この仕事のための資金は、アメリカ心臓協会 (16SDG29870005) およびノースカロライナ州立大学研究とイノベーションのシード資金を提供されました。

1 です一日 1: セルと試薬調製 注: 生物学的安全キャビネットのサンプルの汚染を防ぐためにすべてのセルと試薬の準備を行わなければならない。。
<ol><li>暖かいフィルター ダルベッコ &#39; s 修正イーグル &#39; s 媒体 (DMEM)、ウシ胎児血清 (FBS)、L-グルタミン、37 ° C の水浴のペニシリン/ストレプトマイシン</li>。
	<li>10 %fbs、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、1% と DMEM を温めて準備新生児ひと真皮線維芽細胞 (HDFn) メディアを補うことで L-グルタミン</li>。
	<li>は、凍結保存培地を取り除き冷凍の HDFns と 200 x g で 8 分間、遠心分離のバイアルを解凍します。T-75 培養用フラスコに 1 x 10 6 セル/mL と種子の密度で準備された HDFn メディアで細胞を再懸濁します</li>。
	<li>(37 ° C、5% CO 2) 細胞増殖を許可するインキュベーターで場所フラスコ</li>。
	<li>ストア HDFn のメディアで 4 ° C</li>
	<li>必要に応じてプロおよび反 migratory 試薬を準備します</li>。
</ol> 2。3 日目: 回転楕円体準備 <ol><li>サンプルの汚染を防ぐために文化フードで以下を実行します</li>。
	<li>電池が 80% の confluency に達するときメディアを吸引し、0.25 %5 mL を加えてトリプシン-EDTA。ストア フラスコ フラスコ表面から細胞を完全にデタッチするのには 5 分の 37 ° C のインキュベーターで</li>。
	<li>、トリプシンを中和するためにフラスコに暖められたメディアの 5 mL を追加します</li>。
	<li>遠心チューブ ミックス トリパン ブルーの 10 μ L と細胞懸濁液の 10 μ L.</li>
	<li>200 x g に 8 分の元の細胞懸濁液を遠心分離</li>
	<li>細胞懸濁液を遠心分離されているが、一方、検定にトリパン ブルー細胞懸濁液の 10 μ L を追加し、セル数を数えるためです</li>。
	<li>以下の遠心分離、細胞ペレットをずらすことがなくメディアを吸引します。1.25 x 10 5 セル/mL の濃度で細胞ペレットを再懸濁します</li>。
	<li>10 cm 回転楕円体成長の間に水和環境を維持するためにシャーレの底に滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 5 mL を追加します</li>。
	<li>は、シャーレの蓋を反転します。シャーレの蓋の内側の面に細胞懸濁液の 20 μ L を数滴を追加します</li>。
	<li>はすぐに蓋を再び反転、ハングの低下が外れないように注意しながら、皿の底に置きます。 図 1 が正常に形成されたハングの低下を示しています</li>。
	<li>慎重に 37 ° C の定温器皿を配置でき、吊りで成長する回転楕円体 72 h の期間文化をドロップ</li>
</ol> 3。6 日目: 3 D マトリックスへの回転楕円体の埋め込み <ol><li>サンプルの汚染を防ぐために文化フードで以下を実行します</li>。
	<li>最初のフィブリンの層の形成は、血栓のソリューションとして多くの井戸の井戸あたりの 100 μ L を追加する十分なボリュームの血栓ソリューションを作成 (ウェルあたり 1 回転楕円体) 必要です。血栓は、0.1 U/mL 人間 α トロンビン、2 mg/mL フィブリノゲン量 (250 mM HEPES、1500 mM の NaCl、50 mM CaCl 2、pH 7.4) によってバッファーの 10 X HEPES 10% ので構成されます。血栓ボリュームの残りの部分は、純水で構成されています。
	<ol><li>追加トロンビン最後かつ迅速にソリューションを追加 48 ウェル プレートに希望の井戸井戸に追加される前に重合から血栓を防ぐためにします</li>。
	</ol></li> <li>優しくシェイク/タップ フィブリン血栓の混合物は全体をよく、コーティングはようにウェル プレートと重合する底凝固層を許可するように 1 h のためのインキュベーターのウェル プレートを配置。ウェル プレート バブル形成を誘導するのに十分なハードを手ふれしません。単に必要に応じてプレートをロックまで井戸の全体をコーティングします。大量の血栓を使用している場合この手順は必ずしも必要です</li>。
	<li>フィブリン層に回転楕円体を転送します。
	<ol><li>削除もプレートと絞首刑の回転楕円体を含むペトリ皿インキュベーターから文化をドロップし、顕微鏡下で回転楕円体を調べます。文化フードに料理を配置します</li>。
		<li>慎重にアクセスを許可するシャーレのふたを反転吊りする文化にドロップします</li>。
