저자 인정 NIH에 의해 RHC를 자금 후원 # 부여 ' s AI095382, EB021230, CA198880, 국립 연구소의 식품 및 농업, 뿐만 아니라 핀란드 존경 하는 교수 프로그램:.

1. HEVNP 곤충 세포에서 생산
참고: 다음 단계를 모두 셀 문화 후드에서 수행 되어야 합니다. 더 자세한 HEVNP 생산 절차11에 대 한 우리의 이전 게시를 참조 하십시오.
<ol><li>곤충 세포 미디어 ( 재료의 표참조) 50-75% 합류 6 잘 플레이트에서 Sf9 셀 문화.</li>
	<li>곤충 세포 transfection 시 약 제조업체의 프로토콜에 따라 사용 하 여, transfect 재조합 잠재 생산 HEVNP-573 C ORF2 Sf99 셀에 포함 된 Bacmids. 세포의 생존 능력에 따라 3-6 일 동안 27 ° C에서 transfected 세포를 품 어.</li>
	<li>P0 잠재 주식으로 감염 된 후 3-6 일에 상쾌한 (후 transfected 세포는 잠재 감염 lysed)를 수집 합니다.</li>
	<li>50-75% confluent Sf9 셀 25 cm2 단층 플라스 크에 P0 재고의 200 µ L를 적용 하기 전에 문화 매체를 제거 합니다. inoculum의 전체 범위를 보장 하기 위해 플라스 크 매 15 분을 바위. 60 분 총 4 회를 반복 한다.</li>
	<li>플라스 크에 곤충 세포 배양 매체의 2 개 mL를 추가 하 고 증폭 높은 titer에 잠재 하는 세포의 생존 능력에 따라 3-6 일, 27 ° C에서 유지.</li>
	<li>읽기12잠재 titer를 패 분석 실험을 실시 합니다.</li>
	<li>250 mL 플라스 크에 곤충 세포 매체의 100 mL와 함께 정지 Tn5 곤충 세포 (자료 테이블) 문화 및 0.5 x 10의 titer 150 rpm에서 27 ° C에서 흔들어5 -1 x 106 접종에 대 한.</li>
	<li>250 mL 플라스 크에 5-10 ~ 100 mL Tn5 셀의 잠재 감염 (MOI)의 다양성에 추가 합니다. 접종, 후 5-7 일 동안 150 rpm에서 27 ° C에서 흔들어.</li>
	<li>일단 대부분 셀 소포를 나타나고 셀의 70-90%는 광학 현미경 관찰에서 죽은, Tn5 세포를 수집 하 고 33 mL ultracentrifuge 튜브로 전송. 장소는 ultracentrifuge 25 ° c.에 90 분 10000 x g에서 양동이 터, 균형, 그리고 세포 파편과 재조합 baculoviruses 아래로 회전 스윙에 관</li>
	<li>더 정화 4 ° C에서 출시 된 HEVNPs를 포함 하는 상쾌한을 유지. 표면에 뜨는 잠재의 확장된 스토리지에 대 한 protease 억제제를 추가 합니다.</li>
</ol>2. HEVNP 정화
<ol><li>펠 렛 및 세 슘 염화 물 (CsCl) 그라데이션 분리를 사용 하 여 HEVNPs를 분리:<ol>
<li>(1.10 단계)에서 수집 된 상쾌한을 전송 하 고 20% 추가 0.5%의 최종 농도 만들기 위해 각 관으로 NP-40 모든 나머지 세포 막 분해 NP-40. 부드럽게 pipetting으로 혼합 및 25 ° c.에 적어도 30 분 동안 품 어</li>
		<li>Ultracentrifuge는 상쾌한에서 HEVNPs 아래로 작은 하 4 ° C에서 2 시간에 대 한 양동이 터 스윙에 112,400 x g에서 HEVNPs. 원심 분리 후에 상쾌한을 삭제 하 고 부드럽게 200 µ L 10 mM MES 버퍼 pH 6.2 하룻밤 각 튜브의 (O/N) 4 ° c.에에서 다시 원유 펠 릿을 일시 중단 SDS 페이지 (3.1 단계) 52 kDa 밴드로 원유 펠 릿에 HEVNP ORF2의 존재 확인을 실행 합니다.</li>
		<li>혼합 1.96 g CsCl 38.5% (w/v) CsCl 그라데이션, 다시 일시 중단 된 원유 펠 릿과 5 mL ultracentrifuge 튜브에 0.01 M MES pH 6.2 ~ 4 mL를 준비 합니다. 튜브를 균형과 진동 물통 회전자에 놓습니다. 4 ° c.에 16 h x g 147,000 ultracentrifuge</li>
	</ol>
</li>
	<li>CsCl 그라데이션 후 분수를 수집:<ol>
<li>최고 500 µ L 분수는 주로 경량 세포 막 파편을 삭제 합니다. 튜브의 상단에서 시작 하는 500 µ L 분수를 수집 하 고 각 분수 사이 팁을 변경. 번호 표시 1.5 mL 튜브에 각 분수를 놓습니다. 참고: 존재의 HEVNP ORF2 분수 CsCl 그라데이션 젤 CsCl의 높은 농도 때문에 SDS 페이지를 실행 하 여 검출 될 수 없다에서 분리에. 각 분수에서 CsCl 제거 하거나 CsCl 정리 절차에 따라 희석 될 수 있습니다. 또는, CsCl 그라디언트는 10-40% 자당 그라데이션13 CsCl 잔류 방지를 교체할 수 있습니다.</li>
		<li>5 mL ultracentrifuge 관에 각 분수를 전송 및 10mm MES, pH 6.2 4.5 mL와 CsCl 희석. 튜브를 균형과 진동 물통 회전자에 놓습니다. Ultracentrifuge는 HEVNPs 아래 작은 하 4 ° C에서 2 h 147,000 x g에서.</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 부드럽게 다시 각 관에서 10 mM MES pH 6.2의 100 µ L에는 HEVNPs를 일시 중단. 증발을 방지 하 고 O/N 4 ° c.에 품 어 튜브 커버</li>
		<li>A280 읽기 및 A260/A280 nm 비율을 분 광 광도 계를 사용 하 여 기록 합니다. 로 ORF2의 대략적인 농도를 결정 합니다. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57020/57020eq1.jpg"> 각 ORF2 1 Cys 사이트 및 화학 활용에 대 한 1 리스 사이트 포함 됩니다. 참고: HEVNP ORF2의 어 금 니 소멸 계수는 60,280, 1.019 mg/mL × A280에 해당. 이것이 정말 1: 1에 가까운 HEVNPs의 농도 (mg/mL)에서 A280, 그리고 그러므로, 위의 방정식으로 ORF2의 농도 의해 접근 될 수 있는. 예를 들어 1 A280 읽기와 HEVNP의 18.8 µ M에 1 mg/mL 농도 해야한다 ORF2.</li>
		<li>SDS 페이지를 준비 합니다. 각 부분에서 6 µ L 샘플을 사용 하 여 53.3 HEVNP ORF2 kDa 단백질 (3.1 단계)를 포함 하는 분수 결정. HEVNPs ~1.25 g/mL의 조밀도 가진 3-5, 분수에서 찾을 수 합니다.</li>
		<li>존재와 가장 관찰에 의해 HEVNPs의 순도 확인 합니다. 준비 또는 0.5-2.0 mg/mL 가장에 대 한 HEVNP 샘플을 희석. HEVNPs 가장 빈 icosahedral 단백질, ~ 27로 표시 nm 직경 (그림 2). 일부 단백질 오염 물질 분수에 남아 있을 수 있습니다 그리고 가장 (3.2 단계)에서 관찰 될 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가장 아래 불순물 있는지 경우에 단계 2.1.3-2.2.6는 HEVNPs의 더 나은 순수성에 대 한 반복 합니다. 참고: 추가 정화 CsCl 그라디언트를 통해 HEVNPs의 수확량 손실을 발생할 수 있습니다. 또는, CsCl 그라데이션 정화를 피하기 위해 잔여 CsCl1310-40% 자당 그라데이션 하 여 교체할 수 있습니다.</li>
</ol>3. HEVNP 특성
<ol><li>SDS 페이지 4-12% 두번째-트리 스 단백질 젤, 1.0 m m, 17-웰 스 ( 재료의 표참조)에 따라 사용자의 수동14준비:<ol>
<li>6 µ L의 단백질 견본 버퍼를 로드 x 4의 2 µ L를 추가 합니다. 단백질 변성을 100 ° C에서 10 분 동안 열 블록에 샘플 혼합물을 품 어. 젤에 단백질 샘플을 로드 합니다.</li>
		<li>100 V 10 분, 45 분 샘플 젤의 바닥 위에 약 1 cm 실행 될 때까지 다음 150 V DC 전원 공급 장치를 설정 하 여 SDS 페이지를 실행 합니다.</li>
		<li>얼룩 Coomassie 파란 (0.25% (w/v) Coomassie 화려한 블루 R250, 30% (v/v) 메탄올, 10% (v/v) 초 산), 1 시간에 대 한 SDS 페이지 젤.</li>
		<li>얼룩 절차 후 Coomassie 파란 얼룩을 제거 하 고 적용에 대 한 단백질 젤 드 얼룩 버퍼 (30% (v/v) 메탄올, 10% (v/v) 초 산) > 실 온에서 12 h.</li>
		<li>52 kDa 밴드에서 HEVNP ORF2의 존재를 확인 하는 하얀 빛 아래에서 젤을 문서화 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가장을 사용 하 여 HEVNPs를 관찰 합니다.<ol>
<li>준비 또는 0.5-10 m m MES ph 6.2 편 영상 2 mg/mL HEVNP 샘플을 희석.</li>
		<li>탄소 코팅 그리드 30 40 mA 글로우 방전으로 이온화 친수성 탄소 표면 생산 하는 s. 글로우 방전 장비 재료의 테이블에에서 설명 되어 있습니다. 참고: 격자의 친수성 탄소 표면 수 마지막만 놀 후 30 분 동안 방전 처리.</li>
		<li>족집게에 및 HEVNP 샘플의 2 µ L를 눈금에 추가, 15-30 s 때까지 기다리는 누른 필터 종이 되 리.</li>
		<li>즉시 씻어 ddH20 그리드와 필터 종이 오.</li>
		<li>바로 그리드, 대기 15 s, 다음 필터 종이 오 2 %uranyl 아세테이트의 2 µ L를 추가 합니다. 건조는 전자에 의해 샘플 격자 습기 없애십시오 건조 캐비닛을 O/북 아 일에 대 한</li>
		<li>가장 및 10-80 k 확대 이미지에 그리드를 전송 합니다. HEVNPs ~ 27은 빈 icosahedral 단백질으로 가장에 나타납니다 nm 직경, 바이러스 성 RNA의 부재 때문에.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 화학 활용 Biotin, 암 타겟팅 Ligand와 Fluorophores HEVNPs
<ol><li>HEVNPs 및 maleimide 연결 biotin의 한 단계 활용을 수행 합니다.<ol>
<li>버퍼링 변경: 미니 투 석 단위에 HEVNPs를 적용 하 고 제조 업체의 프로토콜 (자료 테이블)에 따라 1 시간에 대 한 실 온에서 0.01 M PBS pH 7.4에 대 한 dialyze. 1.5 mL 튜브에는 HEVNPs를 전송 하 고 280에서 단백질 농도 측정 nm는 분 광 광도 계를 사용 하 여.</li>
		<li>1 mg/ml, Cys 반응 (단계 2.2.4 세부 정보 참조), 사이트 maleimide-비타민 b 복합체 (100 µ M)에서 0.01 M PBS, pH 7.4, 어 금 니 비율 1:5; 수 있도록 동일한 금액의 18.8 µ M에 HEVNP를 혼합 O/N 4 ° c.에 반응 제조 업체의 프로토콜 (자료 테이블)에 따라 40 K MWCO 스핀 Desalting 열 절차와 언바운드 maleimide biotin을 제거 합니다.</li>
		<li>SDS 페이지 (3.1 단계) 감소 표준 통해 샘플을 분석 합니다.</li>
		<li>표준 절차를 사용 하 여 한 chemiluminescent 서쪽 오 점 Streptavidin HRP 연결을 사용 하 여 준비 합니다. X 레이 필름 (그림 2)에 의해 chemiluminescent 신호를 캡처.</li>
	</ol>
</li>
	<li>HEV NPs (그림 5)에 표면 노출 시스테인을 LXY30 활용 2 단계를 수행 합니다.<ol>
