, as desvantagens desta técnica são a lavagem rápida fora de vetores virais para a circulação sistêmica e transdução em órgãos nontarget8e sua exigência de dispositivos para medição de pressão durante a operação. Por outro lado, permite de injeção Intramiocárdica melhor retenção de vírus no miocárdio, bem como entrega de local específico, mas não consegue distribuir uniformemente viral vector7. Para pequenos animais, entrega Intracoronário é tecnicamente difícil de executar, enquanto sistêmica AAV9 injeção e injeção Intramiocárdica são mais comumente praticada4,5,7. Embora injeção sistêmica é fácil de realizar, injeção Intramiocárdica convencional requer toracotomia e ventilação mecânica, provoca dano tecidual extensa e é demorada.
Neste relatório, nós descrevemos um método fácil, economia de tempo e altamente eficiente para injeção Intramiocárdica. Adenovírus codificação luciferase e VDR ou shRNA alvo VDR, foi injetado para manipular a expressão de gene cardíaca. Uma vez dominado, esse método pode ser usado para manipulação genética, bem como a injeção de células ou outros materiais no coração do mouse.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow sterile hood</td><td>Fengshi Animal Experimental&amp;nbsp; Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China)</td><td>FS-CJ-2F</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>75005282</td><td></td></tr><tr><td>Tissue grinding machine</td><td>Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)</td><td>Scientz-48</td><td></td></tr><tr><td>High temperature/high pressure sterilizer</td><td>Hirayama (Saitama, Japan)</td><td>HVE-50</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane vaporizer&amp;nbsp;</td><td>Matrix (Orchard Park, USA)</td><td>VIP3000</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&amp;nbsp; Lumina III imaging system</td><td>PerkinElmer (Waltham, USA)</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>Precision&amp;nbsp;balance</td><td>Sartorius (G&amp;ouml;ttingen, Germany)</td><td>28091873</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instruments&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf pipette (100 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf (Westbury, USA)</td><td>&amp;nbsp;4920000059</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf pipette (10 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf (Westbury, USA)</td><td>&amp;nbsp;4920000113</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.&amp;nbsp;</td><td>JD4020</td><td>Curved tip</td></tr><tr><td>Hamilton syringe</td><td>Hamilton (Nevada, USA)</td><td>80501</td><td>Volume 50 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>Micro-mosquito hemostat</td><td>F.S.T (Foster City, USA)</td><td>13011-12</td><td>Curved, tip width 1.3mm</td></tr><tr><td>Needle holder&amp;nbsp;</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)</td><td>J32110</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>F.S.T (Foster City, USA)</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>1-mL Syringe</td><td>WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials and reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH antibody</td><td>CST (Danvers,&amp;nbsp; USA)</td><td>#2118</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Luciferase antibody</td><td>Abcam (Cambridge, UK)</td><td>ab187340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG</td><td>CST (Danvers,&amp;nbsp; USA)</td><td>&amp;nbsp;#7074</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VDR antibody</td><td>Abcam (Cambridge, UK)</td><td>&amp;nbsp;ab109234</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>PA175056</td><td></td></tr><tr><td>Chloralic hydras</td><td>LingFeng Chemical (ShangHai, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic Vials</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>375418</td><td>1.8 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Depilatory cream</td><td>Veet (Shanghai, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline&amp;nbsp;</td><td>Gibco (Grand Island,&amp;nbsp; USA)</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Entoiodine</td><td>LiKang (Shanghai, China)</td><td>310132</td><td></td></tr><tr><td>EP tube</td><td>Sarstedt (Newton, USA)</td><td>PCR001</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Millipore (Bedford, USA)</td><td></td><td>Pore size 0.2 &amp;micro;m&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Promega (Madison, USA)</td><td>P1041</td><td></td></tr><tr><td>Lysis buffer for western&amp;nbsp; blot</td><td>Beyotime (Shanghai, China)</td><td>P0013J</td><td>Without inhibitors</td></tr><tr><td>Ophthalmic cream</td><td>Apex Laboratories ( Melbourne, Australia))</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco (Grand Island,&amp;nbsp; USA)</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>78438</td><td></td></tr><tr><td>5-0 silk suture</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steel ball</td><td>Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)</td><td></td><td>Width 1.5 mm</td></tr><tr><td>Syringe needle</td><td>Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China)</td><td></td><td>30 gauge&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Warm mat</td><td>Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China )</td><td>NF-GNCW</td><td></td></tr></tbody></table>

a simple and efficient method for in vivo cardiac-specific gene manipulation by intramyocardial injection in mice

