Name: surface functionalization of hepatitis e virus nanoparticles using chemical conjugation methods
Uploaded: 2018-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
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著者は NIH によって迎えへの資金のスポンサーを認める許可 #' s: AI095382、EB021230、CA198880、研究所食品農業とフィンランドの識別教授はプログラム。

1 昆虫細胞で HEVNP 生産
注: すべての次の手順は、セル文化フードで行わなければなりません。詳細な HEVNP 生産手順11当社前の文書を参照してください。
<ol><li>Sf9 昆虫細胞のセル 6 ウェル プレートでの 50-75% 合流するメディア (材料表を参照してください)。</li>
	<li>組換えバキュロ ウイルスを生成する Sf99 セルに HEVNP-573 C ORF2 を含む Bacmids を transfect 製造元のプロトコルによると昆虫の細胞のトランスフェクション試薬を使用する。27 ° c transfected セルをセルの実行可能性によって、3-6 日にインキュベートします。</li>
	<li>(後に transfected セルは、バキュロ ウイルス感染による分離) P0 バキュロ ウイルス ストックとして感染後 3 〜 6 日で上清を収集します。</li>
	<li>P0 株式の 200 μ L を 25 cm2分子フラスコの 50-75% コンフルエント Sf9 細胞に適用する前に培地を削除します。接種の完全なカバレッジを確保するためには、フラスコ 15 分毎をロックします。60 分の合計 4 回を繰り返します。</li>
	<li>昆虫の細胞培養培地 2 mL をフラスコに追加および 27 ° C で 3-6 日間より高い力価をバキュロ ウイルスを増幅する細胞によって維持します。</li>
	<li>12を読んでバキュロ ウイルス力価を取得するプラクの試金を遂行します。</li>
	<li>昆虫細胞用培地フラスコ 250 mL に 100 mL で懸濁 Tn5 昆虫細胞 (材料表) の培養し、0.5 x 10 の力価に 150 rpm で 27 ° C に振る5 - 1 x 106接種のため。</li>
	<li>250 mL のフラスコで 5-10 に 100 mL Tn5 細胞のバキュロ ウイルス感染 (MOI) の多様性を追加します。接種後 5-7 日間 150 rpm で 27 ° C で横に振る。</li>
	<li>小胞を持っているようにほとんどの細胞と細胞の 70-90% は光学顕微鏡観察下で死んでいる、一度 Tn5 細胞を収集し、33 mL 遠心チューブに移します。25 ° C で 90 分 10,000 x g でバケツの回転子、バランス、および細胞の残骸や組換えバキュロ スピンダウンを振る場所、超遠心機チューブします。</li>
	<li>さらに浄化のための 4 ° C でリリースされた HEVNPs を含む上清をしてください。バキュロ ウイルス上清の拡張ストレージは、プロテアーゼ阻害剤を追加します。</li>
</ol>2. HEVNP 浄化
<ol><li>ペレットし、セシウム塩化 (CsCl) 勾配分離を使用して HEVNPs を分離できます。<ol>
<li>(ステップは 1.10) から収集した上清を転送し、20% を追加 0.5% の最終的な集中に各チューブに NP 40 NP-40 任意の残りの細胞膜を溶解します。軽くピペッティングにより混合し、25 ° C で少なくとも 30 分間インキュベート</li>
		<li>遠心上清から HEVNPs ダウン ペレットへの 4 ° C で 2 時間バケツの回転子を振る 112,400 x g で HEVNPs。遠心分離後上澄みを廃棄し、優しく再 200 μ L の 10 mM MES バッファー pH 6.2 各管内一晩 (O/N) 4 ° C での原油のペレットを中断SDS - 52 kDa のバンドとして原油のペレットの HEVNP ORF2 の存在を確認する (ステップ 3.1) のページを実行します。</li>
		<li>混合 1.96 g CsCl 38.5% (w/v) CsCl 勾配、再浮遊原油ペレット 5 mL 遠心チューブに 0.01 M MES pH 6.2 の 〜 4 mL を準備します。管のバランス、スイング バケツの回転子の場所します。4 ° C で 16 時間 147,000 × g で遠心</li>
	</ol>
</li>
	<li>CsCl 勾配後分数を収集します。<ol>
<li>主に軽量化細胞膜の破片は、トップ 500 μ L 分数を破棄します。チューブの先頭から、500 μ L の分数を収集し、各分画の間にチップの交換します。番号ラベル 1.5 mL チューブに各分画を配置します。 注: CsCl グラデーションは SDS のページ CsCl の高濃度のためのゲルを実行することによって検出できないから画の HEVNP ORF2 の存在。各分画の CsCl を削除または CsCl のクリーンアップの手順で希釈できます。また、CsCl の勾配は、10-40% ショ糖勾配13 CsCl の残留を避けるために取替えることができます。</li>
		<li>5 mL の遠心管に各画分を転送し、4.5 ml の 10 mM MES の pH 6.2 の CsCl を希釈します。管のバランス、スイング バケツの回転子の場所します。ペレット、HEVNPs ダウンへの 4 ° C で 2 時間 147,000 × g で遠心。</li>
		<li>上澄みを廃棄し、優しく再各管内 10 mM MES pH 6.2 の 100 μ L で、HEVNPs を停止します。蒸発を避けるために、, O/N 4 ° C でチューブをカバーします。</li>
		<li>分光光度計を用いた A260/A280 nm 比 A280 読書を記録します。として ORF2 のおおよその濃度を決定します。 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57020/57020eq1.jpg"> 1 システイン サイトと化学の活用のための 1 の Lys サイトそれぞれの ORF2 が含まれます。 注: HEVNP ORF2 のモル吸光係数は、60,280 1.019 mg/mL × A280 と同等であります。これは 1:1 に近く、A280 としたがって、上記式で ORF2 の濃度 (mg/mL) で HEVNPs の濃度を近似できるということ。1 の A280 読書と HEVNP が 1 mg/mL、18.8 μ M に相当する濃度を持っている例えば、ORF2。</li>
		<li>SDS ページを準備します。各画分から 6 μ L のサンプルを使用して、53.3 HEVNP ORF2 タンパク質 (ステップ 3.1) を含む分数を決定します。HEVNPs は、分数の 3-5、~1.25 グラム/mL の濃度で発見されるべき。</li>
		<li>存在と tem による HEVNPs の純度を確認してください。準備または 0.5 - 2.0 mg/mL TEM の HEVNP サンプルを薄めます。TEM で空の正二十面体蛋白質、~ 27 として表示されます、HEVNPs nm の直径 (図 2)。いくつかの蛋白質の汚染物は分数で残ることがあります、TEM (ステップ 3.2) の下で観察されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>不純物が電子顕微鏡の下で存在している場合、ステップ 2.1.3 -、HEVNPs のよい純度 2.2.6 を繰り返します。 注: CsCl 勾配によって余分な浄化 HEVNPs の歩留まり損失があります。また、CsCl 勾配浄化は残留 CsCl13を避けるために 10-40% ショ糖密度勾配によって置き換えることができます。</li>
</ol>3. HEVNP の評価
<ol><li>SDS のページ 4-12% ビス トリス タンパク質ゲル、1.0 mm、ユーザーズ マニュアル14によると 17 井戸 (材料の表を参照) を準備します。<ol>
<li>6 μ L の蛋白質のサンプルにローディングバッファー x 4 の 2 μ L を追加します。タンパク質を変性する 100 ° C で 10 分間の熱ブロックのサンプル混合物を孵化させなさい。ゲルに蛋白質のサンプルをロードします。</li>
		<li>10 分間、45 分サンプルをゲルの下端の上約 1 cm に実行までの 150 V、100 V DC 電源アダプターを設定することにより SDS のページを実行します。</li>
		<li>Coomassie 青い (0.25% (w/v) Coomassie ブリリアント ブルー R250、30% (v/v) メタノール、酢酸 10% (v/v))、1 h の SDS ページのゲルの汚れ。</li>
		<li>染色の手順後 Coomassie 青い汚れを削除し、蛋白質ゲルの重複染色バッファー (30% (v/v) メタノール、酢酸 10% (v/v)) を適用 > 室温で 12 時間。</li>
		<li>52 kDa のバンドで HEVNP ORF2 の存在を確認する白色光の下でゲルを文書化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>TEM を使用して HEVNPs を観察します。<ol>
<li>準備または 0.5 - 2 mg/mL 10 mM MES pH 6.2 TEM 画像で HEVNP サンプルを薄めます。</li>
		<li>30 40 mA グロー放電の炭素被覆グリッドをイオン化親水性炭素表面を生成する s。グロー放電装置は、材料表の説明です。 注: グリッドの親水性炭素表面だけ最後グロー後 30 分間放出できる治療。</li>
		<li>ピンセットで保持してグリッドに HEVNP サンプルの 2 μ L を追加、15-30 秒待って、ろ紙をしみ。</li>
		<li>DdH20 グリッドとろ紙をしみをすぐに洗ってください。</li>
		<li>すぐにグリッド、待機 15 秒、ろ紙をしみに酢酸 2% ウランの 2 μ L を追加します。乾燥、電子に入れてサンプル グリッド除湿 O/n 乾燥キャビネット</li>
		<li>TEM および 10-80 k 倍率で画像にグリッドを転送します。HEVNPs TEM で ~ 27 である空の正二十面体蛋白質として表示されますウイルス RNA の不在のための直径の nm。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4 ビオチン、がんをターゲット リガンド、フルオロと HEVNPs の化学の活用
<ol><li>HEVNPs とリンクしたマレイミド ビオチンの 1 つのステップの活用を実行します。<ol>
<li>バッファーの変更: ミニ透析ユニットの HEVNPs を適用し、製造元のプロトコル (材料表) に従って 1 時間室温で 0.01 M PBS pH 7.4 に対して dialyze。1.5 mL チューブに、HEVNPs を転送し、280 タンパク質濃度測定分光光度計を用いた nm。</li>