<li>교환 버퍼: 미니 투 석 단위에 HEVNPs를 적용 하 고 1 h. 1.5 mL 튜브에는 HEVNPs 전송에 대 한 실 온에서 0.01 M PBS pH 7.4에 대 한 dialyze 280에서 단백질 농도 측정 nm는 분 광 광도 계를 사용 하 여.</li>
		<li>200 µ M CuSO4 와 1mm ascorbic 산 maleimide에 연결 된 LXY30를 0.01 M PBS pH 7.4에에서 650 µ M maleimide-아 지 드와 650 µ M alkyne LXY3010 추가 (말-LXY30) 650 µ M. O/북 아 일에 대 한 4 ° C에 혼합물을 품 어</li>
		<li>1 mg/ml, Cys 반응 사이트의 18.8 µ M에 HEVNP 혼합 (단계 2.2.4 세부 정보 참조), 약 10% 말 LXY30의 볼륨 (650 µ M) 0.01 M PBS ph 7.4, 어 금 니 비율 1:3; 수 있도록 O/N 4 ° c.에 반응 참고: 말-LXY30의 상대적으로 높은 농도 때문 CuSO4, 같은 반응의 최종 농도 HEVNPs 그들의 손상을 방지 하려면 혼합 후 약 10 배를 감소 된다. 또 다른 옵션은 Cu 무료 활용 방법15.</li>
		<li>제거 언바운드 maleimide-클릭-LXY30 제조 업체의 프로토콜에 따라 40 K MWCO 스핀 담 열 ( 재료의 표참조). 4 ° c.에 LXY30 연결 HEVNPs (LXY30-HEVNPs)를 유지</li>
	</ol>
</li>
	<li>LXY30-HEVNPs 및 에스테 르 Cy5.5 보 건국 (NHS-Cy5.5)의 한 단계 활용 수행<ol>
<li>1 mg/ml, Cys 반응 사이트의 18.8 µ M에 LXY30 연결 HEVNPs (LXY30-HEVNPs)을 혼합 (단계 2.2.4 세부 정보 참조), 보 건국 Cy5.5의 동등한 양으로 (100 µ M) 0.01 M PBS ph 7.4 1:5 어 금 니 비율; O/N 4 ° c.에 반응</li>
		<li>제거는 제조 업체의 프로토콜에 따라 40 K MWCO 스핀 담 열 절차 Cy5.5 NHS 언바운드 ( 재료의 표참조). LXY30, HEVNPs Cy5.5 연결을 4 ° c.에 (LXY30-HEVNP-Cy5.5) 유지</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. HEVNP에 바인딩 및 MDA MB231 유방암 세포에 국제화
<ol><li>시드 MDA MB231 유방암 세포는 35 m m 유리로 요리 (5 x 104 접시 당) 바닥 캐비닛 포유류 세포 배양에 O/N.</li>
	<li>셀 바인딩 실험에 대 한 다음 단계 4.2-4.3에 의해 LXY30-HEVNP-Cy5.5를 준비 합니다. 0.01 mg/ml, HEVNP ORF2의 0.188 µ M에 LXY30 HEVNP Cy5.5 희석 (2.2.4 단계로 참조), 0-250 µ L에 1 %FBS / DMEM.<ol>
<li>0.01 mg/mL HEVNP Cy5.5 다음 단계 4.3 하지만 NHS Cy5.5 염료만, (HEV Cy5.5)와 활용에 부정적인 컨트롤 샘플을 준비 합니다. 0.01 mg/ml, HEVNP ORF2의 0.188 µ M에 HEVNP Cy5.5 희석 (2.2.4 단계로 참조), 10%의 250 µ L에서 FBS DMEM 보충.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 M PBS 버퍼, pH 7.4의 250 µ L을 적용 하 여 셀을 한 번 씻어. 세포 배양 접시에 몇 가지 버퍼를 유지 하면서 세척 후 PBS 버퍼를 제거 합니다.</li>
	<li>10% FBS DMEM 또는 HEVNP Cy5.5 10% FBS DMEM 배양된 MDA-MB231 유 방 암 세포를 보충에 보충에 LXY30-HEVNP-Cy5.5의 250 µ L를 적용 합니다. 방패는 셀 교양 알루미늄 호 일 빛에서 요리.</li>
	<li>국제화에 대 한 1 시간에 대 한 캐비닛 37 ° C 세포 배양에서 세포 배양 접시를 유지.</li>
	<li>씻어 얼음에 경작된 한 세포 3 번, 세척, 1 M PBS, pH 7.4의 250 µ L 당 5 분.</li>
	<li>4%에서 셀을 수정 PFA 1 M PBS, pH 7.4 20 분 및 다음 씻어 1 M PBS, pH 7.4의 250 µ L 한번에. 참고: 셀 준비가 이제 confocal 현미경에 의해 수행해입니다. 대표적인 데이터는 그림 5에 나와 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ludwig, C., Wagner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-like+particles-universal+molecular+toolboxes.">Virus-like particles-universal molecular toolboxes.</a> Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).</li><li>Galaway, F. A., Stockley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS2+viruslike+particles:+a+robust,+semisynthetic+targeted+drug+delivery+platform.">MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform.</a> Mol Pharm. 10 (1), 59-68 (2013).</li><li>Ma, Y., Nolte, R. J., Cornelissen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-based+nanocarriers+for+drug+delivery.">Virus-based nanocarriers for drug delivery.</a> Adv Drug Deliv Rev. 64 (9), 811-825 (2012).</li><li>Chen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+activatable+viral+capsid+functionalized+for+cancer+targeting.">Chemically activatable viral capsid functionalized for cancer targeting.</a> Nanomedicine (Lond). 11 (4), 377-390 (2016).</li><li>Jariyapong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+hepatitis+E+virus-like+particle+as+a+carrier+for+oral-delivery.">Chimeric hepatitis E virus-like particle as a carrier for oral-delivery.</a> Vaccine. 31 (2), 417-424 (2013).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+hepatitis+E+capsid+protein+self-assembles+into+a+dual-domain+T+=+1+particle+presenting+native+virus+epitopes.">Recombinant hepatitis E capsid protein self-assembles into a dual-domain T = 1 particle presenting native virus epitopes.</a> Virology. 265 (1), 35-45 (1999).</li><li>Li, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+elements+of+the+capsid+protein+for+self-assembly+into+empty+virus-like+particles+of+hepatitis+E+virus.">Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus.</a> J Virol. 79 (20), 12999-13006 (2005).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+hepatitis+E+virion-sized+particle+reveals+an+RNA-dependent+viral+assembly+pathway.">Structure of hepatitis E virion-sized particle reveals an RNA-dependent viral assembly pathway.</a> J Biol Chem. 285 (43), 33175-33183 (2010).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+configuration+of+hepatitis+E+virus+antigenic+domain.">Spatial configuration of hepatitis E virus antigenic domain.</a> J Virol. 85 (2), 1117-1124 (2011).</li><li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+characterization+of+a+high-affinity+and+high-specificity+peptide+ligand+LXY30+for+in+vivo+targeting+of+&#945;3+integrin-expressing+human+tumors.">Discovery and characterization of a high-affinity and high-specificity peptide ligand LXY30 for in vivo targeting of &#945;3 integrin-expressing human tumors.</a> EJNMMI research. 6 (1), (2016).</li><li>Li, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+self-assembly+of+empty+virus-like+particles+of+hepatitis+E+virus.">Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus.</a> J Virol. 71 (10), 7207-7213 (1997).</li><li>Peyret, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+gentle+purification+of+virus-like+particles+produced+in+plants.">A protocol for the gentle purification of virus-like particles produced in plants.</a> J Virol Methods. 225, 59-63 (2015).</li><li>Technologies, N. b. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vol. MAN0007891 1-2. , (2013).</li><li>Baskin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-free+click+chemistry+for+dynamic+in+vivo+imaging.">Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (43), 16793-16797 (2007).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.