Manipulação genética, especificamente no coração significativamente potenciar a investigação de doença cardíaca pathomechanisms e seu potencial terapêutico. Na vivo entrega cardíaco-específicas do gene é comumente conseguida entrega local ou sistêmica. Injeção sistêmica através da veia da cauda é fácil e eficiente em manipular a expressão de gene cardíaco usando vírus adeno-associado recombinante 9 (AAV9). No entanto, esse método requer uma quantidade relativamente alta de vetor para transdução eficiente e pode resultar na transdução de gene nontarget órgão. Aqui, descrevemos um método simples, eficiente e economia de tempo de injeção Intramiocárdica para na vivo manipulação gene específico cardíaca em ratos. Sob anestesia (sem ventilação), os músculos peitorais maiores e menores foram dissecados sem rodeios, e o coração de rato foi rapidamente exposto pelo manual exteriorização através de uma pequena incisão no quarto espaço intercostal. Posteriormente, adenovírus, codificação do luciferase (Luc) e receptor de vitamina D (VDR) ou RNA de gancho de cabelo curto (shRNA) segmentação VDR, foi injetado com uma seringa Hamilton o miocárdio. Subsequentes na vivo imagem demonstrou que luciferase foi com êxito Blumental especificamente no coração. Além disso, a análise ocidental do borrão confirmou o sucesso superexpressão ou silenciamento de VDR, no coração do mouse. Uma vez dominado, esta técnica pode ser usada para manipulação genética, bem como a injeção de células ou outros materiais, tais como nanogels no coração do mouse.