		<li>1 mg/mL、Cys 反応サイト (2.2.4 の手順で詳細を参照してください)、マレイミド ビオチン (100 μ M) を 1:5 のモル比; に 0.01 M pbs は、pH 7.4 の同量の 18.8 μ M に相当する HEVNP をミックスします。O/N を 4 ° C で反応します。製造元のプロトコル (材料表) によると 40 K MWCO スピン海水淡水化列手順を非連結したマレイミド ビオチンを削除します。</li>
		<li>SDS ページ (手順 3.1) を減らす標準的サンプルを分析します。</li>
		<li>標準的な手順を使用して、化学発光西部のしみ HRP リンク ストレプトアビジンを使用して準備します。X 線フィルム (図 2) で発光信号をキャプチャします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>HEV NPs (図 5) の表面に露出したシステインに 2 つのステップ LXY30 活用を実行します。<ol>
<li>バッファー交換: ミニ透析ユニットの HEVNPs を適用、1, 1.5 mL チューブへの転送、HEVNPs の室温で 0.01 M PBS pH 7.4 に対して dialyze し、280 タンパク質濃度を測定 nm の吸光度。</li>
		<li>200 μ M CuSO4と 1 mM アスコルビン酸マレイミド リンク LXY30 を形成すると 0.01 M PBS pH 7.4 で 650 μ M マレイミド アジと 650 μ M アルキン LXY3010を追加 (Mal LXY30) 650 μ M で 4 ° C で混合物を O/N. インキュベートします。</li>
		<li>1 mg/mL、Cys 反応サイトの 18.8 μ M に相当する HEVNP をミックス (2.2.4 の手順で詳細を参照)、約 10% のマル LXY30 のボリューム (650 μ M) 0.01 M PBS ph 7.4 では、モル比 1:3; するO/N を 4 ° C で反応します。 注: Mal LXY30 の比較的高い濃度、CuSO4など、反応の最終濃度が減少します。 約 10 倍 HEVNPs への損傷を防ぐため、混合した後。別のオプションは、Cu 無料活用法15。</li>
		<li>削除したマレイミド-クリック-LXY30 製造元のプロトコルによると 40 K MWCO スピン脱塩カラムを非連結 (材料表を参照してください)。4 ° C で LXY30 リンク HEVNPs (LXY30-HEVNPs) を維持します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>LXY30 HEVNPs や Cy5.5 NHS エステル (NHS Cy5.5) の 1 つのステップ活用を実行します。<ol>
<li>ミックス 1 mg/mL、Cys 反応サイトの 18.8 μ M に相当する LXY30 リンク HEVNPs (LXY30-HEVNPs) (2.2.4 の手順で詳細を参照)、NHS Cy5.5 の等量を (100 μ M) 0.01 M PBS ph 7.4 に 1:5 モル比;O/N を 4 ° C で反応します。</li>
		<li>削除は製造元のプロトコルによると 40 K MWCO スピン脱塩カラム プロシージャ Cy5.5 NHS を非連結 (材料表を参照してください)。4 ° C で LXY30、Cy5.5 リンク HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) を維持します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5 HEVNP へのバインディングと MDA MB231 乳癌細胞に内在
<ol><li>シード MDA MB231 乳癌細胞に 35 ミリメートルのガラス底皿 (皿あたり 5 × 104 ) 哺乳類の細胞培養のキャビネットの O/N。</li>
	<li>セルの結合実験のため次の手順 4.2 4.3 LXY30 HEVNP Cy5.5 を準備します。0.01 mg/mL、HEVNP ORF2 の 0.188 μ M に相当する LXY30 HEVNP Cy5.5 を希釈 (ステップ 2.2.4 を参照してください)、0 - 250 μ L で 1 %fbs/DMEM。<ol>
<li>NHS Cy5.5 色素のみ (HEV Cy5.5) 共役ですが、手順 4.3 HEVNP Cy5.5 の 0.01 mg を mL で否定的な制御サンプルを準備します。0.01 mg/mL、HEVNP ORF2 の 0.188 μ M に相当する HEVNP Cy5.5 を希釈 (ステップ 2.2.4 を参照)、10% の 250 μ L の FBS 添加 DMEM。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 M PBS バッファー pH 7.4 の 250 μ L を適用することによって細胞を一度洗います。細胞培養ディッシュである一部のバッファーを維持しながら、洗浄後 PBS バッファーを削除します。</li>
	<li>250 μ L LXY30 HEVNP Cy5.5 の FBS 添加 DMEM または HEVNP Cy5.5 FBS 添加 DMEM 培養 MDA MB231 乳癌細胞に 10% の 10% を適用します。シールド セルは、アルミ箔で光から料理を培養しました。</li>
	<li>キャビネット内部の 1 h の 37 ° C の細胞培養の細胞培養皿をしてください。</li>
	<li>3 回、1 M PBS、pH 7.4 の 250 μ L での洗浄あたり 5 分氷の上培養細胞を洗います。</li>
	<li>4% のセルを修復する pbs は 1 M、1 M PBS、pH 7.4 の 250 μ L で 1 回 20 分、洗いの pH 7.4 PFA。 注: セルは、共焦点顕微鏡によるイメージを作成する準備が整いました。代表的なデータは、図 5のとおりです。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ludwig, C., Wagner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-like+particles-universal+molecular+toolboxes.">Virus-like particles-universal molecular toolboxes.</a> Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).</li><li>Galaway, F. A., Stockley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS2+viruslike+particles:+a+robust,+semisynthetic+targeted+drug+delivery+platform.">MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform.</a> Mol Pharm. 10 (1), 59-68 (2013).</li><li>Ma, Y., Nolte, R. J., Cornelissen, J. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+elements+of+the+capsid+protein+for+self-assembly+into+empty+virus-like+particles+of+hepatitis+E+virus.">Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus.</a> J Virol. 79 (20), 12999-13006 (2005).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+hepatitis+E+virion-sized+particle+reveals+an+RNA-dependent+viral+assembly+pathway.">Structure of hepatitis E virion-sized particle reveals an RNA-dependent viral assembly pathway.</a> J Biol Chem. 285 (43), 33175-33183 (2010).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+configuration+of+hepatitis+E+virus+antigenic+domain.">Spatial configuration of hepatitis E virus antigenic domain.</a> J Virol. 85 (2), 1117-1124 (2011).</li><li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+characterization+of+a+high-affinity+and+high-specificity+peptide+ligand+LXY30+for+in+vivo+targeting+of+&#945;3+integrin-expressing+human+tumors.">Discovery and characterization of a high-affinity and high-specificity peptide ligand LXY30 for in vivo targeting of &#945;3 integrin-expressing human tumors.</a> EJNMMI research. 6 (1), (2016).</li><li>Li, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+self-assembly+of+empty+virus-like+particles+of+hepatitis+E+virus.">Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus.</a> J Virol. 71 (10), 7207-7213 (1997).</li><li>Peyret, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+gentle+purification+of+virus-like+particles+produced+in+plants.">A protocol for the gentle purification of virus-like particles produced in plants.</a> J Virol Methods. 225, 59-63 (2015).</li><li>Technologies, N. b. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vol. MAN0007891 1-2. , (2013).</li><li>Baskin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-free+click+chemistry+for+dynamic+in+vivo+imaging.">Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (43), 16793-16797 (2007).</li></ol>

