Name: making conjugation-induced fluorescent pegylated virus-like particles by dibromomaleimide-disulfide chemistry
Uploaded: 2018-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
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J.J.G. は、彼らのサポートのための国立科学財団 (DMR-1654405) および癌防止研究所のテキサス (CPRIT) (RP170752s) を認めています。

1. 準備
<ol><li>ホストゲノム スープ (LB) 寒天培地を作るし、プレート12を注ぐ。</li>
	<li>
WtQβ コート蛋白質シーケンスを含む pET28 プラスミドを持つ BL21(DE3) を変換します。
	<ol>
<li>雪解けの氷浴で大腸菌BL21(DE3) 有能なセル。微量遠心チューブ内のセルの場所 50 μ L。</li>
		<li>1 つの管にプラスミッドの 2 μ L を追加し、軽くはじきます。氷上で 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>熱衝撃を与える 45 セル正確 42 ° C では水浴の s熱衝撃の直後に氷風呂に戻って、チューブを置き、5 分間インキュベートします。</li>
		<li>どんな抗生物質を含まない LB 媒体の 950 μ L を追加します。</li>
		<li>37 ° C で 60 分 200 rpm で文化を振る</li>
		<li>(カナマイシン) と LB 寒天培地プレート上のカルチャの 100 μ L をプレートし、プレート 37 ° C で一晩インキュベート必要なとき白人が植民地を選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
スーパー最適スープ (すすり泣き) メディアを作る。
	<ol>
<li>オートクレーブ 2 2 L superdry サイクルのエルレンマイヤー フラスコに困惑します。</li>
		<li>無菌環境で重量を量り、トリプトン 20.0 g を追加、5.0 グラム酵母抽出物、無水硫酸マグネシウム、2.469 g 0.584 g 塩化ナトリウムの各フラスコに塩化カリウムの 0.186 g。</li>
		<li>もたらす、ボリューム 1 L を純水と各フラスコとオートクレーブで液体のサイクル。</li>
		<li>すすり泣きメディアはオートクレーブ後部屋の温度に達すると、メディアの各リットルにカナマイシン (100 mg/mL) の 1 つの mL を追加し、4 ° C で保存</li>
	</ol>
</li>
	<li>
0.1 M カリウム リン酸緩衝液 (7.00) を確認します。
	<ol>
<li>500 mL の純水に塩基性のカリウム 68.045 g を溶解することにより 1 M カリウム塩基性溶液を作る。</li>
		<li>87.09 g カリウム 500 mL の純水に塩基の溶解によって 1 M カリウム二塩基溶液を作る。</li>
		<li>38.5 mL カリウム塩基性溶液と塩基性のカリウムの 61.5 mL を 1 L ボトルに追加します。</li>
		<li>7.00 必要な場合、pH を調整し、1 L のボリュームをもたらす</li>
	</ol>
</li>
	<li>
0.1 M カリウム リン酸緩衝液 (7.00) で 5-40% のサッカロースの勾配を作る。
	<ol>
<li>50 mL 遠沈管に 0.1 M カリウム リン酸緩衝液 (7.00) に溶解 (5% ずつ増えていく) 5-40% スクロース ソリューションを準備します。</li>
		<li>3.3 mL の長い針の注射器を使用して 38 mL 丸底ポリカーボネート管の下部に 5% ショ糖溶液を沈殿物し、他の 5 つのチューブのこの手順を繰り返します。</li>
		<li>慎重にチューブの下部に 10% ショ糖溶液の 3.3 mL を入金し、グラデーションを妨げないよう針を慎重に取り外します。その他の 5 つのチューブに繰り返します。 
		 </li>
	</ol>
</li>
	<li>スクロース溶液、グラデーションを邪魔しないように注意しながら各管で 40% に 15% から増加の 3.3 mL 層を預金を続けます。</li>
	<li>完了したら、箔グラデーションのトップをカバーし、-80 ° C で保存</li>
</ol>2. Qβ の式
<ol><li>1:1 漂白剤/エタノール ベンチ領域を拭いてください。</li>
	<li>無菌環境で無菌環境ですすり泣きメディアの 3 mL にエシェリヒア属大腸菌BL21(DE3) のシングル コロニーを追加することによって 2 つの 3 mL スターター文化を作る。</li>
	<li>37 ° C と 0% の相対湿度 (rH) ルームで 250 rpm でシェーカーで一晩成長します。</li>
	<li>
すすり泣きメディア スターター文化を接種します。
	<ol>
<li>シェーカーを両方 3 mL スターター文化を取るし、無菌環境で 2 つのスターターの各カルチャを注ぐ 2 L 困惑新鮮なすすり泣きメディアそれぞれの 1 リットルのエルレンマイヤー フラスコ。</li>
		<li>37 ° C と 0 %rh ルームで 250 rpm でシェーカーに接種のメディアを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>外径600 0.9 ~ 1.0 に達するまで 37 ° C と 0 %rh ルームで 250 rpm でシェーカーで細菌を成長します。</li>
	<li>1 M イソプロピル β D 1 thiogalactopyranoside (IPTG) タンパク質の発現を誘導するために P1000 ピペットを使用しての 1 つの mL を追加します。</li>
	<li>37 ° C と 0 %rh ルームで 250 rpm でシェーカー一晩メディアを残します。</li>
	<li>メディア シェーカーから次の朝、遠心分離機を使用して削除 1000 mL ボトル 20,621 × g で 4 ° C で 1 時間のセルを収穫します。</li>
	<li>
上澄みを廃棄し、細胞ペレットを収集します。
	<ol>
<li>上清を細菌を殺すために漂白剤約 5 mL をフラスコに注ぐ。これは無駄です。</li>
		<li>遠心ボトルの底から細胞ペレットをこすり、50 mL の遠心管にペレットを入れるには、ヘラを使用します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Qβ の精製
<ol><li>〜 20-30 細胞ペレットを再懸濁します mL の 0.1 M カリウム リン酸バッファー (pH 7.00)。</li>
	<li>再懸濁は、チャンクを持たないかどうかを確認し、製造元のプロトコルに従って microfluidizer プロセッサを使用して細胞を溶解 (材料の表を参照してください)。粒子の収率を高めるために、少なくとも 2 回の細胞を溶解させます。</li>
	<li>遠心分離機のライセート 20,621 x g で 250 mL 遠心ボトルで 4 ° C で 1 時間</li>
	<li>ペレットを破棄し、mL の上澄みの体積を測定します。0.265 によってその値を乗算し、上清に硫酸アンモニウムの量を追加します。</li>
	<li>タンパク質を沈殿させるのに 200 rpm で攪拌プレート上で、少なくとも 1 時間のための 4 ° C でかき混ぜます。</li>
	<li>4 ° C で 1 時間 20,621 x g で 250 ml の遠心します。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、0.1 M カリウム リン酸緩衝液 (7.00) の約 10 mL にペレットを再懸濁します。</li>
	<li>数秒間原油サンプルとミックスにボルテックスの 1:1 クロロホルム/n-ブタノールの平等なボリュームを追加します。</li>
	<li>4 ° C で 30 分間 38 mL 管 20,621 × g で遠心します。</li>
	<li>パスツール ピペットを使用してトップの水層を回復します。水溶液と有機層の間を形成している層のようなゲルのいずれかを取らないように注意します。</li>
	<li>6 5-40% 既製サッカロースの勾配を解凍し、それぞれの上に抽出液の約 2 mL をロードします。</li>
	<li>無料減速 4 ° C で 16 時間 99,582 × g で遠心。</li>
	<li>各チューブの下の発光ダイオード (LED) の光を当てるし、青色のバンドが表示されます。長い針の注射器を持つこれらの粒子を回復します。</li>
	<li>Ultrapellet 4 ° C で 2.5 h 370,541 x g で粒子</li>
	<li>上澄みを廃棄し、0.1 M カリウム リン酸緩衝液 (7.00) で精製した粒子の透明ペレットを再懸濁します。</li>
</ol>4. 数量、製品の確認
<ol><li>ブラッドフォードの試金を使用して、製品13を定量化します。</li>
	<li>実行の削減と非還元ナトリウム dodecyl 硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE)14製品を確認します。 注: SDS ページを減らす; 外被蛋白質の分子量を確認するため非還元 SDS-PAGE 高次構造を確認することです。</li>
</ol>5. DB 化合物 Qβ の活用
<ol><li>
Qβ のジスルフィドを減らします。
	<ol>
<li>0.0020 g を溶かす tris(2-carboxyethyl) 1 mL の 100 倍原液を純水にホスフィン (TCEP)。 注: は、削減前に新鮮な TCEP を準備します。</li>
		<li>微量遠心チューブに Qβ (5 mg/mL) の 200 μ L を追加します。</li>
		<li>100 x TCEP 原液の 20 μ L を追加することによって従ってください。</li>