O protocolo do experimento e algumas das principais etapas para o método relatado são mostradas na Figura 1. Em 5 dias após a injeção Intramiocárdica de luciferase codificação de adenovírus (Adv-luc), na vivo por imagens em ratos injetado adv-luc indicado robusto superexpressão de luciferase especificamente no coração (Figura 2A, B), que foi confirmado por análise ocidental do borrão (Figura 2), sugerindo a ausência de transdução nontarget órgão. Por outro lado, nenhuma expressão de luciferase foi detectado em ratos controle. Consistente com a bem sucedida superexpressão de luciferase, Western blot análise sugerida expressão VDR significativamente aumentada no ventrículo esquerdo de ratos injetados com adenovírus codificação VDR (VDR-adv) (Figura 3A). Além disso, injeção de adv-shVDR reduziu significativamente a expressão de VDR no ventrículo esquerdo (Figura 3B). Em contrapartida, expressão de VDR não foi significativamente alterado nos ventrículos direito nem no adv-VDR injetado ratos ou camundongos injetado adv-shVDR (Figura 3, D), porque o adenovírus foi injetado apenas o miocárdio ventricular esquerdo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57074/57074fig1.jpg"> Figura 1 . Esquema para Intramiocárdica injeção e gene expressão deteção protocolo mouse. (A) ilustração mostrando três locais de injeção no miocárdio do ventrículo esquerdo. (B) protocolo para a deteção de expressão do gene no coração de rato após a injeção do vírus indicadas. Adv-luciferase: adenovírus codificação luciferase; AdVDR: adenovírus codificação VDR; AdshVDR, adenovírus codificação shRNA alvo VDR. (C) representante imagens mostrando vários passos do método modificado para injeção Intramiocárdica de rato. r. remoção da pele por creme depilatório comercialmente disponível. b. esterilização do local cirúrgico com 3 esfrega de iodo-povidona. c. cobrindo o local cirúrgico com um pano estéril. m. incisão de 0,5 cm na pele ao longo da linha de conexão xifoide e axila. e. Blunt dissecação do peitoral maior e peitorais menores músculos com fórceps e uma pinça hemostática micro-mosquito. f. exteriorização do coração. g. injeção de solução de adenovírus 30 µ l no miocárdio do ventrículo esquerdo através da seringa Hamilton. h - i. fechamento da pele por uma sutura bolsa-sequência de caracteres com uma sutura de seda 5-0. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57074/57074fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57074/57074fig2.jpg"> Figura 2 . Deteção de expressão do luciferase no coração. Imagens do (A) coletadas pelo sistema de imagem mostrando o sinal luminescente do coração no controle de ratos e camundongos injetados com adenovírus codificação luciferase em 5 dias após a injeção. Intensidades de sinal luminescente (B) em diferentes grupos (n = 3) são submetidos à análise estatística pelo teste t . p < 0,01 contra ratos controle. (C) análise de borrão ocidental resultados mostrando luciferase níveis de proteína no coração, pulmão, fígado e baço em grupos indicam em 5 dias após a injeção de adenovírus (n = 3). Desde que a expressão do luciferase foi detectada apenas no coração de ratos Adv-luc injetado, análise estatística não foi realizada. Adv-luc: adenovírus codificação luciferase. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57074/57074fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57074/57074fig3.jpg"> Figura 3 . Deteção de expressão VDR no coração. Painel superior (A): borrão ocidental bandas apresentando níveis VDR no ventrículo esquerdo (onde é injetado o vírus adenoide) no dia 0, 5 dias, 7 dias e 14 dias após a injeção de adv-VDR. Painel inferior: análise semi-quantitativa de níveis de expressão de VDR em diferentes grupos (n = 4, por ponto de tempo). Resultados foram normalizados contra a GAPDH e convertidos para dobrar a mudança em relação ao dia 0. Unidirecional de análise de variância (ANOVA) seguido do pós-teste de Bonferroni (variâncias iguais assumidas) ou Tamhane pós-teste (variâncias iguais não assumidas) realizou-se análise estatística. p < 0,05 ou * *p < 0,01 contra 0 dias. Painel superior (B): borrão ocidental bandas apresentando níveis VDR no ventrículo esquerdo no dia 0, 3 dias, 5 dias e 7 dias após a injeção de adv-shVDR. Painel inferior: análise semi-quantitativa de níveis de expressão de VDR em diferentes grupos (n = 4, por ponto de tempo). p < 0.05 versus 0 dias. Painel superior (C): borrão ocidental bandas apresentando níveis VDR no ventrículo direito (onde o adenovírus não é injetado) no dia 0, 5 dias, 7 dias e 14 dias após a injeção de adv-VDR. Painel inferior: análise semi-quantitativa de níveis de expressão de VDR em diferentes grupos (n = 4, por ponto de tempo). (D) painel superior: borrão ocidental bandas apresentando níveis VDR no ventrículo direito no dia 0, 3 dias, 5 dias e 7 dias após a injeção de adv-shVDR. Painel inferior: análise semi-quantitativa de níveis de expressão de VDR em diferentes grupos (n = 4, por ponto de tempo). <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57074/57074fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Aqui nós apresentamos um protocolo para a manipulação do gene específico cardíaca em ratos. Sob anestesia, os corações de rato foram exteriorizados através do quarto espaço intercostal. Posteriormente, adenovírus codificação de genes específicos foram injetados com uma seringa o miocárdio, seguido por medição de expressão de proteínas via na vivo de imagem e Western blot análise.

Um método simples e eficiente para In Vivo cardíaco-específicas do Gene manipulação por injeção Intramiocárdica em ratos

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. ...

a-simple-efficient-method-for-vivo-cardiac-specific-gene-manipulation

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

15.8K visualizações.  The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College. Aqui nós apresentamos um protocolo para a manipulação do gene específico cardíaca em ratos. Sob anestesia, os corações de rato foram exteriorizados através do quarto espaço intercostal. Posteriormente, adenovírus codificação de genes específicos foram injetados com uma seringa o miocárdio, seguido por medição de expressão de proteínas via na vivo de imagem e Western blot análise.

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Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Numerous genetic manipulations and/or intramyocardial injections of genes, proteins, cells, and/or biomaterials are superimposed upon the dimension of time in studies of acute ischemia/ reperfusion injury and chronic remodeling in mice. This video illustrates the microsurgical procedures for ischemia/reperfusion, permanent coronary artery ligation, and intramyocardial injection studies.