著者は、彼らは競争の興味があることを宣言します。

週間かかる、時間がかかる遺伝子工学プロシージャと対照をなしてここに示す簡単な 2 ステップとリガンドをターゲット癌を追加する、3 日間内に完了できるワンステップ化学の活用手順や蛍光検出色素 HEVNPs のシステイン/リスのサイトへ。テクニックを使用することができます候補者のプール、したがって合理的なコストと配信時に利用可能なペプチド/小分子合成サービスの活用から最高の配位子ターゲットの画面に。
興味の蛋白質にはポリペプチドにのみ挿入できます、従来の遺伝子工学とは異なり化学の活用は、ポリペプチド、小分子化合物の表面にナノ粒子など様々 な材料を接続できる、反応サイトとして使用するシステインまたは Lys 残基がある限り、興味の蛋白質。化学活用サイトでこのような残留が、単純なシステイン/リス交換は以前の研究4で示されるように化学的にアクティブにできるように興味の蛋白質の遺伝子変更ことができます。
それを制御するには、化学の活用は共役分子と分子内反応を避けるために徹底的に勉強する必要は共役蛋白質の構造、選択的反応サイトでのみ発生します。乳がんペプチド LXY3010をターゲットとここで示したようなジスルフィド結合は環状配位子構造を安定させます。分子内反応でマレイミド、LXY30 配位子の官能基化直接マレイミドのチオール反応性は可能性を与えられます。代わりに、アルキン リンク LXY30 をクリックして化学反応とマレイミド リンク アジ化物を反応させることによって 2 つのステップの活用 (ステップ 4.2) を行った。しかし、クリックして化学反応とチオール選択反応のシーケンスは LXY30 HEVNPs (図 4) の立体配座のイヌイットの重要です。CuSO4触媒 [化学反応により LXY30 が直接行きないマレイミド舞 LXY30 を構築します。その後、舞 LXY30 抱合に HEVNP-573 C ように形作られた LXY30 HEVNPs は正二十面体構造 (図 4) を保持できます。