		<li>1 mL の注射器に付いている 21 G 針を使用して慎重に井戸の底をコーティング重合フィブリン層を穴をあけるように注意して、各井戸の中心に逆蓋から一滴を転送します。ドロップを効率的に転送するには、針の中にドロップをゆっくりと引き出します。戻るとすぐに針の内部全体のドロップは、プランジャーを取得を停止します。ドロップをあまりにも遠くに引いて効果的な回転楕円体の転送または後続のイメージングを混乱させることができます空気の泡を引き起こす可能性があります</li>。
		<li>回転楕円体が必要なすべての井戸に正しく転送されるようにするには顕微鏡下でウェル プレートを調べます</li>。
	</ol></li> <li>2 番目のフィブリンの層の形成、最初フィブリン層 (ステップ 3.2) の作成については、上記と同じ準備を使用して別の血栓ソリューションを作成します。慎重に各回転楕円体を含むドロップに 100 μ L のピペットし、再び回転楕円体がそのまま残っているし、井戸の端にプッシュされていないことを確認するには顕微鏡下で調べています</li>。
	<li>インキュベーターにウェル プレートを返し 1 h. の重合に 2 番目の層を許可します。</li>
</ol> 4。6 日目: プロ渡り鳥や抑制因子添加 <ol><li>37 暖かい HDFn メディア ° C</li>
	<li>の汚染を防ぐためにフードで次の手順を実行します</li>。
	<li>評価されるプロ/反 migratory エージェントの適切な濃度を含む各グループのメディアを準備します</li>。
	<li>インキュベーターと文化フードの場所からウェル プレートを削除します</li>。
	<li>回転楕円体群の各ウェルに標準的なメディアの追加 500 μ L、回転楕円体の移行抑制グループの各ウェルに抑制メディアの 500 μ L と移行が強化された回転楕円体グループの各ウェルに pro 渡り鳥メディアの 500 μ L.</li>
	<li>ウェル プレートをインキュベーターに戻ります</li>。
	<li>変化媒体ごとの 48 h.</li>
</ol> 5。日 6-9: 評価の細胞の遊走や増殖 72 h オプションのメディア (0 h) と 24 h に、添加直後に明視野顕微鏡を用いた <ol><li>画像回転楕円体: 各時点で z スタックのイメージを取る場合を決定するために移行は、焦点の主な区域の外の平面で発生しています。我々 の経験では、この問題は発生しません。しかし、これはすべての実験の場合ことを確認すると便利です</li>。
	<li>連続時間の各ポイントで各回転楕円体のセルの枠線をトレースして各回転楕円体の面積のパーセントの増加を分析することにより各ウェルの細胞伸長を決定する使用 ImageJ、&#34; 測定 &#34; 領域を取得します</li>。
</ol>

<ol>
	<li>Chester, D., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+biophysical+properties+of+provisional+matrix+proteins+in+wound+repair.">The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair.</a> Matrix Biol. , (2016).</li><li>Martin, P., Leibovich, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+cells+during+wound+repair:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).</li><li>Lin, B., Yin, T., Wu, Y. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy.">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).</li><li>L&#228;mmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li><li>Chen, Z., Yang, J., Wu, B., Tawil, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Three-Dimensional+Wound+Healing+Model.">A Novel Three-Dimensional Wound Healing Model.</a> J Dev Biol. 2 (4), 198-209 (2014).</li><li>Ross, R., Benditt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+and+collagen+formation.">Wound healing and collagen formation.</a> The J Cell Biol. 12 (3), 533-551 (1962).