시간이 걸리는 유전 공학 절차는 일반적으로 주, 달리 여기 설명 간단한 2 단계 및 암 ligand를 대상으로 추가의 3 일 안에 완료 될 수 있는 한 단계 화학 활용 절차 및 HEVNPs의 Cys/리스 사이트의 형광 탐지 염료 기술을 사용할 수 있습니다 후보자, 수영장 그리고 따라서 합리적인 비용 및 배달 시 사용할 수 있는 펩 티 드/작은 분자 합성 서비스의 활용에서 최고의 ligand 대상에 대 한 화면으로.
관심사의 단백질에는 polypeptides를 삽입할 수 있습니다만, 전통적인 유전자 공학, 달리 화학 활용 polypeptides, 작은 화학 분자의 표면에 나노 입자 등 다양 한 자료를 연결할 수 있는 관심, Cys 또는 리스 잔류물 반응 사이트로 사용 하는 만큼의 단백질. 화학 활용 사이트에서 같은 잔류물 경우 간단한 Cys/리스 교체 이전 연구4에서 같이 화학적으로 활성화 있도록 관심사의 단백질에 유전으로 수정할 수 있습니다.
제어를 화학 활용만 선택적 반응 사이트, 어원이 분자 활용된 필요 intramolecular 반응성을 피하기 위해 철저 하 게 공부 될 단백질의 구조에서 발생 합니다. 같이 본 펩 티 드 LXY3010를 대상으로 하는 유방암, 중요 한 이황화 결합 주기적 리간드 구조를 안정화. Maleimide의 thiol 반응성, 주어진 maleimide-기능화 LXY30 ligands는 가능성이 결과의 intramolecular 반응에 직접. 대신, 2 단계 활용 (4.2 단계) 클릭 화학 반응을 통해 alkyne 연결 된 LXY30와 maleimide에 연결 된 아 지 드 반응에 의해 수행 되었다. 그러나, 클릭 화학 반응과 thiol 선택 반응 순서는 LXY30-HEVNPs (그림 4)의 구조적 intactness에 대 한 중요 한. CuSO4 촉매 클릭 화학 반응을 통해 LXY30 직접 바인딩 되었습니다 하지 maleimide 하 마이-LXY30 구축. 그 후, 마이-LXY30는 형성된 LXY30 HEVNPs 그들의 네이티브 icosahedral 구조 (그림 4)를 유지할 수는 HEVNP-573 C에 활용 된.