		<li>1 時間室温で孵化させなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
再ブリッジ削減二硫化 dibromomaleimide ポリエチレング リコール (PEG-DB) を使用します。
	<ol>
<li>DMF の 100 μ L で (DB PEG) dibromomaleimide - ポリエチレング リコールの 0.0017 g を溶解します。</li>
		<li>10 mM リン酸ナトリウム溶液 (pH 5.00) 680 μ L を追加します。</li>
		<li>DB ペグのソリューションに Qβ を削減を追加し、365 nm の紫外線ランプの下で混合過程を観察します。明るい黄色蛍光は、混合時の 365 nm ハンドヘルド UV ランプを即座に視覚化できます。</li>
		<li>一晩、ロティサリー室温 (RT) で進む反応をしましょう。</li>
	</ol>
</li>
	<li>遠心フィルターによって反応混合物を浄化 (COMW = 10 kDa) 3 回 4 ° C で 20 分 3,283 × g で 1 x PBS を使用して</li>
	<li>非還元 SDS-PAGE とネイティブの agarose のゲルの電気泳動によって活用を監視します。 注: 群集はそのままネイティブ agarose のゲル粒子として実行、彼らは、電荷、サイズや形状に基づいて区切られます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Virus-Based+Polymer-Protein+Nanoparticles+by+Atom+Transfer+Radical+Polymerization.">Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).</li><li>Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Integration+of+Gold+Nanoparticles+and+Organic+Fluorophores+Using+Synthetically+Modified+MS2+Viral+Capsids.">Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-Directed+Synthesis+of+Porous+and+Protective+Core-Shell+Bionanoparticles.">Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).</li><li>Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Chemistry:+The+Chemical+Functionalization+of+Viral+Architectures+to+Create+New+Technology.">Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology.</a> WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).</li><li>Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+modification+of+proteins+at+cysteine:+opportunities+in+chemistry+and+biology.">Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology.</a> Chem. - Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).</li><li>Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potato+Virus+X,+a+Filamentous+Plant+Viral+Nanoparticle+for+Doxorubicin+Delivery+in+Cancer+Therapy.">Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy.</a> Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).</li><li>Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-templated+FRET+Platform+for+the+Rational+Design+of+Ratiometric+Fluorescent+Nanosensors.">Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors.</a> Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).</li><li>Lee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+Structure+and+Conformation+Alter+the+Antigenicity+of+Virus-like+Particle-Polymer+Conjugates.">Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates.</a> J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-Protein+Core-Shell+Nanoparticles+for+Enhanced+Antigen+Immunogenicity.">Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity.</a> ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).</li><li>Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+Hybrid+Bacteriophage+Qbeta+virus-like+particles.">Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles.</a> Biochemistry. 48 (47), 11155-11157 (2009).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Functionalization+across+Quaternary+Structure+in+a+Virus-+like+Particle.">Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle.</a> Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).</li><li>. Pouring LB Agar Plates Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/">https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/</a> (2016)</li><li>Smith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Modification,+Bioconjugation,+and+Disulfide+Bridging+Using+Bromomaleimides.">Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).</li><li>Castaneda, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mild+Synthesis+of+N-functionalised+Bromomaleimides,+Thiomaleimides+and+Bromopyridazinediones.">A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones.</a> Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).</li><li>Fiedler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+Mutations+Change+the+Structure+and+Stability+of+a+Virus-+Like+Particle.">Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle.</a> Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).</li><li>Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+Virus-like+Particles+with+Poly(2-oxazoline)s.">Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).</li><li>Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Functionalized+Bacteriophage+Q&#946;+as+a+Photocaged+Drug+Carrier.">Dual Functionalized Bacteriophage Q&#946; as a Photocaged Drug Carrier.</a> Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).</li></ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