治療および診断の配信、nanotheranostics、として知られているナノサイズのベクターの開発は、ターゲットを絞った配信1に向かって一般的な治療から生物医学分野の多くをシフトしています。Theranostic 分子安定的に特定の病気にかかったティッシュまたは生化学的経路2,3,4 theranostic 分子を直接にターゲットを絞った nanotheranostic 配信統合ナノサイズ ベクトル (ナノ粒子).ナノメディシンは、最適なサイズのナノ粒子 theranostic 分子の循環を安定し、病気にかかったティッシュの提示細胞表面分子を選択的にターゲットする能力を持っているので、ターゲットを絞った配信の最前線に来ています。まだ多くの nanotheranostic プラットフォーム パッシブ セル吸収, 事前に成熟し劣化、毒性、および theranostic 分子と不十分な協会に苦しみます。群集は、ターゲットを絞った配信でこれらの障害の多くを克服します。彼らは外国のエピトープを表示および/または小さい分子を提供するナノキャリアとして使用されている: 療法は多くの病気1を戦うために使用することができます。このアプリケーションのプロパティに主に依存する特定のエンドユーザのために設計されたアプリケーションを満たすために、遺伝の修正の容易さだけでなく、自己集合。遺伝子工学と比較して、VLP に異質ペプチドの化学的活用のための重要な利点を表示多種多様なペプチドやオリゴ糖、変調の群集の表面に共役するなどのエンティティをことができますので、柔軟 VLP アセンブリの変化なし。
組換え HEV キャプシド蛋白質、2ndオープンから派生した HEVNPs フレーム (ORF2) を読んで、非感染性、カプシド セルの結合、およびエントリの対応を自己組み立てます。粘膜感染の HEV が進化したので組み立てカプシド蛋白はプロテアーゼ、酸性の粘膜条件5同様に安定です。HEVNPs は、T の中空を形成レンダリング非常に安定したストレージと過酷な生理的条件の両方、ORF2 の 60 の同一ユニット6,7から成る、1 の正二十面体キャプシドを =。任意のウイルスの遺伝的要素に欠けている、効率的、高収率生産はバキュロ ウイルス昆虫細胞発現システムによって実現されます。蛋白分解性が高く、自己組織化 HEVNPs を抽出され、細胞培養上清より精製した必要な精製工程を大幅に削減します。さらに、HEVNPs は安定した正二十面体ベースに柔軟なヒンジを介して接続されている表面の露出した突起ドメイン (P ドメイン) を所有しています。P ドメインは、融通がきく蝶番は、大幅に基本の正二十面体構造を損なうことがなく P ドメインを変更することが可能、正二十面体ベースの上に表面に露出したスパイクを形成します。化学変調 60 対称サイトで 60 の繰り返し単位、1 つのサイト固有の変更結果します。最近では、提案するナノ プラットフォーム配位子または theranostic 用小分子化学的に共役することができます HEVNP を使用して。これは、マレイミド リンク ペプチドや分子と反応サイトとして単一のアミノ酸を HEV VLP の突起ドメインのシステインに置き換えることによって達成されました。HEV VLP とよく研究免疫原性エピトープ8,9の前の構造の分析に基づいて、次の 5 HEV VLP アミノ酸に置き換えられたシステイン潜在的な候補として: Y485C、T489C、S533C、N573C、T586C (図 1)。透過電子顕微鏡 (TEM) 観察 (図 2)、によって確認されたその VLP 形成発現と昆虫細胞から精製後、公開されているシステイン サイトは西部によって分析されたビオチンのマレイミド リンク後のしみ活用 (図 2)。5 つの変異体の間で HEVNP-573 C はマレイミド ビオチン活用 (図 2) の最も強い信号を表示され、フォロー アップ4 (図 3) をターゲット乳癌細胞のナノキャリアとしてデモに使用されました。
このプロトコルは、表面システイン共役を通じて腫瘍ターゲット分子を HEVNPs にアタッチする化学の活用方法を示しています。我々 は N573 でシステインを含む組換え HEVNPs と腫瘍腫瘍配信対象と検出分子の共役の詳細 (HEVNP-573 C)。ペプチド、LXY3010 HEVNPs にフォーム LXY30 HEVNP (図 4) 乳房癌腫瘍をバインドする 2 段階クリック化学接合過程に着目しました。その後、N hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 いた HEVNPs を構築する LXY30 HEVNP Cy5.5 蛍光検出の両方生体外で(図 5) で別の Lys サイトに共役と体内4 。

<table><tbody><tr><td>MINI Dialysis Units, 10K MWCO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69572</td><td>mini dialysis unit</td></tr><tr><td>High Five Cells</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B85502</td><td>Tn5 cells</td></tr><tr><td>SF9 Cells&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11496015</td><td>Sf9 cells</td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11101, A11100</td><td>Baculovirus expression system</td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td><td>Life Technologies</td><td>10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024</td><td>Bacmid</td></tr><tr><td>ESF921 Insect Cell Media</td><td>Expression Systems LLC</td><td>96-001-01</td><td>insect cell media</td></tr><tr><td>Cy5.5 NHS ester, 5mg</td><td>Lumiprobe Corp</td><td>27020</td><td>Cy5.5 NHS ester</td></tr><tr><td>Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>87766</td><td>spin desalting column</td></tr><tr><td>MES Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich Chemical Co</td><td>M8250-250G</td><td>MES</td></tr><tr><td>Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes</td><td>Beckman Coulter, Inc</td><td>Depends on Rotor</td><td>ultracentrifuge tube</td></tr><tr><td>NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NPO321BOX</td><td>SDS protein gel</td></tr><tr><td>Cellfectin II Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362100</td><td>transfection reagent</td></tr><tr><td>EMS Glow Discharger</td><td>Electron Microscopy Science</td><td></td><td>glow discharger</td></tr></tbody></table>

surface functionalization of hepatitis e virus nanoparticles using chemical conjugation methods