치료 및 진단 배달, nanotheranostics로 알려진에 나노 크기의 벡터의 개발 타겟된 배달1쪽으로 일반적인된 치료에서 생명 의학 분야의 대부분을 이동 했다. 안정적으로 특정 병에 걸리는 직물 또는 생 화 확 적인 통로2,3,4 theranostic 분자를 직접 theranostic 분자와 나노 크기의 벡터 (나노)를 통합 하는 타겟된 nanotheranostic 납품 . 때문에 최적으로 크기의 나노 입자 theranostic 분자의 순환을 안정 한 선택적으로 세포 표면 분자 병 조직에 용량 Nanomedicine 타겟된 배달의 최전선에 왔다. 많은 nanotheranostic 플랫폼은 여전히 수동 셀 이해, 사전 성숙한 저하, 독성, 그리고 theranostic 분자와 부족 한 협회에서 고통. VLPs 많은 타겟된 배달에 이러한 장애물을 극복. 그들은 외국 epitopes를 표시 및/또는 작은 분자를 제공 nanocarriers로 사용 되었습니다: 처방 많은 질병1전투 하는 데 사용할 수 있습니다. 이 응용 프로그램의 속성에 주로 의존 자기 집합의 주어진된 VLP에 대 한 설계 된 응용 프로그램을 수행 하기 위해 유전 수정 용이성 뿐만 아니라. 유전 공학에 비해, VLP에 외국 펩 티 드의 화학 활용 표시 됩니다 중요 한 이점은 다양 한 엔터티, 펩 티 드 등 oligosaccharides, VLPs의 표면에 변조 활용을 허용 하기 때문에 고 VLP 어셈블리의 변경 없이 유연한 방식으로.
HEVNPs, 재조합 형 HEV capsid 단백질, 2nd 오픈에서 파생 된 프레임 (ORF2)를 읽고, 비 전염 성, 자기 조립 capsids 셀 바인딩 및 입장 가능. HEV 점 막 전송에 대 한 진화, 때문에 조립된 capsid 단백질 분해와 산 성 점 막 조건5마찬가지로 안정적입니다. HEVNPs 양식 빈, T = 1 icosahedral capsid, 60 동일한 단위6,7 ORF2의 구성 된 렌더링 매우 안정적인 스토리지 및 가혹한 생리 적인 조건에서. 어떤 바이러스 성 유전자 요소 부족, 효율, 높은 수율 생산 곤충 세포에서 잠재 식 시스템을 통해 이루어집니다. 그들의 분해 안정성 때문에 자기 조립된 HEVNPs 추출 하 고 실질적으로 필요한 정화 단계를 줄여 셀 상쾌한에서 정화. 또한, HEVNPs는 표면 노출된 돌출 도메인 (P) 안정적인 icosahedral 기반에 유연한 힌지 (hinge)를 통해 연결 된 소유. 유연한 힌지는 크게 기본 icosahedral 구조를 타협 하지 않고 P 도메인을 수정 가능 하 게 하는 동안 P 도메인 icosahedral 기지 꼭대기 표면 노출 스파이크를 형성 한다. 60 반복 단위, 단일 사이트 수정 화학 변조 60 대칭 사이트에서 발생합니다. 최근에, 우리는 나노 플랫폼 제안 ligands 또는 theranostic 응용 프로그램에 대 한 작은 분자 화학적 켤레 수 HEVNP를 사용 하 여. 이 maleimide에 연결 된 펩 티 드 또는 분자 반응 사이트로 단일 아미노산 시스테인 HEV VLP의 돌출 도메인에 대체 하 여 달성 되었다. HEV VLP 고 잘 공부 면역성 epitopes8,9의 이전 구조 분석을 바탕으로, 다음 5 HEV VLP 아미노산 잠재적인 후보자로 시스테인으로 교환 되었다: Y485C, T489C, S533C, N573C, 및 T586C ( 그림 1). 식 곤충 세포에서 정화 후에, 그들의 VLP 대형 전송 전자 현미경 (TEM) 관찰 (그림 2)에 의해 확인 되었다 고 노출된 시스테인 사이트 서쪽에 의해 분석 되었다 maleimide 연결 biotin 후 오 점 활용 (그림 2)입니다. 5 명의 돌연변이 중 C HEVNP-573 maleimide biotin 활용 (그림 2)의 강한 신호를 표시 하 고 후속4 (그림 3)를 대상으로 유 방 암 세포에 대 한 nanocarrier로 데모를 위해 사용 되었다.
이 프로토콜은 표면 시스테인 활용을 통해 종양을 대상으로 분자 HEVNPs에 연결할 화학 활용 방법을 묘사 한다. 우리 N573에 시스테인을 포함 하는 재조합 HEVNPs와 종양 대상 및 검출 분자 종양 배달의 활용을 자세히 (HEVNP-573 C). 우리는 펩 티 드, LXY3010 HEVNPs 양식 LXY30-HEVNP (그림 4)를 대상으로 유 방 암 종양을 바인딩할 2 단계 클릭 화학 활용 과정에 집중 했다. 그 후, N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 HEVNPs LXY30-HEVNP-Cy5.5 형광 탐지를 위한 모두 구축 생체 외에서 (그림 5)에 별도 리스 사이트에 활용 했다 고 vivo에서4.