</li><li>Sproul, E. P., Argraves, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytokine+axis+regulates+elastin+formation+and+degradation.">A cytokine axis regulates elastin formation and degradation.</a> Matrix Biol. 32 (2), 86-94 (2013).</li><li>Almine, J. F., Wise, S. G., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+signaling+in+wound+repair.">Elastin signaling in wound repair.</a> Birth Defects REs C Embryo Today. 96 (3), 248-257 (2012).</li><li>Tracy, L. E., Minasian, R. A., Caterson, E. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+anti-inflammatory+mesenchymal+stem/precursor+cells+(MSCs)+through+sphere+formation+using+hanging+drop+culture+technique.">Preparation of anti-inflammatory mesenchymal stem/precursor cells (MSCs) through sphere formation using hanging drop culture technique.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 28, (2014).</li><li>Bainbridge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+and+the+role+of+fibroblasts.">Wound healing and the role of fibroblasts.</a> J Wound Care. 22 (8), 410-412 (2013).</li></ol>

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このプロトコルでは、創傷治癒過程で細胞の移動の検討は、生体外で3D モデルを Ecm を関連付けられているをことができます。プロシージャの適切な実行の重要なステップは、線維芽細胞のスフェロイドの適切な開発2,500 セル/ドロップの初期濃度を与える細胞濃度の準備中に最適化されたフォームに回転楕円体を 72 時間の潜伏期間を確実にできます。細胞の数が少ないを使用する場合、回転楕円体は効果的に集約されない場合があり、分解される時に転送され、フィブリンの層に埋め込まれています。異なる種類の細胞を使用すると、初期菌体濃度および/または回転楕円体の成熟時間は安定したスフェロイドの形成を得るために調整するかもしれません。線維芽細胞よりもゆっくりと増殖する細胞の種類、はるかに高い初期細胞濃度は 72 時間の範囲内で適切なスフェロイドの形成を確保する必要あります。セルは吊りのままにしてはならない文化文化中回転楕円体上のメディアを変更することができないのため 72 h 以上をドロップします。初期回転楕円体サイズの違いも懸念されている固有の生物学的変動;スフェロイドの形成から始まる一貫した可能な限り多くのサイズの違いを最小限に抑えるため細胞数とデータ比較できるように時間をかけて成長を正規化することで、我々 はこの変動を対処します。
このメソッドを実装する主な課題は吊りから回転楕円体の転送血栓の行列に文化をドロップします。このプロトコルは、倒立のシャーレの蓋から回転楕円体を含む液滴を吸引針と注射器を使用するが、ピンセットのまたはトリミングされたヒントに接続されているマイクロ ピペットの使用など、他の方法は効果的に転送にも適用可能性があります、空中から回転楕円体は、行列にドロップします。注射器のピストンを引いて回転楕円体を確実に転送できる液滴を描画すること針の中にゆっくりと気泡が液滴に導入できるように確保することによって、液滴を転送する前に少し戻る。シリンジのプランジャーは、必要がありますのみ引き戻されるだけで十分な全体の液滴を持ち込む針;引いていずれかさらにまた泡を紹介し、ウェル プレートのウェルに、回転楕円体の信頼性の高い転送を妨げます。特殊な吊りドロップ文化板回転楕円体文化を簡素化するためにまた使用されるかもしれませんが、標準的な皿を単に使用するよりもこれを行うための以下のコスト効率的な手段です。
創傷治癒の生体内で、中には、創傷部に侵入する線維芽細胞はフィブリン行列分解は、広範なセリーンのプロテアーゼを生成します。これらの細胞は、その後主に損傷した組織を修復するために、コラーゲンから成る新しい細胞外マトリックスを合成します。23この移行のメカニズムでは、システムの制限を表し、私たちの方法では取得できない制御侵入。このメソッドで利用されている線維芽細胞が、フィブリン ネットワークを低下させる時間をかけてプロテアーゼを分泌することを指摘する必要があります。したがって、長期的な場合 (&gt; 72 時間) 移民研究が望まれる、アプロチニンなどのプロテアーゼ阻害剤の細胞培養媒体に追加してください。