ウイルス様粒子 (群集) は、外国のエピトープを表示および/または小さな分子の検出と様々 な病気の治療を提供するナノキャリアとして使用されています。遺伝子組み換えは、自己組織化でこのアプリケーションが依存しているし、組換え群集の腫瘍を対象としたアプリケーションを満たすためにシステイン抱合に比べ遺伝的群集に外国のペプチッドの変更だけでも、化学の活用を提供しています、重要な利点の合成ペプチドやオリゴ糖、VLP アセンブリの変更することがなく、変調かつ柔軟に群集の表面に共役するためなどのエンティティの様々 なをことができますので。
ここでは、多機能配信キャリアとして肝炎 E ウイルス粒子 (HEVNP)、モジュール化された theranostic カプセルを使用する方法を示します。HEVNPs の機能には、組織を対象とした、イメージング、および治療薬デリバリーが含まれます。HEVNP の確立の構造調査に基づき、構造的に独立して表面に露出した残基は、チオール選択的リンケージを介してマレイミド リンク化学グループの活用サイトとしてシステイン置換に選ばれました。1 つの特定のシステイン変更 HEVNP (573 アスパラギン システイン交換 aa (HEVNP-573 C)) は乳房がん細胞特異リガンド、LXY30 共役し、近赤外線 (NIR) 蛍光色素 (Cy5.5) 腫瘍ターゲットのレンダリングにラベル付け効果的な診断カプセル (LXY30-HEVNP-Cy5.5) として HEVNPs。Theranostic 配信への応用可能性を探索するよく知られている原子の構造を持つ他の高分子複合体と同様のエンジニア リング戦略を採用できます。

HEV-群集に似ているすべて形成 HEVNPs 可溶性正二十面体のカプシドを変更し、したソリューションの製造及び精製中に集計はありません。シングル ステップ マレイミド ビオチン活用、Cys の各変更の前後に HEVNPs は否定的な汚れの EM (図 2) で HEV 群集から区別されました。マレイミド ビオチン活用効率 Cys 修正 HEVNPs 最初化学発光ストレプトアビジン結合を介してウェスタンブロットでテストされました。次のマレイミド ビオチン共役, システイン表示 HEVNPs ストレプトアビジン結合信号 (図 2) に変更。
効果的な二段システイン抱合を活用を行った順序によって影響を受けていた。Α3β1 インテグリンは乳癌腫瘍細胞、合成リガンド LXY30、発現されるため α3β1 に特定の親和性では、10腫瘍を対象とした共役分子として選ばれました。LXY30 は分子間のジスルフィド; を通じて硬くてので LXY30 の直接マレイミド (MaI) を高機能化は不可能だったしたがって、自己反応性の懸念があった。代わりに、LXY30 は修飾とアルキン グループ、クリックして化学反応によりマレイミド アジにバインドします。HEV-573 C NPs は最初マレイミド アジにバインドされていたとき、LXY30-アルキン、するクリックして化学反応に続いて HEV-573 C NPs が TEM 観察 (図 4) の下で分解登場。ただし、フォーム舞 LXY30、Cys 変更 HEVNPs (LXY30-マル-Cy5.5) に舞 LXY30 活用の順に LXY30 アルキンとマレイミド アジ化の間の最初のクリック化学反応はしなかったその構造 (図 4 b) には影響を与えません。図 4は、腫瘍細胞の標的の HEVNPs の LXY30 機能化の模式図を示しています。
LXY30 配位子をターゲット乳癌に共役 HEVNPs (LXY30-HEVNPs) は、バインドされ、乳癌培養細胞に取り込まれました。NHS 機能 HEVNP にリジンの第一級アミンの結合を介して Cy5.5 蛍光染料 (NHS Cy5.5) で標識した蛍光検出、LXY30 HEVNPs と非連結 HEVNP 573Cs の-573Cs LXY30 HEVNP Cy5.5 と HEVNP Cy5.5 が適用されたに培養。乳癌細胞 (MDA-MB-231)、共焦点顕微鏡で観察。共焦点顕微鏡を用いた近赤外蛍光画像を示す LXY30 HEVNP Cy5.5 高い親和性と MDA MB 231 乳癌のセル HEVNP Cy5.5 (図 5) と比較して増加した内面をバインドします。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57020/57020fig1.jpg"> 図 1: E 型肝炎ウイルス粒子の表面突起ドメインのシステイン置換します。システインの変異が残基 Y485、T489、S533、N573 と T586 フレキシブル コイル領域で HEV ORF2 の二次構造への影響を最小限に抑えるために提案された (A)。システインの変異のすべての選択した残基、突起 (P) ドメインの表面に位置して (灰色; 他のドメインは、シェル (S) - 青と中間 (M) ドメイン - ピンクのドメイン)、Y485 (シアン)、T489 (黄色)、T586 (オレンジ) の一番外側の残基表面、残渣 S533 (マゼンタ) と N573 (レッド) HEVNP (B) の 5 倍の軸を直面している側。図は、許可を得て 2016年4陳らから変更されています。<a href="/files/ftp_upload/57020/57020fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57020/57020fig2.jpg"> 図 2: HEVNPs を変更してすべてのシステインの例として N573C を運ぶ HEVNP の特性。HEVNP-573 C 電子顕微鏡写真 (A) の球状の突起として登場し、マル biotinylating (B) 後そのまま粒子として残った。システイン変更 HEVNPs の活用及びエピトープの露出の代表の結果。システイン マレイミド カップリングを介してマレイミド ビオチンにバインドされ、ストレプトアビジン結合の西部のしみをその後試金されます。N573 でシステインの変異許可他変異サイト、すなわちY485、T489、S533、および T586 と比較して HEVNP に効率的なビオチン化 (C)。バーの equals 100 nm。<a href="/files/ftp_upload/57020/57020fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57020/57020fig3.jpg"> 図 3: Cy5.5 ラベル LXY30-HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) でとりわけ目標とされる乳癌細胞の模式。LXY30 HEVNP Cy5.5 選択にバインド乳癌細胞 (マゼンタ) α3β1、LXY30 の特異性のため乳房癌細胞膜に過剰発現インテグリンです。<a href="/files/ftp_upload/57020/57020fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57020/57020fig4.jpg"> 図 4: チオール-選択的反応や銅触媒アジ化物アルキンの環化付加反応、LXY30 HEVNPs を構築する 'クリックケミストリー' 反応など 2 段階化学接合プロセスの概略図です。2 つの方法をテストされています。方法 1: 銅触媒のアジ化物アルキン環化付加反応マル アジドとアルキン LXY30 フォーム マル リンク LXY30 (Mal LXY30) が最初に実行されました。その後マル LXY30 は HEV-573 C NPs (A) のシステイン サイトと反応に追加されました。LXY30 や Cy5.5 HEV-573 C NPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) すべての後にそのまま残ったこれらの化学接合プロセス (B) を装飾されています。方法 2: 接合過程マル リンク アジド (マル アジ化) のラベル化による LXY30 アルキン, アスコルビン酸, CuSO 4を追加することによって続いてアジ化リンク HEVNPs (アジ化-HEVNPs) を構築するチオール選択的反応による HEV-573 C NPs のシステインのサイトで開始します。LXY30 リンク HEVNPs (LXY30-HEVNPs) (A) を形成します。ただし、ほとんど LXY30 HEVNPs は壊れているか、アジ、アスコルビン酸、CuSO4 (C) など、反応性の試薬によって引き起こされるかもしれない活用のプロセスから分解されました。マル: マレイミド。この図は、アクセス許可を持つ 2016年4陳らから変更されています。<a href="/files/ftp_upload/57020/57020fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57020/57020fig5.jpg"> 図 5: セルの結合と内面化の代表の結果は、蛍光 MDA MB 231 乳癌細胞に結合する LXY30-HEVNPs をラベルします。LXY30-HEVNP-Cy5.5 MDA MB 231 セルにターゲットの近赤外蛍光画像。共焦点レーザー蛍光顕微鏡で染色 DAPI (青)、核の信号と Cy5.5 (赤) の信号に買収されました。この図は、アクセス許可を持つ 2016年4陳らから変更されています。<a href="/files/ftp_upload/57020/57020fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