ショ糖勾配遠心法に比べて小さい蛋白質の浄化、浄化バクテリオファージ Qβ でユニークなステップです。Qβ はクロロホルム/n-ブタノール抽出手順の後、5 ~ 40% のサッカロースの勾配を使用してをさらに純化されます。遠心分離中に粒子がそのサイズに基づいて分かれています。大きな粒子は小さな粒子のまま低密度地域における高密度領域に旅行します。Qβ はグラデーションのより低い三番目に移動し、小さい蛋白質の不純物は、遠心分離機管の上部に閉じ込められている間そこに残る。Qβ のコロイド懸濁液を示します強いチンダル散乱ショ糖密度勾配、見ることができる青色のバンドとしてから LED の光を当てるときの下に。このバンドは長い注射針を使用して抽出しやすいし。ショ糖の Qβ には、超遠心、ペレット明確なペレットを降伏します。ペレットは、必要なバッファーに再停止またはタンパク質の高速液体クロマトグラフィー (FPLC) によって更に精製できます。結果として得られる粒子の純度は、SDS ページで確認できます。
100 x TCEP 原液をたて水で減少の前に準備されるべきので、TCEP はリン酸バッファーで安定しません。さらに、この TCEP では TCEP の過剰を抱合反応を実行する前に削除する必要はありませんので、その他のアミノ酸へ反応する無料チオールが含まれていますも。PH 5.00 リン酸ナトリウム溶液、減らされた Qβ を追加することによって Dibromomaleimide 化合物は溶解しました。PH 5.00、システイン (減らされた二硫化物) はプロトン、ジスルフィドへ戻って再酸化を防止する dibromomaleimide との抱合反応を促進します。下 365 nm 紫外線照射反応混合物は、減らされた Qβ の化合物 DB に追加した直後に黄色蛍光を発する。異なる Qβ の事前合成 fluorophores が付いてをアタッチするには、この蛍光は抱合反応によって誘導されます。硫黄およびマレイミド リングの新しい絆が作成されるとすぐに、蛍光体が形成されます。蛍光スペクトルを示す励起 (400 nm) と発光 (550 nm) マキシマ フィット uv GFP フィルター共焦点顕微鏡のセット (ex λ = 405 nm、λem = 500−540 nm)。Qβ PEG 次いで無血清 DMEM で未加工 264.7 マクロファージ, でした。インキュベーションの 4 時間後 Qβ ペグは有ったと細胞内蛍光コンパートメントを視覚化できる点状の黄色だった。言及する必要がある 1 つの事実は、蛍光で移るかもしれない程度のとウシ血清アルブミン (BSA) 血清またはライソゾームまたは細胞の後期エンドソームの内部他のシステインに富む物質です。時間をかけて、これはアプリケーションを追跡するセルの細胞内蛍光を弱めるただし、薬物送達システムの新しい設計のための機会も提供しています。
結論として、我々 は dibromomaleimide チオール化学を通して Qβ VLP の止め釘の DB の活用を実証しました。オール イン ワン抱合反応だけでなく functionalizes を PEG VLP に毛穴に沿ってジスルフィドが蛍光に分類されたタンパク質ナノ粒子とも言えます。