Ligadura da artéria coronária e injeção intramiocárdica em um modelo murino de infarto

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

Medicina

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising treatment option for heart disease, owing to its efficiency and exceptional therapeutic effects. In an effort to repair the damaged tissue post-MI, various studies have employed DNA-based or viral gene therapy but have faced considerable hurdles due to the poor and uncontrolled expression of the delivered genes, edema, arrhythmia, and cardiac hypertrophy. Synthetic modified mRNA (modRNA) presents a novel gene therapy approach that offers high, transient, safe, nonimmunogenic, and controlled mRNA delivery to the heart tissue without any risk of genomic integration. Due to these remarkable characteristics combined with its bell-shaped pharmacokinetics in the heart, modRNA has become an attractive approach for the treatment of heart disease. However, to increase its effectiveness in vivo, a consistent and reliable delivery method needs to be followed. Hence, to maximize modRNA delivery efficiency and yield consistency in modRNA use for in vivo applications, an optimized method of preparation and delivery of modRNA intracardiac injection in a mouse MI model is presented. This protocol will make modRNA delivery more accessible for basic and translational research.

This protocol presents a simple and coherent way to transiently upregulate a gene of interest using modRNA after myocardial infarction in mice.

Entrega de mRNA modificado em um modelo de mouse de infarto do miocárdio

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

Genética

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue revascularization and cell survival. In addition, further observations revealed that specific stem cells, such as cardiac stem cells, mesenchymal stem cells and cardiospheres have the ability to integrate within the surrounding myocardium by differentiating into cardiomyocytes, smooth muscle cells and endothelial cells.
Here, we present the materials and methods to reliably deliver noncontractile cells into the left ventricular wall of immunodepleted mice. The salient steps of this microsurgical procedure involve anesthesia and analgesia injection, intratracheal intubation, incision to open the chest and expose the heart and delivery of cells by a sterile 30-gauge needle and a precision microliter syringe.
Tissue processing consisting of heart harvesting, embedding, sectioning and histological staining showed that intramyocardial cell injection produced a small damage in the epicardial area, as well as in the ventricular wall. Noncontractile cells were retained into the myocardial wall of immunocompromised mice and were surrounded by a layer of fibrotic tissue, likely to protect from cardiac pressure and mechanical load.

Intramyocardial cell delivery in murine models of cardiovascular diseases, such as hypertension or myocardial infarction, is widely used to test the therapeutic potential of different cell types in regenerative studies. Therefore, a detailed description and a clear visualization of this surgical procedure will help to define the limits and advantages of cardiovascular cell therapeutic analyses in small rodents.

Entrega celular intramiocárdico: Observações em murino Corações

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Sistema baseado em microinjeção para na implantação de Vivo do Cardiomyocytes embrionárias no embrião aviária

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Biologia do Desenvolvimento

Ultrasound-guided Transthoracic Intramyocardial Injection in Mice

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. Experiments involving myocardial injection are currently performed by direct surgical access through a thoracotomy. While convenient when performed at the time of another experimental manipulation such as coronary artery ligation, the need for an invasive procedure for intramyocardial delivery limits potential experimental designs. With ever improving ultrasound resolution and advanced noninvasive imaging modalities, it is now feasible to routinely perform ultrasound-guided, percutaneous intramyocardial injection. This modality efficiently and reliably delivers agents to a targeted region of myocardium. Advantages of this technique include the avoidance of surgical morbidity, the facility to target regions of myocardium selectively under ultrasound guidance, and the opportunity to deliver injectate to the myocardium at multiple, predetermined time intervals. With practiced technique, complications from intramyocardial injection are rare, and mice quickly return to normal activity on recovery from anesthetic. Following the steps outlined in this protocol, the operator with basic echocardiography experience can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

Echocardiography-guided percutaneous intramyocardial injection represents an efficient, reliable, and targetable modality for the delivery of gene transfer agents or cells into the murine heart. Following the steps outlined in this protocol, the operator can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

Guiada por ultra-som transtorácica intramiocárdico Injection em Ratos

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. ...

Transgênese baseada em eletroporação de células cardíacas em corações de camundongos

An Efficient Transgenesis Approach for Gene Delivery in the Mouse Embryonic Heart

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, and fate of these progenitors are vital for the proper development of this organ. The molecular mechanisms that govern the morphogenesis of the heart are essential for understanding the pathogenesis of congenital heart diseases and embryonic cardiac regeneration. Classical approaches to investigate these mechanisms employed the generation of transgenic mice to assess the function of specific genes during cardiac development. However, mouse transgenesis is a complex, time-consuming process that often cannot be performed to assess the role of specific genes during heart development. To address this, we have developed a protocol for efficient electroporation and culture of mouse embryonic hearts, enabling transient transgenesis to rapidly assess the effect of gain- or loss-of-function of genes involved in cardiac development. Using this methodology, we successfully overexpressed Meis1 in the embryonic heart, with a preference for epicardial cell transfection, demonstrating the capabilities of the technique.