<table><tbody><tr><td>MINI Dialysis Units, 10K MWCO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69572</td><td>mini dialysis unit</td></tr><tr><td>High Five Cells</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B85502</td><td>Tn5 cells</td></tr><tr><td>SF9 Cells&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11496015</td><td>Sf9 cells</td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11101, A11100</td><td>Baculovirus expression system</td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td><td>Life Technologies</td><td>10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024</td><td>Bacmid</td></tr><tr><td>ESF921 Insect Cell Media</td><td>Expression Systems LLC</td><td>96-001-01</td><td>insect cell media</td></tr><tr><td>Cy5.5 NHS ester, 5mg</td><td>Lumiprobe Corp</td><td>27020</td><td>Cy5.5 NHS ester</td></tr><tr><td>Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>87766</td><td>spin desalting column</td></tr><tr><td>MES Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich Chemical Co</td><td>M8250-250G</td><td>MES</td></tr><tr><td>Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes</td><td>Beckman Coulter, Inc</td><td>Depends on Rotor</td><td>ultracentrifuge tube</td></tr><tr><td>NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NPO321BOX</td><td>SDS protein gel</td></tr><tr><td>Cellfectin II Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362100</td><td>transfection reagent</td></tr><tr><td>EMS Glow Discharger</td><td>Electron Microscopy Science</td><td></td><td>glow discharger</td></tr></tbody></table>

surface functionalization of hepatitis e virus nanoparticles using chemical conjugation methods

바이러스 같은 입자 (VLPs) 외국 epitopes를 표시 및/또는 검색 및 다양 한 질병의 치료에 작은 분자를 제공 nanocarriers로 사용 되었습니다. 이 응용 프로그램 자기 조립, 유전 수정에 의존 하 고 재조합 VLPs. 종양을 대상으로 하는 응용 프로그램을 수행 하기 위해 시스테인 활용 유전자와 비교 제공 하는 VLPs에 외국 펩 티 드의 수정 혼자, 화학 활용 한 중요 한 다양 한 엔터티, 합성 펩 티 드 등 oligosaccharides, VLP 어셈블리의 변경 없이 변조 하 고 유연한 방식으로 VLPs의 표면에 활용 될 수 있기 때문에 이점.
여기, 다기능 배달 캐리어로 간염 E 바이러스 나노 (HEVNP), 모듈화 된 theranostic 캡슐을 사용 하는 방법을 보여 줍니다. HEVNPs의 기능 조직 대상으로, 이미징, 및 치료 배달 포함 됩니다. HEVNP의 잘 설립 구조 연구에 따라, 구조적으로 독립적이 고 표면 노출 잔류물 thiol 선택적 연계를 통해 화학 그룹 maleimide 연결에 대 한 활용 사이트 시스테인 교체에 대 한 선정 됐다. 하나의 특정 시스테인 수정 HEVNP (573에 아스파라긴의 Cys 교체 aa (HEVNP-573 C)) 유 방 암 세포 특정 리간드, LXY30에 활용 되었고, 근처-적외선 (NIR) 형광 염료 (Cy5.5), 종양 대상 렌더링으로 표시 효과적인 진단 캡슐 (LXY30-HEVNP-Cy5.5)로 HEVNPs. 비슷한 엔지니어링 전략 theranostic 배달에 잠재적인 응용 프로그램을 탐험 잘 알려진 원자 구조와 다른 고분자 단지와 함께 사용할 수 있습니다.