ナノサイズのウイルスのカプシドを使用してエキサイティングな分野、生物医学研究1,2,3のアプリケーションの範囲を拡大することを目的として浮上しています。Recombinantly 発現ウイルス様粒子 (群集) は構造的に、ウイルスから派生したが、彼らはそれらに非感染性のタンパク質粒子を作る元のウイルスの遺伝物質を欠いています。表面の特徴は、遺伝的プログラムし、各キャプシドはそれ前後のものに同じように表現の場所および原子レベルの精度でアミノ酸の反応性側鎖の数を知ることは不可能です。多くの場合、外装と内装の両方の表面には各種溶媒露出しているアミノ酸残基を動けなかった化反応反応合成、生体分子間に共有結合を形成する反応を官能基化することができますが所有しています。分子4,5。
化反応の反応は、比較的簡単な方法でより多様な機能を持って興味の分子を助けます。治療薬6、蛍光タグ7およびポリマー8,9など、興味の分子は事前合成でき、それらが群集の表面に接続された前に特徴付けられます。生体に特に一般的な VLP と生体材料研究 recombinantly 表現としては 28 nm の正二十面体のカプシド10バクテリオファージ Qβ に基づいて VLP をされています。Qβ に最も一般的な反応のサイトは、最近 dibromomaleimide ライン ハデルトン ベイカー反応による Qβ の毛穴縮小ジスルフィド化合物の成功活用11をお伝えしてきました、大差でリシンです。反応が良いと進む収量および、同様に重要なは、粒子の熱安定性を失うことなくが。同時にこの反応は、細胞にこれらの粒子の摂取量を追跡する使用ことができます活用誘起蛍光法を生成します。この作品は、明るい黄色の蛍光体にハデルトン ベイカー反応による Qβ の表面上にポリエチレング リコール (PEG) の活用を紹介します。彼らが細胞によってとられる、これらの粒子を追跡、ことができます。本プロトコルはその原則溶媒露出ジスルフィドを含む他の多くの群集の 1 つに適用されますが、タンパク質ナノ粒子 Qβ、に基づいて新しい蛍光ペグインターフェロンを生成の研究者を助けます。