化学の活用方法を使用して E 型肝炎ウイルスのナノ粒子の表面化学

我々 は、theranostic ナノ粒子 (HEVNP) として肝炎 E のウイルスのカプシド蛋白を設計しました。HEVNP 自己粘膜配信で安定した正二十面体のケージにアセンブルします。ここでは、表面に露出したシステインは、とりわけ腫瘍細胞を結合する配位子の合成を共役残基の変異を対象とした腫瘍に対する HEVNPs の変更について述べる。

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

surface-functionalization-hepatitis-e-virus-nanoparticles-using

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.8K ビュー.  University of California Davis. 我々 は、theranostic ナノ粒子 (HEVNP) として肝炎 E のウイルスのカプシド蛋白を設計しました。HEVNP 自己粘膜配信で安定した正二十面体のケージにアセンブルします。ここでは、表面に露出したシステインは、とりわけ腫瘍細胞を結合する配位子の合成を共役残基の変異を対象とした腫瘍に対する HEVNPs の変更について述べる。

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Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

のためのウイルス粒子<emインビボ&gt;</em&gt;腫瘍イメージング

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

生物工学

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

HCVの制限要因を発見するヘテロカリオンの形成の2つの方法

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

免疫・感染学

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic applications and vaccine development.1,2,3 Current approaches to modifying viral surfaces, which are mostly genetics-based, often suffer from attenuation of virus production, infectivity and cellular transduction.4,5 Using chemoselective click chemistry, we have developed a straightforward alternative approach which sidesteps these issues while remaining both highly flexible and accessible.1,2
The goal of this protocol is to demonstrate the effectiveness of using bioorthogonal click chemistry to modify the surface of adenovirus type 5 particles. This two-step process can be used both therapeutically1 or analytically,2,6 as it allows for chemoselective ligation of targeting molecules, dyes or other molecules of interest onto proteins pre-labeled with azide tags. The three major advantages of this method are that (1) metabolic labeling demonstrates little to no impact on viral fitness,1,7 (2) a wide array of effector ligands can be utilized, and (3) it is remarkably fast, reliable and easy to access.1,2,7
In the first step of this procedure, adenovirus particles are produced bearing either azidohomoalanine (Aha, a methionine surrogate) or the unnatural sugar O-linked N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), both of which contain the azide (-N3) functional group. After purification of the azide-modified virus particles, an alkyne probe containing the fluorescent TAMRA moiety is ligated in a chemoselective manner to the pre-labeled proteins or glycoproteins. Finally, an SDS-PAGE analysis is performed to demonstrate the successful ligation of the probe onto the viral capsid proteins. Aha incorporation is shown to label all viral capsid proteins (Hexon, Penton and Fiber), while O-GlcNAz incorporation results in labeling of Fiber only.
In this evolving field, multiple methods for azide-alkyne ligation have been successfully developed; however only the two we have found to be most convenient are demonstrated herein &#x2013; strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) and copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) under deoxygenated atmosphere.

Adenovirus particles are engineered to contain either the unnatural amino acid analogue azidohomoalanine or the azido sugar O-GlcNAz. The azide group of each is chemoselectively ligated via "click" chemistry reactions as a means of viral surface modification.

Bioorthogonalクリックケミストリーを介したウイルス表面の化学選択的修飾

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach in&#160;vaccine design. Antigen is delivered to DC via antibodies specific for endocytosis receptors such as DEC-205 that induce uptake, processing, and MHC class I- and II-presentation.
Efficient and reliable conjugation of the desired antigen to a suitable antibody is a critical step in DC targeting and among other factors depends on the format of the antigen. Chemical conjugation of&#160;full-length protein to purified antibodies is one possible strategy. In the past, we have successfully established cross-linking of the model antigen ovalbumin (OVA) and a DEC-205-specific IgG2a antibody (&#945;DEC-205)&#160;for in vivo DC targeting studies in mice. The first step of the protocol is the purification of the antibody from the supernatant of the NLDC (non-lymphoid dendritic cells)-145 hybridoma by affinity chromatography. The purified antibody is activated for chemical conjugation by sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate) while at the same time the sulfhydryl-groups of the OVA protein are exposed through incubation with TCEP-HCl (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride). Excess TCEP-HCl and sulfo-SMCC are removed and the antigen is mixed with the activated antibody for overnight coupling. The resulting &#945;DEC-205/OVA conjugate is concentrated and freed from unbound OVA. Successful conjugation of OVA to &#945;DEC-205 is verified by western blot analysis and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
We have successfully used chemically crosslinked &#945;DEC-205/OVA to induce cytotoxic T cell responses in the liver and to compare different adjuvants for their potential in inducing humoral and cellular immunity following in vivo targeting of DEC-205+ DC. Beyond that, such chemically coupled antibody/antigen conjugates offer valuable tools for the efficient induction of vaccine responses to tumor antigens and have been proven to be superior to classical immunization approaches regarding the prevention and therapy of various types of tumors.