にもかかわらず、これらの制限は、このメソッドは、体外移行 3 D セルの研究するためのシンプルでコスト効率の高い、再現可能な方法を提供します。2D モデルによって提供されるまっすぐ進む分析を維持記載 3 D モデルの成長解析の一般的に使用される 2D モデルよりももっと生理学的に関連する環境を提供します。回転楕円体が見やすいシンプルな明視野または位相顕微鏡を使用して、必要な場合このメソッド簡単に変更できる蛍光顕微鏡用細胞膜および基質タンパク質の蛍光ラベリングによって。このプロトコルを作った新生児皮膚線維芽細胞組織の修復/改造の線維芽細胞の移行の役割のための使用します。必要な場合好中球、マクロファージ、角化細胞や他の細胞型をこの試金で使用して創傷治癒に関与する他の細胞型の移行のフィブリン血栓構造の変化の影響を評価することができます。必要に応じて、3 D 素材を変更もできますが目的のアプリケーションによってコラーゲンや他の 3 D マトリックス材料関連する生理学的モデルを提供するためにフィブリン行列の代わりに使用することがあります。傷のような環境での長期的な細胞移動を研究するための有用なモデルは、このプロトコルでフィブリン線維芽細胞とコラーゲンではなくケラチノ サイトを使用して取得でした。説明する方法も、細胞遊走の柔軟性と費用対効果と即時体内作業を必要とするのではなく、生理学的関連性の in vitroモデルの実装を通じて研究を癒しの傷次の古典的な二次元の in vitro研究。

創傷治癒、組織の整合性の損傷の修復に起因する複雑なプロセスです。このプロセス ステージに分割されます 4 重複止血、炎症、増殖、改造に包まれたそれぞれ規制されている水溶性キューと、細胞マトリックスの相互作用、細胞間コミュニケーションの複雑な組み合わせで。1,2これらの手がかりのオーケストレーションは、創傷治癒など、重要なは、細胞の移動における細胞応答の多数を制御します。3,4細胞の遊走、細胞表現型と細胞外マトリックスの環境の生化学的および生物物理学的特性に依存して非常にダイナミックなプロセスです。5セル連続プローブ-インテグリンを介する経路; を介して細胞外マトリックス環境このプロセスでは、地形、剛性、閉じ込めなどマトリックス プロパティの広い範囲を感知する細胞をことができます。細胞遊走の二次元 (2 D) 解析は、移行がアクチン フィラメント バンドルの世代を通じてリーディング エッジでケラトサイト形成によって駆動されることを示します。前縁、後縁の収縮と収縮を駆動アクトミオシンとの組み合わせで焦点接着斑の形成は、セルを突き動かします。6三次元 (3 D) 細胞の移行は現在よくわかっていない, しかし、最近の研究は示す 3 D 移行は著しく異なること、船首に 2 D のメカニズムを説明し、変化をもたらすメカニズムによって駆動される可能性が高い。たとえば、ピートリーらによる最近の研究。ECM のプロパティ、に応じて 3 D マトリックス内のセルと切り替えることが lamellipodium 移行のメカニズムを駆動 lobopodium を示した。7細胞の遊走は創傷治癒応答の重要な要素は、細胞遊走の 3 D モデルは創傷治癒過程における様々 な刺激に対する生理反応を理解すること重要です。3 D マトリックスの移行とは大きく異なる 2D サーフェス上セル回遊行動を示されている、創傷治癒過程、老舗のスクラッチ アッセイを含む中細胞遊走の最新の in vitroモデル利用 2 D単層培養。5,6,7,8,9,10,11,12,13,14より最近開発されたアッセイ 3 D マトリックスを利用してきたが、まだこうして本当に細胞環境の立体感を再現する能力を制限、マトリックス上に単層細胞の培養体内。15
記載方法の目的は、応用刺激に関連付けられている移行反応のより堅牢な理解を得るために細胞遊走 2D サーフェスではなく生理学的関連性の高い 3 D モデルを勉強することです。このメソッドは、アクティブ化または細胞の移動に関連付けられている経路を阻害する要因の存在下で 3 D フィブリン血栓マトリックス内の細胞の移動の評価できます。創傷治癒の初期段階で重要な役割フィブリンによるこのメソッドの選ばれたフィブリン マトリックス次の傷害、フィブリン血栓が血液の損失を食い止めるため創傷環境で形成される組織の修復と改造の間に初期の細胞浸潤の足場として提供しています。2,16,17,18,19,20はまた、フィブリンが外科シーラントとして臨床的に使用され、シーラントの組成は細胞遊走と究極の成果を癒しに縛られています。コックスらによる前の調査。さまざまなフィブリンと、フィブリンの最適化を目的としてトロンビン濃度フィブリン血栓を線維芽細胞の移行を検討しました。これらの研究では、プラスチック製の食器にフィブリン血栓から細胞の移動の定量化を行った。20ここで 3 D フィブリン環境内で細胞の移動の定量化できる方法を紹介します。具体的にはこのプロトコルで記述されているメソッドは、フィブリンを使用して、このモデルはコラーゲンや他の 3 D の行列など、必要に応じて代替マトリックス材料を使用する簡単に変更できます。さらに、このアッセイで線維芽細胞スフェロイドの使用は, 傷ベッドに線維芽細胞の移行が最も重要な細胞外マトリックスの合成と組織修復/改造するので.ただし、修理中にプロセスの好中球はマクロファージが続く傷のベッドに移行する最初のセルの種類です。線維芽細胞は、約 48 時間後に外傷、創傷治癒過程の増殖期の初めに傷環境に侵入を開始します。19のこのアッセイは、好中球、マクロファージ、フィブリン血栓構造の変化によるこれらの細胞型の移行の影響を査定する他の細胞型などに簡単に修正できます。21