HEV-VLPs, 유사 모든 Cys HEVNPs 형성 성 icosahedral capsids 수정 하 고 생산 또는 정화 하는 동안 솔루션에 집계 되지 않았다. 전과 Cys의 각 단일 단계 maleimide-biotin 활용 수정 후 HEVNPs 부정적인 얼룩 EM (그림 2)에서 HEV-VLPs에서 구별할 수 없었다. Cys 수정된 HEVNPs chemiluminescent streptavidin 바인딩을 통해 서 부 럽으로 처음 테스트에 Maleimide biotin 활용 효율성. Maleimide-비타민 b 복합체 활용, 다음 Cys 수정 표시 HEVNPs streptavidin 바인딩 신호 (그림 2).
효과적인 2 단계 시스테인 활용 활용 밖으로 실시 됐다 하는 순서에 의해 영향을 받았습니다. 때문에 α3β1 integrin은 overexpressed에서 유방암 종양 세포, 합성 리간드, LXY30, α3β1에 특정 선호도10로 선정 되었습니다 종양을 대상으로 어원이 분자. LXY30 intermolecular 이황화 결합; 통해 cyclized 때문에 LXY30의 직접 maleimide (마이) 기능화 실현 되지 않았습니다. 따라서, self-reactivity에 대 한 관심사가 있었다. 대신, LXY30 alkyne 그룹과 공업화 되었고 클릭 화학 반응을 통해 maleimide-아 지 드에 바인딩된. HEV-573 C NPs는 먼저 maleimide-아 지 드에 바운스 되었다 때 가장 관찰 (그림 4C) 분해 HEV-573 C NPs 나타났다 LXY30-alkyne를 클릭 화학 반응에 의해 따라. 그러나, 형태로 마이-LXY30, 마이-LXY30 활용 Cys 수정 HEVNPs (LXY30-말-Cy5.5) 다음 LXY30 alkyne와 maleimide-아 지 드 초기 클릭 화학 반응의 구조 (그림 4B) 영향을 주지 않았다. 그림 4 는 종양 세포를 대상으로 HEVNPs의 LXY30 기능화의 회로도 묘사 한다.
Ligand, LXY30을 대상으로 유방암을 활용 하는 HEVNPs (LXY30-HEVNPs) 고 교양된 유방암 세포에는 내 면화 했다. 형광 탐지, LXY30 HEVNPs 및 언바운드 HEVNP-573Cs와 함께 표시 했다에 대 한 보 건국 기능성 HEVNP에 신의 1 차 아민 커플링을 통해 Cy5.5 형광 염료 (NHS-Cy5.5)-573Cs. LXY30-HEVNP-Cy5.5 및 HEVNP Cy5.5 경작에 적용 했다 유방암 세포 (MDA-MB-231), 그리고 confocal 현미경 검사 법에 의해 관찰. Confocal 현미경으로 NIR 형광 이미지는 LXY30-HEVNP-Cy5.5 높은 대 한 선호도 MDA-MB-231 유방암 세포 HEVNP-Cy5.5 (그림 5)에 비해 증가 국제화를 바인딩 했다 나타냅니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57020/57020fig1.jpg"> 그림 1: 간염 E 바이러스 나노 입자의 표면 돌출 도메인에 시스테인 교체. 시스테인 돌연변이 잔류물 ORF2 HEV의 이차 구조에 방해를 최소화 하기 위해 Y485, T489, S533, N573, 그리고 유연한 코일 지역에서 T586에 대 한 제안 했다 (A). 시스테인 돌연변이 대 한 모든 선택 된 잔류물 돌출 (P) 도메인의 표면에 위치 하 고 있습니다 (회색; 다른 도메인은 쉘 (S)-도메인 블루와 중간 (M)-핑크에서 도메인), 찌 꺼 기는 가장 바깥쪽에 (오렌지) Y485 (사이안), T489 (노란색), T586와 함께 표면, 및 잔류물 S533 (마젠타색) 및 N573 (레드) HEVNP (B)의 배 축에 직면 하는 측에. 그림 첸 외 에서 20164 권한이 수정 되었습니다. <a href="/files/ftp_upload/57020/57020fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57020/57020fig2.jpg"> 그림 2: HEVNP 모든 Cys 예 수정 HEVNPs N573C를 나르는. HEVNP-573 C 둥근 돌출부 전자 현미경 사진 (A)에 등장 하 고 말-biotinylating 활용 (B) 후 그대로 입자로 남아 있었다. Cys 수정 HEVNPs의 활용 및 epitope 노출의 대표적인 결과. 그들은 시스테인-maleimide 커플링을 통해 maleimide biotin에 바인딩된 되었고 이후 통해 streptavidin 바인딩에 대 한 서쪽 오 점 분석. N573에서 시스테인 돌연변이 허용 되는 다른 돌연변이 사이트, 즉, Y485, T489, S533, 및 T586에 비해 HEVNP에 효율적인 biotinylation (C). Equals 100 nm 바. <a href="/files/ftp_upload/57020/57020fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57020/57020fig3.jpg"> 그림 3: 특별히 Cy5.5 분류 LXY30-HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5)와 대상으로 유방암 세포의 도식. LXY30-HEVNP-Cy5.5 선택적으로 유 방 암 세포 막에 지나치게 표현된 integrin은 α3β1, LXY30의 특정 선호도 때문에 유방암 세포 (마젠타)에 바인딩합니다. <a href="/files/ftp_upload/57020/57020fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57020/57020fig4.jpg"> 그림 4: thiol 선택적 반응 및 구리 촉매 아 지 드 alkyne cycloaddition 또는 LXY30-HEVNPs 구축 '화학 클릭' 반응을 포함 하 여 2 단계 화학 활용 프로세스의 도식. 두 가지 방법은 테스트 되었습니다. 방법 1: 구리 촉매 아 지 드 alkyne cycloaddition 말-아 지 드와 alkyne-LXY30 사이 반응 양식 말 연결 LXY30 (말-LXY30)은 먼저 수행 되었다. 다음 말 LXY30 Cys 사이트 HEV-573 C NPs (A)의 반응에 추가 되었습니다. LXY30와 Cy5.5 장식 HEV-573 C NPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) 결국 온전 하 게 남아이 화학 활용 과정 (B). 방법 2: 아 지 드 연결 HEVNPs (아 지 드-HEVNPs), LXY30-alkyne, ascorbic 산 및 CuSO4 추가 하 여 다음을 구축 thiol 선택적 반응을 통해 HEV-573 C NPs의 Cys 사이트에서 말 연결 아 지 드 (말-아 지 드)의 라벨 활용 과정 시작 을 LXY30에 연결 된 HEVNPs (LXY30-HEVNPs) (A)를 형성. 그러나, 대부분 LXY30-HEVNPs는 손상 되거나 반응 시 약, 아 지 드, CuSO4 (C), 의약품, 등으로 발생할 수 있는 활용 프로세스에서 분해 했다. 말: Maleimide. 이 그림 동의 20164 첸 외 에서 수정 되었습니다. <a href="/files/ftp_upload/57020/57020fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57020/57020fig5.jpg"> 그림 5: 셀 바인딩 및 국제화의의 대표적인 결과 붙일 표시 된 LXY30-HEVNPs는 MDA-MB-231 유방암 세포에 바인딩합니다. LXY30-HEVNP-Cy5.5 MDA-MB-231 셀에 대상의 NIR 형광 이미지. 했다 스테인드 DAPI에서 (파란색), 핵의 신호 및 Cy5.5 (빨간색)의 신호는 confocal 형광 현미경을 사용 하 여 인수 했다. 이 그림 동의 20164 첸 외 에서 수정 되었습니다. <a href="/files/ftp_upload/57020/57020fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods at JoVE.com

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

간염 E 바이러스 나노 화학 활용 방법을 사용 하 여의 표면 기능화

우리 theranostic 나노 (HEVNP)으로 간염 E 바이러스 capsid 단백질을 설계 했습니다. HEVNP 자동으로 안정 된 icosahedral 점 막 배달에 조립. 여기, 시스테인, 특히 종양 세포를 묶는 합성 ligands 켤레를 표면 노출 잔류물을 변경 하 여 대상으로 하는 종양에 대 한 HEVNPs의 수정을 설명 합니다.

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

surface-functionalization-hepatitis-e-virus-nanoparticles-using

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.8K 조회수.  University of California Davis. 우리 theranostic 나노 (HEVNP)으로 간염 E 바이러스 capsid 단백질을 설계 했습니다. HEVNP 자동으로 안정 된 icosahedral 점 막 배달에 조립. 여기, 시스테인, 특히 종양 세포를 묶는 합성 ligands 켤레를 표면 노출 잔류물을 변경 하 여 대상으로 하는 종양에 대 한 HEVNPs의 수정을 설명 합니다.