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

We describe a protocol for the chemical conjugation of the model antigen ovalbumin to an endocytosis receptor-specific antibody for in vivo dendritic cell targeting. The protocol includes purification of the antibody, chemical conjugation of the antigen, as well as purification of the conjugate and the verification of efficient conjugation.

インビボおよびインビボでマウス樹状細胞を標的とする全長タンパク質を用いた精製DEC-205指向抗体の化学的結合

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

がん研究

Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection

In the present work, the synthesis of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) and its conjugation with deferoxamine, a siderophore recognized by Yersinia enterocolitica, using a succinyl moiety as a linker are described.
Magnetic nanoparticles (MNP) of magnetite (Fe3O4) were prepared by solvothermal method and coated with SiO2 (MNP@SiO2) using the St&#246;ber process followed by functionalization with APTES (MNP@SiO2@NH2). Then, feroxamine was conjugated with the MNP@SiO2@NH2 by carbodiimide coupling to give MNP@SiO2@NH2@Fa. The morphology and properties of the conjugate and intermediates were examined by eight different methods including powder X-Ray diffraction (XRD), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), Raman spectroscopy, X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), transmission electron microscopy (TEM) and energy dispersive X-Ray (EDX) mapping. This exhaustive characterization confirmed the formation of the conjugate. Finally, in order to evaluate the capacity and specificity of the nanoparticles, they were tested in a capture bacteria assay using Yersinia enterocolitica.

This work describes protocols for the preparation of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) and its conjugation with deferoxamine using a succinyl moiety as a linker. A deep structural characterization description and a capture bacteria assay using Y. enterocolitica for all the intermediate nanoparticles and the final conjugate are also described in detail.

機能化された磁気ナノ粒子の合成、その結合とゼリロフォア・フェロキサミンの評価

In the present work, the synthesis of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with ...

化学

A Competent Hepatocyte Model Examining Hepatitis B Virus Entry through Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide as a Therapeutic Target

Hepatitis B virus (HBV) infection has been considered a crucial risk factor for hepatocellular carcinoma. Current treatment can only lessen the viral load but not result in complete remission. An efficient hepatocyte model for HBV infection would offer a true-to-life viral life cycle that would be crucial for the screening of therapeutic agents. Most available anti-HBV agents target lifecycle stages post viral entry but not before viral entry. This protocol details the generation of a competent hepatocyte model capable of screening for therapeutic agents targeting pre-viral entry and post viral entry lifecycle stages. This includes the targeting of sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) binding, cccDNA formation, transcription, and viral assembly based on imHC or HepaRG as host cells. Here, the HBV entry inhibition assay used curcumin to inhibit HBV binding and transporting functions via NTCP. The inhibitors were evaluated for binding affinity (KD) with NTCP using isothermal titration calorimetry (ITC)-a universal tool for HBV drug screening based on thermodynamic parameters.

We present a protocol to screen anti-hepatitis B virus (HBV) compounds targeting pre- and post-viral entry lifecycle stages, using isothermal titration calorimetry to measure binding affinity (KD) with host sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Antiviral efficacy was determined through the suppression of viral lifecycle markers (cccDNA formation, transcription, and viral assembly).

治療標的としてのタウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチドを介したB型肝炎ウイルス侵入を調べるコンピテント肝細胞モデル

Hepatitis B virus (HBV) infection has been considered a crucial risk factor for hepatocellular carcinoma. Current treatment can only lessen the viral load ...

生化学

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to prevent and treat sexually transmitted infections (STIs). Moreover, many EF technologies focus on encapsulating the active agent, relative to utilizing the surface to impart biofunctionality. Here we describe a method to fabricate and surface-modify poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA) electrospun fibers, with the potent antiviral lectin Griffithsin (GRFT). PLGA is an FDA-approved polymer that has been widely used in drug delivery due to its outstanding chemical and biocompatible properties. GRFT is a natural, potent, and safe lectin that possesses broad activity against numerous viruses including human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). When combined, GRFT-modified fibers have demonstrated potent inactivation of HIV-1 in vitro. This manuscript describes the methods to fabricate and characterize GRFT-modified EFs. First, PLGA is electrospun to create a fiber scaffold. Fibers are subsequently surface-modified with GRFT using 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS)chemistry. Scanning electron microscopy (SEM) was used to assess the size and morphology of surface-modified formulations. Additionally, a gp120 or hemagglutinin (HA)-based ELISA may be used to quantify the amount of GRFT conjugated to, as well as GRFT desorption from the fiber surface. This protocol can be more widely applied to fabricate fibers that are surface-modified with a variety of different proteins.

This manuscript describes the procedure to fabricate and characterize Griffithsin-modified poly(lactic-co-glycolic acid) electrospun fibers that demonstrate potent adhesive and antiviral activity against human immunodeficiency virus type 1 infection in vitro. Methods used to synthesize, surface-modify, and characterize the resulting morphology, conjugation, and desorption of Griffithsin from surface-modified fibers are described.

作製と評価 Griffithsin 変更繊維足場の防止のため性的感染

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry

The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, genetic programmability, and biodegradability. While they&#39;re highly amenable to bioconjugation reactions for adding synthetic ligands onto their surface, the range in bioconjugation methodologies on these aqueous born capsids is relatively limited. To facilitate the direction of functional biomaterials research, non-traditional bioconjugation reactions must be considered. The reaction described in this protocol uses dibromomaleimides to introduce new functionality in the solvent exposed disulfide bonds of a VLP based upon Bacteriophage Q&#946;. Furthermore, the final product is fluorescent, which has the added benefit of generating a trackable in vitro probe using a commercially available filter set.