<table><tbody><tr><td>LB Broth (Miller)&amp;nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone, Poweder</td><td>Research Products International</td><td>T60060-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract, Poweder</td><td>Research Products International</td><td>Y20020-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Anhydrous magnesium sulfate</td><td>P212121</td><td>CI-06808-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System</td><td>Fisher Scientific</td><td>4474524</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Monobasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25590B</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>096-041053</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Sulfate</td><td>P212121</td><td>KW-0066-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Alfa Aesar</td><td>32614-M6</td><td></td></tr><tr><td>1-Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-4</td><td></td></tr><tr><td>SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum</td><td>Beckman Coulter</td><td>342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set</td><td></td></tr><tr><td>Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL,</td><td>Beckman Coulter</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie (Bradford) Protein Assay</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI23200</td><td></td></tr><tr><td>TRIS Hydrochloride</td><td>Research Products International</td><td>T60050-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine</td><td>Alfa Aesar</td><td>J63734-AC</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>2 3-Dibromomaleimide 97%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>553603-5G</td><td></td></tr><tr><td>Polythylene Glycol</td><td>Alfa Aesar</td><td>41561-22</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424375000</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide/bis-Acrylamide</td><td>P212121</td><td>RP-A11310-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179-100</td><td></td></tr><tr><td>FV3000 confocal laser scanning microscope</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>FV3000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Labnet Revolver Adjustable Rotator&amp;nbsp;</td><td>Thomas Scientific&amp;nbsp;</td><td>1190P25&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>010-1459</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer</td><td>Thermo Scientific</td><td>3141-0250</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC</td><td>Thermo Scientific</td><td>3117-0380</td><td></td></tr><tr><td>2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim</td><td>Pyrex</td><td>4980-2L</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>M-110P Microfluidizer Materials Processor</td><td>Microfluidics</td><td>M-110P</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes</td><td>Thermo Scientific</td><td>3117-0380PK</td><td></td></tr><tr><td>Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate</td><td>Beckman Coulter</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>Cylinder, Graduated - Polypropylene 250 mL</td><td>PolyLab</td><td>80005</td><td></td></tr><tr><td>533LS-E Series Steam Sterilizers</td><td>Getinge</td><td>533LS-E</td><td></td></tr><tr><td>TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid</td><td>LabSource</td><td>D36-313-CS</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Microcentifuge Tube: 1.5mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>VWR Os-500 Orbital Shaker</td><td>VWR Scientifc Products</td><td>14005-830</td><td></td></tr><tr><td>Tetra Handcast systems</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000FC</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene, 250 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofluorometer NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3300</td><td></td></tr><tr><td>Long Needle&amp;nbsp;</td><td>Hamilton&amp;nbsp;</td><td>7693</td><td></td></tr><tr><td>Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-841-46</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P200 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>P100 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123615</td><td></td></tr><tr><td>P20 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>P10 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance</td><td>Intelligent Weighting Technology</td><td>IWT_PM100</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;ndash;15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 &amp;micro;l</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1084</td><td></td></tr></tbody></table>

making conjugation-induced fluorescent pegylated virus-like particles by dibromomaleimide-disulfide chemistry

近年医療ウイルス様粒子 (群集) の生合成、個々 のサイズ、遺伝的プログラミング、生分解性の容易さの材料研究を帰することができると。彼らは化反応反応表面で合成配位子を追加するために、これらの水溶液生まれカプシドに化反応方法論の範囲は比較的限られています。機能性材料研究の方向性を容易にする、非伝統的な化反応の反応を考慮されなければなりません。このプロトコルで記述されている反応は、バクテリオファージ Qβ に基づいて、VLP の露出のジスルフィド結合の溶媒に新しい機能を導入する dibromomaleimides を使用します。さらに、最終製品が蛍光、市販のフィルターのセットを使用して追跡可能な体外プローブの生成の付加的な利点を持っています。