비디오: Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

에 대한 바이러스 나노 입자<em&gt; 생체에</em&gt; 종양 이미징

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

연구

생체공학

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

Heterokaryon 형성의 두 가지 방법 HCV 제한 요소를 발견하기

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

면역학 및 감염병학

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic applications and vaccine development.1,2,3 Current approaches to modifying viral surfaces, which are mostly genetics-based, often suffer from attenuation of virus production, infectivity and cellular transduction.4,5 Using chemoselective click chemistry, we have developed a straightforward alternative approach which sidesteps these issues while remaining both highly flexible and accessible.1,2
The goal of this protocol is to demonstrate the effectiveness of using bioorthogonal click chemistry to modify the surface of adenovirus type 5 particles. This two-step process can be used both therapeutically1 or analytically,2,6 as it allows for chemoselective ligation of targeting molecules, dyes or other molecules of interest onto proteins pre-labeled with azide tags. The three major advantages of this method are that (1) metabolic labeling demonstrates little to no impact on viral fitness,1,7 (2) a wide array of effector ligands can be utilized, and (3) it is remarkably fast, reliable and easy to access.1,2,7
In the first step of this procedure, adenovirus particles are produced bearing either azidohomoalanine (Aha, a methionine surrogate) or the unnatural sugar O-linked N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), both of which contain the azide (-N3) functional group. After purification of the azide-modified virus particles, an alkyne probe containing the fluorescent TAMRA moiety is ligated in a chemoselective manner to the pre-labeled proteins or glycoproteins. Finally, an SDS-PAGE analysis is performed to demonstrate the successful ligation of the probe onto the viral capsid proteins. Aha incorporation is shown to label all viral capsid proteins (Hexon, Penton and Fiber), while O-GlcNAz incorporation results in labeling of Fiber only.
In this evolving field, multiple methods for azide-alkyne ligation have been successfully developed; however only the two we have found to be most convenient are demonstrated herein &#x2013; strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) and copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) under deoxygenated atmosphere.

Adenovirus particles are engineered to contain either the unnatural amino acid analogue azidohomoalanine or the azido sugar O-GlcNAz. The azide group of each is chemoselectively ligated via "click" chemistry reactions as a means of viral surface modification.

Bioorthogonal 클릭 화학을 통해 바이러스성 표면 Chemoselective 변경

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach in&#160;vaccine design. Antigen is delivered to DC via antibodies specific for endocytosis receptors such as DEC-205 that induce uptake, processing, and MHC class I- and II-presentation.
Efficient and reliable conjugation of the desired antigen to a suitable antibody is a critical step in DC targeting and among other factors depends on the format of the antigen. Chemical conjugation of&#160;full-length protein to purified antibodies is one possible strategy. In the past, we have successfully established cross-linking of the model antigen ovalbumin (OVA) and a DEC-205-specific IgG2a antibody (&#945;DEC-205)&#160;for in vivo DC targeting studies in mice. The first step of the protocol is the purification of the antibody from the supernatant of the NLDC (non-lymphoid dendritic cells)-145 hybridoma by affinity chromatography. The purified antibody is activated for chemical conjugation by sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate) while at the same time the sulfhydryl-groups of the OVA protein are exposed through incubation with TCEP-HCl (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride). Excess TCEP-HCl and sulfo-SMCC are removed and the antigen is mixed with the activated antibody for overnight coupling. The resulting &#945;DEC-205/OVA conjugate is concentrated and freed from unbound OVA. Successful conjugation of OVA to &#945;DEC-205 is verified by western blot analysis and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
We have successfully used chemically crosslinked &#945;DEC-205/OVA to induce cytotoxic T cell responses in the liver and to compare different adjuvants for their potential in inducing humoral and cellular immunity following in vivo targeting of DEC-205+ DC. Beyond that, such chemically coupled antibody/antigen conjugates offer valuable tools for the efficient induction of vaccine responses to tumor antigens and have been proven to be superior to classical immunization approaches regarding the prevention and therapy of various types of tumors.

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

We describe a protocol for the chemical conjugation of the model antigen ovalbumin to an endocytosis receptor-specific antibody for in vivo dendritic cell targeting. The protocol includes purification of the antibody, chemical conjugation of the antigen, as well as purification of the conjugate and the verification of efficient conjugation.

체외 및 비보에서 마우스 수지상 세포를 대상으로 하는 전체 길이 단백질을 가진 정제 된 DEC-205 지향 항체의 화학 적 융합

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

암 연구학

Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection

In the present work, the synthesis of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) and its conjugation with deferoxamine, a siderophore recognized by Yersinia enterocolitica, using a succinyl moiety as a linker are described.
Magnetic nanoparticles (MNP) of magnetite (Fe3O4) were prepared by solvothermal method and coated with SiO2 (MNP@SiO2) using the St&#246;ber process followed by functionalization with APTES (MNP@SiO2@NH2). Then, feroxamine was conjugated with the MNP@SiO2@NH2 by carbodiimide coupling to give MNP@SiO2@NH2@Fa. The morphology and properties of the conjugate and intermediates were examined by eight different methods including powder X-Ray diffraction (XRD), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), Raman spectroscopy, X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), transmission electron microscopy (TEM) and energy dispersive X-Ray (EDX) mapping. This exhaustive characterization confirmed the formation of the conjugate. Finally, in order to evaluate the capacity and specificity of the nanoparticles, they were tested in a capture bacteria assay using Yersinia enterocolitica.

This work describes protocols for the preparation of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) and its conjugation with deferoxamine using a succinyl moiety as a linker. A deep structural characterization description and a capture bacteria assay using Y. enterocolitica for all the intermediate nanoparticles and the final conjugate are also described in detail.

기능성 자기 나노 입자의 합성, 사이드로포레 페록사민과의 그들의 융합 및 박테리아 검출에 대한 평가

In the present work, the synthesis of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with ...

화학

A Competent Hepatocyte Model Examining Hepatitis B Virus Entry through Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide as a Therapeutic Target

Hepatitis B virus (HBV) infection has been considered a crucial risk factor for hepatocellular carcinoma. Current treatment can only lessen the viral load but not result in complete remission. An efficient hepatocyte model for HBV infection would offer a true-to-life viral life cycle that would be crucial for the screening of therapeutic agents. Most available anti-HBV agents target lifecycle stages post viral entry but not before viral entry. This protocol details the generation of a competent hepatocyte model capable of screening for therapeutic agents targeting pre-viral entry and post viral entry lifecycle stages. This includes the targeting of sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) binding, cccDNA formation, transcription, and viral assembly based on imHC or HepaRG as host cells. Here, the HBV entry inhibition assay used curcumin to inhibit HBV binding and transporting functions via NTCP. The inhibitors were evaluated for binding affinity (KD) with NTCP using isothermal titration calorimetry (ITC)-a universal tool for HBV drug screening based on thermodynamic parameters.

We present a protocol to screen anti-hepatitis B virus (HBV) compounds targeting pre- and post-viral entry lifecycle stages, using isothermal titration calorimetry to measure binding affinity (KD) with host sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Antiviral efficacy was determined through the suppression of viral lifecycle markers (cccDNA formation, transcription, and viral assembly).