Here, we present a procedure to fluorescently functionalize the disulfides on Q&#946; VLP with dibromomaleimide. We describe Q&#946; expression and purification, the synthesis of dibromomaleimide-functionalized molecules, and the conjugation reaction between dibromomaleimide and Q&#946;. The resulting yellow fluorescent conjugated particle can be used as a fluorescence probe inside cells.

Dibromomaleimide 二硫化化学蛍光ペグインターフェロン ウイルス様粒子を抱合誘導を作る

The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, ...

Biofunctionalization of Magnetic Nanomaterials

Magnetic nanomaterials have received great attention in different biomedical applications. Biofunctionalizing these nanomaterials with specific targeting agents is a crucial aspect to enhance their efficacy in diagnostics and treatments while minimizing the side effects. The benefit of magnetic nanomaterials compared to non-magnetic ones is their ability to respond to magnetic fields in a contact-free manner and over large distances. This allows to guide or accumulate them, while they can also be monitored. Recently, magnetic nanowires (NWs) with unique features were developed for biomedical applications. The large magnetic moment of these NWs enables a more efficient remote control of their movement by a magnetic field. This has been utilized with great success in cancer treatment, drug delivery, cell tracing, stem cell differentiation or magnetic resonance imaging. In addition, the NW fabrication by template-assisted electrochemical deposition provides a versatile method with tight control over the NW properties. Especially iron NWs and iron-iron oxide (core-shell) NWs are suitable for biomedical applications, due to their high magnetization and low toxicity.
In this work, we provide a method to biofunctionalize iron/iron oxide NWs with specific antibodies directed against a specific cell surface marker that is overexpressed in a large number of cancer cells. Since the method utilizes the properties of the iron oxide surface, it is also applicable to superparamagnetic iron oxide nanoparticles. The NWs are first coated with 3-aminopropyl-tri-ethoxy-silane (APTES) acting as a linker, which the antibodies are covalently attached to. The APTES coating and the antibody biofunctionalization are proven by electron energy loss spectroscopy (EELS) and zeta potential measurements. In addition, the antigenicity of the antibodies on the NWs is tested by using immunoprecipitation and western blot. The specific targeting of the biofunctionalized NWs and their biocompatibility are studied by confocal microscopy and a cell viability assay.

In this work, we provide a protocol to biofunctionalize magnetic nanomaterials with antibodies for specific cell targeting. As examples, we utilize iron nanowires to target cancer cells.

磁性ナノ材料の生体機能化

Magnetic nanomaterials have received great attention in different biomedical applications. Biofunctionalizing these nanomaterials with specific targeting ...

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions between mannosylated peptides and CV-N's high-affinity binding site. Virus envelope spikes gp120, HA, and Ebola glycoprotein (GP) 1,2 have been reported to bind both high- and low-affinity binding sites on dimeric CVN2. Dimannosylated HA peptide is also bound at the two low-affinity binding sites to an engineered molecule of CVN2, which is bearing a high-affinity site for the respective ligand and mutated to replace a stabilizing disulfide bond in the carbohydrate-binding pocket, thus confirming multivalent binding. HA binding is shown to one high-affinity binding site of pseudo-antibody CVN2 at a dissociation constant (KD) of 275 nM that further neutralizes human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) through oligomerization. Correlating the number of disulfide bridges in domain-swapped CVN2, which are decreased from 4 to 2 by substituting cystines into polar residue pairs of glutamic acid and arginine, results in reduced binding affinity to HA. Among the strongest interactions, Ebola GP1,2 is bound by CVN2 with two high-affinity binding sites in the lower nanomolar range using the envelope glycan without a transmembrane domain. In the present study, binding of the multispecific monomeric CV-N to severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike (S) glycoprotein is measured at KD = 18.6 &#181;M as compared with nanomolar KD to those other virus spikes, and via its receptor-binding domain in the mid-&#181;-molar range.

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

The present protocol describes new tools for SPR binding assays to examine CV-N binding to HA, S glycoprotein, related hybrid-type glycans, and high-mannose oligosaccharides. SPR is used to determine the KD for binding either dimeric or monomeric CV-N to these glycans.

表面プラズモン共鳴 による 抗ウイルス剤のエンジニアリング

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...

化学の活用方法を使用して E 型肝炎ウイルスのナノ粒子の表面化学

要約

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のためのウイルス粒子

HCVの制限要因を発見するヘテロカリオンの形成の2つの方法

Bioorthogonalクリックケミストリーを介したウイルス表面の化学選択的修飾

インビボおよびインビボでマウス樹状細胞を標的とする全長タンパク質を用いた精製DEC-205指向抗体の化学的結合

機能化された磁気ナノ粒子の合成、その結合とゼリロフォア・フェロキサミンの評価

治療標的としてのタウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチドを介したB型肝炎ウイルス侵入を調べるコンピテント肝細胞モデル

作製と評価 Griffithsin 変更繊維足場の防止のため性的感染

Dibromomaleimide 二硫化化学蛍光ペグインターフェロンウイルス様粒子を抱合誘導を作る

磁性ナノ材料の生体機能化

表面プラズモン共鳴による抗ウイルス剤のエンジニアリング

化学の活用方法を使用して E 型肝炎ウイルスのナノ粒子の表面化学

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のためのウイルス粒子

HCVの制限要因を発見するヘテロカリオンの形成の2つの方法

Bioorthogonalクリックケミストリーを介したウイルス表面の化学選択的修飾

インビボおよびインビボでマウス樹状細胞を標的とする全長タンパク質を用いた精製DEC-205指向抗体の化学的結合

機能化された磁気ナノ粒子の合成、その結合とゼリロフォア・フェロキサミンの評価

治療標的としてのタウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチドを介したB型肝炎ウイルス侵入を調べるコンピテント肝細胞モデル

作製と評価 Griffithsin 変更繊維足場の防止のため性的感染

Dibromomaleimide 二硫化化学蛍光ペグインターフェロン ウイルス様粒子を抱合誘導を作る

磁性ナノ材料の生体機能化

表面プラズモン共鳴 による 抗ウイルス剤のエンジニアリング

Dibromomaleimide 二硫化化学蛍光ペグインターフェロンウイルス様粒子を抱合誘導を作る

表面プラズモン共鳴による抗ウイルス剤のエンジニアリング