このアッセイを実装するには、最初に、線維芽細胞スフェロイド形成幹細胞培養のために紹介した方法の変更を使用しています。22は線維芽細胞スフェロイド、3 D フィブリン マトリックスに転送後、伸長する簡単に監視し、数日間定量化します。このプロトコルは、フィブリン マトリックス内 3 D 細胞スフェロイドを埋め込むことによって考慮に生理学的システムの 3 D は中にもたらされるモデル回遊行動に細胞膜の 2次元成長表面を使用して、関連性の制限を避けるため、まだ厳しく体外環境における細胞挙動の評価が可能。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;Materials&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine</td><td>VWR</td><td>VWRL0148-0500</td><td>DMEM already containing L-glutamine can also be used</td></tr><tr><td>100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic</td><td>VWR</td><td>10861-594</td><td>Dishes of any size can be used for hanging drop culture&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C-500ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1680149</td><td>Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Human Dermal Fibroblasts, neonatal</td><td>Thermo Fisher</td><td>C0045C</td><td>Can be replaced with other cell type of interest</td></tr><tr><td>21 G x 1 1/2&#039; needle</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>305167</td><td>22 G x 1 1/2 needles will also work</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>VWR</td><td>89174-491</td><td>Syringes of any volume can be used</td></tr><tr><td>Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells)</td><td>VWR</td><td>82051-004&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>FIB 3</td><td>Can be replaced with matrix protein of interest</td></tr><tr><td>Human Alpha Thrombin</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>HT 1002a</td><td>May not be necessary depending on matrix protein of interest</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;Equipment&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSL2 cell culture hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope with 10X objective</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge compatibile with 15 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

characterizing cell migration within three-dimensional in vitro wound environments