치료 표적으로 폴리펩티드를 공동 수송하는 나트륨 타우로 콜레이트를 통한 B 형 간염 바이러스 진입을 조사하는 유능한 간세포 모델

Hepatitis B virus (HBV) infection has been considered a crucial risk factor for hepatocellular carcinoma. Current treatment can only lessen the viral load ...

생화학

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to prevent and treat sexually transmitted infections (STIs). Moreover, many EF technologies focus on encapsulating the active agent, relative to utilizing the surface to impart biofunctionality. Here we describe a method to fabricate and surface-modify poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA) electrospun fibers, with the potent antiviral lectin Griffithsin (GRFT). PLGA is an FDA-approved polymer that has been widely used in drug delivery due to its outstanding chemical and biocompatible properties. GRFT is a natural, potent, and safe lectin that possesses broad activity against numerous viruses including human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). When combined, GRFT-modified fibers have demonstrated potent inactivation of HIV-1 in vitro. This manuscript describes the methods to fabricate and characterize GRFT-modified EFs. First, PLGA is electrospun to create a fiber scaffold. Fibers are subsequently surface-modified with GRFT using 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS)chemistry. Scanning electron microscopy (SEM) was used to assess the size and morphology of surface-modified formulations. Additionally, a gp120 or hemagglutinin (HA)-based ELISA may be used to quantify the amount of GRFT conjugated to, as well as GRFT desorption from the fiber surface. This protocol can be more widely applied to fabricate fibers that are surface-modified with a variety of different proteins.

This manuscript describes the procedure to fabricate and characterize Griffithsin-modified poly(lactic-co-glycolic acid) electrospun fibers that demonstrate potent adhesive and antiviral activity against human immunodeficiency virus type 1 infection in vitro. Methods used to synthesize, surface-modify, and characterize the resulting morphology, conjugation, and desorption of Griffithsin from surface-modified fibers are described.

감염 성병 제조 및 방지를 위한 Griffithsin 수정 섬유 장비의 특성

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry

The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, genetic programmability, and biodegradability. While they&#39;re highly amenable to bioconjugation reactions for adding synthetic ligands onto their surface, the range in bioconjugation methodologies on these aqueous born capsids is relatively limited. To facilitate the direction of functional biomaterials research, non-traditional bioconjugation reactions must be considered. The reaction described in this protocol uses dibromomaleimides to introduce new functionality in the solvent exposed disulfide bonds of a VLP based upon Bacteriophage Q&#946;. Furthermore, the final product is fluorescent, which has the added benefit of generating a trackable in vitro probe using a commercially available filter set.

Here, we present a procedure to fluorescently functionalize the disulfides on Q&#946; VLP with dibromomaleimide. We describe Q&#946; expression and purification, the synthesis of dibromomaleimide-functionalized molecules, and the conjugation reaction between dibromomaleimide and Q&#946;. The resulting yellow fluorescent conjugated particle can be used as a fluorescence probe inside cells.

Dibromomaleimide-아 황산 화학에 의해 형광 PEGylated 바이러스 같은 입자 활용 유도 만들기

The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, ...

Biofunctionalization of Magnetic Nanomaterials

Magnetic nanomaterials have received great attention in different biomedical applications. Biofunctionalizing these nanomaterials with specific targeting agents is a crucial aspect to enhance their efficacy in diagnostics and treatments while minimizing the side effects. The benefit of magnetic nanomaterials compared to non-magnetic ones is their ability to respond to magnetic fields in a contact-free manner and over large distances. This allows to guide or accumulate them, while they can also be monitored. Recently, magnetic nanowires (NWs) with unique features were developed for biomedical applications. The large magnetic moment of these NWs enables a more efficient remote control of their movement by a magnetic field. This has been utilized with great success in cancer treatment, drug delivery, cell tracing, stem cell differentiation or magnetic resonance imaging. In addition, the NW fabrication by template-assisted electrochemical deposition provides a versatile method with tight control over the NW properties. Especially iron NWs and iron-iron oxide (core-shell) NWs are suitable for biomedical applications, due to their high magnetization and low toxicity.
In this work, we provide a method to biofunctionalize iron/iron oxide NWs with specific antibodies directed against a specific cell surface marker that is overexpressed in a large number of cancer cells. Since the method utilizes the properties of the iron oxide surface, it is also applicable to superparamagnetic iron oxide nanoparticles. The NWs are first coated with 3-aminopropyl-tri-ethoxy-silane (APTES) acting as a linker, which the antibodies are covalently attached to. The APTES coating and the antibody biofunctionalization are proven by electron energy loss spectroscopy (EELS) and zeta potential measurements. In addition, the antigenicity of the antibodies on the NWs is tested by using immunoprecipitation and western blot. The specific targeting of the biofunctionalized NWs and their biocompatibility are studied by confocal microscopy and a cell viability assay.

In this work, we provide a protocol to biofunctionalize magnetic nanomaterials with antibodies for specific cell targeting. As examples, we utilize iron nanowires to target cancer cells.

자성 나노 물질의 생체 기능화

Magnetic nanomaterials have received great attention in different biomedical applications. Biofunctionalizing these nanomaterials with specific targeting ...

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions between mannosylated peptides and CV-N's high-affinity binding site. Virus envelope spikes gp120, HA, and Ebola glycoprotein (GP) 1,2 have been reported to bind both high- and low-affinity binding sites on dimeric CVN2. Dimannosylated HA peptide is also bound at the two low-affinity binding sites to an engineered molecule of CVN2, which is bearing a high-affinity site for the respective ligand and mutated to replace a stabilizing disulfide bond in the carbohydrate-binding pocket, thus confirming multivalent binding. HA binding is shown to one high-affinity binding site of pseudo-antibody CVN2 at a dissociation constant (KD) of 275 nM that further neutralizes human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) through oligomerization. Correlating the number of disulfide bridges in domain-swapped CVN2, which are decreased from 4 to 2 by substituting cystines into polar residue pairs of glutamic acid and arginine, results in reduced binding affinity to HA. Among the strongest interactions, Ebola GP1,2 is bound by CVN2 with two high-affinity binding sites in the lower nanomolar range using the envelope glycan without a transmembrane domain. In the present study, binding of the multispecific monomeric CV-N to severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike (S) glycoprotein is measured at KD = 18.6 &#181;M as compared with nanomolar KD to those other virus spikes, and via its receptor-binding domain in the mid-&#181;-molar range.

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

The present protocol describes new tools for SPR binding assays to examine CV-N binding to HA, S glycoprotein, related hybrid-type glycans, and high-mannose oligosaccharides. SPR is used to determine the KD for binding either dimeric or monomeric CV-N to these glycans.

표면 플라즈몬 공명을 통한 항바이러스제 엔지니어링

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...