Dibromomaleimide 誘導体は、dibromomaleimide 無水物とアミン15間の縮合反応によって合成できます。また、N-メトキシカルボニル活性化 3, 4-dibromomaleimide を使用して穏やかな合成法16が収量 DB ・ ペッグ (図 1) に methoxypolyethylene リコール (PEG) と反応してここで悪用されました。NMR は、化合物の構造 (図 2) を識別するために使用されました。Qβ VLP は、28 nm 正二十面体タンパク質ナノ粒子、180 と同じ外被蛋白質で構成されています。外被蛋白質は隣接コート蛋白質17β シートと α ヘリックス ドメインを介して非連動の二量体を形成する傾向があります。群集は、様々 な溶媒組成18極端な pHs、高温安定性を選択する傾向があります。この場合、Qβ VLP が他の RNA ファージ キャプシド19 (図 3) の対称性の 5-6 倍の軸に位置する 180 の鎖間ジスルフィド結合によりLeviviridac家族でより安定しています。これらの五量体、6 量体構造は、非還元 SDS ページ19によって視覚化することができますジスルフィドによってリンクされます。TCEP の 10 の同等 (tris(2-carboxyethyl)phosphine) (0.70 µmol)、Qβ (0.070 µmol コート蛋白質、0.070 µmol 二硫化) の 1 mg のジスルフィドを基準は一つで室温低減 Qβ カプシド (rQβ) を生成するすべてのジスルフィドを減らすために使用されました。時間、非還元 SDS-PAGE は単量体の外被蛋白質 (図 4 および図 5 a) にすべてのより高い順序の構造が減少したことを示しています。DB PEG 溶液の 20 の同等物に直接追加された原油 rQβ 混和剤としてそれらを rebridge への反応はワンポット合成として行われていた (1.4 µmol) リン酸ナトリウムに (10 mM、pH 5.00、10 %dmf) 1 時間還元反応11に続きます。DB ペグの添加後すぐに 365 nm の紫外線ランプ (図 5) の下で観察可能な明るい黄色蛍光があった。混合物はそれから RT で夜通し孵化遠心フィルターを用いた浄化続く試しに (MWCO = 10 kDa) 小さい分子の過剰を削除する時間 3 の目的のバッファーで洗浄します。Qβ malemide 抱合された光安定性を促進するために 10 mM リン酸ナトリウム ソリューション (pH 5.00) に再停止されます。活用は、非 UV、coomassie 青い染色 (図 5 a) の下で SDS-PAGE を減らすことによって確認されました。すべてのバンドは、coomassie 青い染色、成功した共役を表す結果を紫外線下で蛍光 (図 5 a) を示した。Qβ PEG 抱合体の整合性は、ネイティブ agarose のゲルの電気泳動および透過電子顕微鏡 (TEM) (図 5 bC) によって確認されました。
蛍光分光学 Qβ-マレイミド (Qβ-Μ) および Qβ PEG は、それぞれ約 400 nm と 540-550 nm に励起と発光極大を示した (図 6)。これは市販の GFP uv フィルター セット、励起波長は 405 と合わせて nm、発光波長は 500-540 nm。市販のフィルターと抱合体の物性の便利な配置は、行われ、図 7のイメージを作成する生体外でプローブ、Qβ ペグを使用して許可を設定します。Qβ PEG (200 nM) マウス Raw 264.7 無血清 DMEM 培地で細胞を培養、核染色の順だった。図 7の共存に注目画像は、黄色蛍光粒子が Raw 264.7 のセルによって取り込まれた 4 時間培養の後追跡することができますを示しています。Unfunctionalized Qβ 群集は、ごくわずかな蛍光を示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57712/57712fig1.jpg"> 図 1: DB ペグの合成スキーム。<a href="/files/ftp_upload/57712/57712fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57712/57712fig2.jpg"> 図 2: nmr による。(A)1H NMR および(B) 13C DB ペグ。<a href="/files/ftp_upload/57712/57712fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57712/57712fig3.jpg"> 図 3: Qβ VLP キャプシド キメラで処理としての結晶学的構造 (PDB ID: 1QBE).2 つのシステイン (Cys 74 とシステイン 80) がオレンジ色で表示されます。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57712/57712fig4.jpg"> 図 4: Qβ-マレイミド (Qβ M) の複合体の共役スキーム。Qβ (ジスルフィドの 0.07 µmol) は TCEP の 10 の同等を使用して減った (0.7 µmol) dibromomaleimide 化合物 (DB ・ DB ・ ペッグ) の 20 の同等物の付加によって続いて 1 時間常温 (1.4 µmol)。<a href="/files/ftp_upload/57712/57712fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57712/57712fig5.jpg"> 図 5: Qβ、rQβ の特性 Qβ M ・ Qβ ・ ペッグ。(A)非削減 SDS-PAGE および(B)ネイティブ agarose ゲルの Qβ、rQβ、Qβ M のと紫外線 (top)、coomassie の下 Qβ ペグ青染色 (下)。Qβ M (上) および Qβ PEG (下) (C) TEM 顕微鏡写真。365 nm UV 照射(D) Qβ の写真-ペグ反応混合物<a href="/files/ftp_upload/57712/57712fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57712/57712fig6.jpg"> 図 6: 蛍光スペクトル。蛍光励起(A)と発光(B)スペクトル Qβ M およびカリウム リン酸緩衝液 (7.00) の 0.1 m Qβ PEG。最大励起は約 400 nm と放出の周りは、最大 540-550 nm。<a href="/files/ftp_upload/57712/57712fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57712/57712fig7.jpg"> 図 7: Qβ PEG の共焦点の蛍光画像共役マクロファージ 264.7 のセルにします。青: NucRed は、647 ReadyProbes 試薬を住んでいます。イエロー: Qβ-ペグ。トップ画像: 青と黄色のチャンネルをマージします。下の画像: 明視野画像。セットをフィルター: uv GFP (ex λ = 405 nm、λem = 500-540 nm)、cy5 の組合せ。孵化の時間が 4 h<a href="/files/ftp_upload/57712/57712fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry

Dibromomaleimide 二硫化化学蛍光ペグインターフェロン ウイルス様粒子を抱合誘導を作る

蛍光 dibromomaleimide と Qβ VLP のジスルフィドを匹敵する手順を紹介します。Dibromomaleimide と Qβ との共役反応 dibromomaleimide 機能分子の合成と精製 Qβ 式について述べる。結果として得られる黄色蛍光共役粒子は細胞内蛍光プローブとして使用できます。

The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, ...

making-conjugation-induced-fluorescent-pegylated-virus-like-particles

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.8K ビュー.  University of Texas at Dallas. 蛍光 dibromomaleimide と Qβ VLP のジスルフィドを匹敵する手順を紹介します。Dibromomaleimide と Qβ との共役反応 dibromomaleimide 機能分子の合成と精製 Qβ 式について述べる。結果として得られる黄色蛍光共役粒子は細胞内蛍光プローブとして使用できます。

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Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