Autor em destaque: Transgênese de células cardíacas para triagem rápida de genes

This protocol presents a detailed methodological framework for electroporation-based transgenesis of cardiac cells in developing mouse hearts. The video assets provided here will facilitate learning of this versatile technique.

Uma abordagem eficiente de transgênese para entrega de genes no coração embrionário de camundongos

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, ...

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection fraction (HFrEF). Before they can be considered for use, and implemented in humans, extensive preclinical studies are required in large animal models to evaluate the safety, efficacy, and fate of the injectate (e.g., stem cells) once delivered into the myocardium. Small rodent models offer advantages (e.g., cost effectiveness, amenability for genetic manipulation); however, given inherent limitations of these models, the findings in these rarely translate into the clinic. Conversely, large animal models such as rabbits, have advantages (e.g., similar cardiac electrophysiology compared to humans and other large animals), whilst retaining a good cost-effective balance. Here, we demonstrate how to perform a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection (IMI) technique, which is minimally invasive, safe, well tolerated, and very effective in the targeted delivery of injectates, including cells, into several locations within the myocardium of a rabbit model. For the implementation of this technique, we also have taken advantage of a widely available clinical echocardiography system. After putting in practice the protocol described here, a researcher with basic ultrasound knowledge will become competent in the performance of this versatile and minimally invasive technique for routine use in experiments, aimed at hypothesis testing of the capabilities of cardiac regenerative therapeutics in the rabbit model. Once competency is achieved, the whole procedure can be performed within 25 min after anaesthetizing the rabbit.

Novel therapeutic strategies in cardiac regenerative medicine require extensive and detailed studies in large preclinical animal models before they can be considered for use in humans. Here, we demonstrate a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection technique in rabbits, which is valuable for hypothesis testing the efficacy of such novel therapies.

Injeção de contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica e entrega de célula em uma grande maquete pré-clínicos

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and living organisms from a wide variety of species. The CRISPR technology has also been explored as novel therapeutics for a number of human diseases. Proof-of-concept data are highly encouraging as exemplified by recent studies that demonstrate the feasibility and efficacy of gene editing-based therapeutic approach for Duchenne muscular dystrophy (DMD) using a murine model. In particular, intravenous and intraperitoneal injection of the recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) has enabled efficient cardiac delivery of the Staphylococcus aureus CRISPR-associated protein 9 (SaCas9) and two guide RNAs (gRNA) to delete a genomic region with a mutant codon in exon 23 of mouse Dmd gene. This same approach can also be used to knock out the gene-of-interest and study their cardiac function in postnatal mice when the gRNA is designed to target the coding region of the gene. In this protocol, we show in detail how to engineer rAAVrh.74-CRISPR vector and how to achieve highly efficient cardiac delivery in neonatal mice.

Here we provide a detailed protocol to carry out in vivo cardiac gene editing in mice using recombinant Adeno-Associated Virus(rAAV)-mediated delivery of CRISPR. This protocol offers a promising therapeutic strategy to treat dystrophic cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy and can be used to generate cardiac-specific knockout in postnatal mice.

Entrega de mediada por vírus adeno-associado de CRISPR para Gene cardíaco em ratos de edição

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Um método simples e eficiente para In Vivo cardíaco-específicas do Gene manipulação por injeção Intramiocárdica em ratos

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Ligadura da artéria coronária e injeção intramiocárdica em um modelo murino de infarto

Entrega de mRNA modificado em um modelo de mouse de infarto do miocárdio

Entrega celular intramiocárdico: Observações em murino Corações

Sistema baseado em microinjeção para na implantação de Vivo do Cardiomyocytes embrionárias no embrião aviária

Guiada por ultra-som transtorácica intramiocárdico Injection em Ratos

Uma abordagem eficiente de transgênese para entrega de genes no coração embrionário de camundongos

Uma abordagem eficiente de transgênese para entrega de genes no coração embrionário de camundongos

Uma abordagem eficiente de transgênese para entrega de genes no coração embrionário de camundongos

Injeção de contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica e entrega de célula em uma grande maquete pré-clínicos

Entrega de mediada por vírus adeno-associado de CRISPR para Gene cardíaco em ratos de edição