のAlexa Fluor ®標識を通じてデング熱ウイルスの可視化

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

免疫・感染学

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

のためのウイルス粒子<emインビボ&gt;</em&gt;腫瘍イメージング

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

生物工学

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

合成脂質二重膜上でHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスとシグナリングのイメージング

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic applications and vaccine development.1,2,3 Current approaches to modifying viral surfaces, which are mostly genetics-based, often suffer from attenuation of virus production, infectivity and cellular transduction.4,5 Using chemoselective click chemistry, we have developed a straightforward alternative approach which sidesteps these issues while remaining both highly flexible and accessible.1,2
The goal of this protocol is to demonstrate the effectiveness of using bioorthogonal click chemistry to modify the surface of adenovirus type 5 particles. This two-step process can be used both therapeutically1 or analytically,2,6 as it allows for chemoselective ligation of targeting molecules, dyes or other molecules of interest onto proteins pre-labeled with azide tags. The three major advantages of this method are that (1) metabolic labeling demonstrates little to no impact on viral fitness,1,7 (2) a wide array of effector ligands can be utilized, and (3) it is remarkably fast, reliable and easy to access.1,2,7
In the first step of this procedure, adenovirus particles are produced bearing either azidohomoalanine (Aha, a methionine surrogate) or the unnatural sugar O-linked N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), both of which contain the azide (-N3) functional group. After purification of the azide-modified virus particles, an alkyne probe containing the fluorescent TAMRA moiety is ligated in a chemoselective manner to the pre-labeled proteins or glycoproteins. Finally, an SDS-PAGE analysis is performed to demonstrate the successful ligation of the probe onto the viral capsid proteins. Aha incorporation is shown to label all viral capsid proteins (Hexon, Penton and Fiber), while O-GlcNAz incorporation results in labeling of Fiber only.
In this evolving field, multiple methods for azide-alkyne ligation have been successfully developed; however only the two we have found to be most convenient are demonstrated herein &#x2013; strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) and copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) under deoxygenated atmosphere.

Adenovirus particles are engineered to contain either the unnatural amino acid analogue azidohomoalanine or the azido sugar O-GlcNAz. The azide group of each is chemoselectively ligated via "click" chemistry reactions as a means of viral surface modification.

Bioorthogonalクリックケミストリーを介したウイルス表面の化学選択的修飾

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

蛍光タグ付きワクシニアウイルスタンパク質の効率的な生成のための方法論

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

単一粒子レベルでのウイルス融合動態の測定法

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

生物学

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of various diseases. This application relies on genetic modification, self-assembly, and cysteine conjugation to fulfill the tumor-targeting application of recombinant VLPs. Compared with genetic modification alone, chemical conjugation of foreign peptides to VLPs offers a significant advantage because it allows a variety of entities, such as synthetic peptides or oligosaccharides, to be conjugated to the surface of VLPs in a modulated and flexible manner without alteration of the VLP assembly.
Here, we demonstrate how to use the hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), a modularized theranostic capsule, as a multifunctional delivery carrier. Functions of HEVNPs include tissue-targeting, imaging, and therapeutic delivery. Based on the well-established structural research of HEVNP, the structurally independent and surface-exposed residues were selected for cysteine replacement as conjugation sites for maleimide-linked chemical groups via thiol-selective linkages. One particular cysteine-modified HEVNP (a Cys replacement of the asparagine at 573 aa (HEVNP-573C)) was conjugated to a breast cancer cell-specific ligand, LXY30 and labeled with near-infrared (NIR) fluorescence dye (Cy5.5), rendering the tumor-targeted HEVNPs as effective diagnostic capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Similar engineering strategies can be employed with other macromolecular complexes with well-known atomic structures to explore potential applications in theranostic delivery.

We have engineered the capsid protein of hepatitis E virus as a theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP self-assembles into a stable icosahedral cage in mucosal delivery. Here, we describe the modification of HEVNPs for tumor targeting by mutating surface-exposed residues to cysteines, which conjugate synthetic ligands that specifically bind tumor cells.

化学の活用方法を使用して E 型肝炎ウイルスのナノ粒子の表面化学

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, both to decipher viral replication mechanisms and to study antivirals or provide development platform for vaccines. The construction and manipulation of a reverse genetic system for a negative-strand RNA virus such as a respiratory syncytial virus (RSV), however, remains delicate and requires special know-how. The RSV genome is a single-strand, negative-sense RNA of about 15 kb that serves as a template for both viral RNA replication and transcription. Our reverse genetics system uses a cDNA copy of the human RSV long strain genome (HRSV). This cDNA, as well as cDNAs encoding viral proteins of the polymerase complex (L, P, N, and M2-1), are placed in individual expression vectors under T7 polymerase control sequences. The transfection of these elements in BSR-T7/5 cells, which stably express T7 polymerase, allows the cytoplasmic replication and transcription of the recombinant RSV, giving rise to genetically modified virions. A new RSV, which is present at the cell surface and in the culture supernatant of BSRT7/5, is gathered to infect human HEp-2 cells for viral amplification. Two or three rounds of amplification are needed to obtain viral stocks containing 1 x 106 to 1 x 107 plaque-forming units (PFU)/mL. Methods for the optimal harvesting, freezing, and titration of viral stocks are described here in detail. We illustrate the protocol presented here by creating two recombinant viruses respectively expressing free green fluorescent protein (GFP) (RSV-GFP) or viral M2-1 fused to GFP (RSV-M2-1-GFP). We show how to use RSV-GFP to quantify RSV replication and the RSV-M2-1-GFP to visualize viral structures, as well as viral protein dynamics in live cells, by using video microscopy techniques.

We describe a method for generating and amplifying genetically modified respiratory syncytial viruses (RSVs) and an optimized plaque assay for RSVs. We illustrate this protocol by creating two recombinant viruses that respectively allow quantification of RSV replication and live analysis of RSV inclusion bodies and inclusion bodies-associated granules dynamics.

世代、増幅、および組換え呼吸器合胞体ウイルスの滴定

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Combined Genetic and Chemical Capsid Modifications of Adenovirus-Based Gene Transfer Vectors for Shielding and Targeting

Adenovirus vectors are potent tools for genetic vaccination and oncolytic virotherapy. However, they are prone to multiple undesired vector-host interactions, especially after in vivo delivery. It is a consensus that the limitations imposed by undesired vector-host interactions can only be overcome if defined modifications of the vector surface are performed. These modifications include shielding of the particles from unwanted interactions and targeting by the introduction of new ligands. The goal of the protocol presented here is to enable the reader to generate shielded and, if desired, retargeted human adenovirus gene transfer vectors or oncolytic viruses. The protocol will enable researchers to modify the surface of adenovirus vector capsids by specific chemical attachment of synthetic polymers, carbohydrates, lipids, or other biological or chemical moieties. It describes the cutting-edge technology of combined genetic and chemical capsid modifications, which have been shown to facilitate the understanding and overcoming of barriers for in vivo delivery of adenovirus vectors. A detailed and commented description of the crucial steps for performing specific chemical reactions with biologically active viruses or virus-derived vectors is provided. The technology described in the protocol is based on the genetic introduction of (naturally absent) cysteine residues into solvent-exposed loops of adenovirus-derived vectors. These cysteine residues provide a specific chemical reactivity that can, after production of the vectors to high titers, be exploited for highly specific and efficient covalent chemical coupling of molecules from a wide variety of substance classes to the vector particles. Importantly, this protocol can easily be adapted to perform a broad variety of different (non-thiol-based) chemical modifications of adenovirus vector capsids. Finally, it is likely that non-enveloped virus-based gene transfer vectors other than adenovirus can be modified from the basis of this protocol.

The protocol described here enables researchers to specifically modify adenovirus capsids at selected sites by simple chemistry. Shielded adenovirus vectors particles and retargeted gene transfer vectors can be generated, and vector host interactions can be studied.

Dibromomaleimide 二硫化化学蛍光ペグインターフェロンウイルス様粒子を抱合誘導を作る

要約

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この動画の章

のAlexa Fluor ®標識を通じてデング熱ウイルスの可視化

のためのウイルス粒子

合成脂質二重膜上でHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスとシグナリングのイメージング

Bioorthogonalクリックケミストリーを介したウイルス表面の化学選択的修飾

蛍光タグ付きワクシニアウイルスタンパク質の効率的な生成のための方法論

単一粒子レベルでのウイルス融合動態の測定法

化学の活用方法を使用して E 型肝炎ウイルスのナノ粒子の表面化学

世代、増幅、および組換え呼吸器合胞体ウイルスの滴定

単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製

シールドとターゲットの遺伝物質と化学キャプシドのアデノウイルスを用いた遺伝子導入ベクターの変更を組み合わせる

Dibromomaleimide 二硫化化学蛍光ペグインターフェロン ウイルス様粒子を抱合誘導を作る

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のためのウイルス粒子

合成脂質二重膜上でHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスとシグナリングのイメージング

Bioorthogonalクリックケミストリーを介したウイルス表面の化学選択的修飾

蛍光タグ付きワクシニアウイルスタンパク質の効率的な生成のための方法論

単一粒子レベルでのウイルス融合動態の測定法

化学の活用方法を使用して E 型肝炎ウイルスのナノ粒子の表面化学

世代、増幅、および組換え呼吸器合胞体ウイルスの滴定

単一のビリオン原子間力顕微鏡と超解像蛍光イメージングのサンプル調製

シールドとターゲットの遺伝物質と化学キャプシドのアデノ ウイルスを用いた遺伝子導入ベクターの変更を組み合わせる

Dibromomaleimide 二硫化化学蛍光ペグインターフェロンウイルス様粒子を抱合誘導を作る

シールドとターゲットの遺伝物質と化学キャプシドのアデノウイルスを用いた遺伝子導入ベクターの変更を組み合わせる