現在のほとんどの生体外モデルは傷の治癒、老舗スクラッチ アッセイなど、2次元の表面上のセルの移行および創傷閉鎖の勉強を含みます。しかし、どの生体内で創傷治癒が行われる生理学的な環境は二次元ではなく三次元です。セルの動作が大幅に異なることはますます明確になっている二次元三次元環境対したがって、傷の閉鎖の細胞移行挙動を勉強してもっと生理学的関連性の in vitroモデルの必要性があります。記載方法より以前に確立された二次元スクラッチ アッセイより生理学的条件を反映した三次元モデルの細胞移動の調査のためことができます。このモデルの目的は、プロまたは反 migratory 因子存在下でフィブリンのマトリックスに埋め込まれた回転楕円体ボディから細胞遊走の検討を通して細胞伸長を評価することです。このメソッドを使用して、三次元マトリックスの回転楕円体ボディから細胞伸長を観察し、明視野顕微鏡および回転楕円体の本体領域の解析による時間の経過とともに容易に定量化できないです。セル移動に及ぼすプロ渡り鳥あるいは阻害要因は、このシステムでは評価できます。このメソッドは、関連付けられている三次元傷行列の in vitro細胞移動分析の単純なメソッドを持つ研究者を提供します、このように体外の関連性を高める細胞研究生体内で動物を使用する前にモデル。

正常にプロおよび反渡り鳥エージェントの体外線維芽細胞に及ぼす影響を評価する回転楕円体文化を利用できます。 72 h (図 1) の期間にわたってドロップ文化をぶら下げを介して 3 D 線維芽細胞スフェロイドを形成できます。培養期間が過ぎると、回転楕円体は、血栓のマトリックスに埋め込まれ、対物レンズ (図 2) を使用してイメージを作成します。回転楕円体 (白の枠線で囲まれたエリアとしての図に描かれている) の初期の区分は、ImageJ を使用して決定されたおよび回転楕円体ボディからのそれに続くセル伸長度を決定するための参照ポイントとして使用します。スフェロイドの初期平均面積が 4.3 × 104 μ m2 ± 1.1 × 104 μ m2制御回転楕円体、4.4 × 104 μ m2 ± 1.1 × 104 μ m2 pro 渡り鳥をあると判断されました。回転楕円体と 4.5 の x 104 7.7 × 10 ±3 μ m2反渡り鳥の回転楕円体のため。回転楕円体を含む血栓にプロまたは反 migratory 要因を含むメディアを追加し、初期楕円体から細胞伸長が元のメディアは、(図 3) を追加した後 72 時間を撮影した最後の画像のすべての 24 h をイメージしました。
実験が完了したら、ImageJ を使用して、各サンプルの回転楕円体領域への変更を計算する回転楕円体の推移を調べた。図 3に示すとおり、各時点でのセルのクラスターの一番外側は細胞伸長時間特定度を判断して使用されました。図 3に示すようにアウト フォーカスのスポットは細胞の残骸、私たちでこれをカウントしないを見込んでいます。フルサイズの画像の回転楕円体体内から新たな明確な連続セル境界線を表示します。副産物を決定するときにトレースがこのボーダーです。細胞伸長の t 元回転楕円体ボディ領域の相対セル伸長領域を正規化することで定量化を行った = 0 h とし、元の楕円領域の割合として成長を表現します。72 時間の期間にわたって細胞伸長の定量化は、pro 渡り鳥エージェントにさらされる回転楕円体展示にさらされる回転楕円体と比較すると元の回転楕円体ボディから移行性が大幅に増加したことを明らかにする、移行阻害剤と標準的なメディアへの露出制御回転楕円体 (p &#60; 0.0001、図 4)。逆に、反渡り鳥エージェントにさらされる回転楕円体出展元の回転楕円体ボディ回転楕円体の制御と比較されたときから移行の有意な減少度合い (p &#60; 0.0001)。
比較のためには、スクラッチ アッセイ (図 5) の例を提供しております。この試金は、24 ウェル プレート 2 mg/mL フィブリノゲンとコーティングの 500,000 のセル/cm2で線維芽細胞を播種によって行われました。線維芽細胞は、一晩培養する許されました。よく表面は傷、ピペット チップ、スクラッチ領域に細胞遊走は 24 時間以上をイメージしました。図 5Aで代表的な画像のようには制限がこの試金;傷は非常に再現していないと場合によっては、境界線引きされていない明確に。しかし、プロおよび反 migratory 因子存在下で全体的な移行傾向は、前述の変動と移行のモードの違いにもかかわらず、3 D 回転楕円体アッセイで存在するものと同じです。移行レートが 3 D 回転楕円体分析と比較して 2 D のスクラッチ アッセイで短縮されたことに留意。閉鎖されたプロ渡り鳥のエージェントの存在下で最速と pro 渡り鳥のエージェントの存在下で培養したすべてのサンプルは 24 h 内で完全に閉鎖されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56099/56099fig1.jpg"> 
図 1: ぶら下げひと真皮線維芽細胞の文化をドロップします。吊りで残っている細胞スフェロイドの形成を誘導するために 72 h の文化をドロップします。トップ (A) と (B) 側面は絞首刑の文化をドロップが表示されます。(C) 回路図ハンギング ドロップでスフェロイドの形成の側面図を描いたします。黒い線プレートの上部、ピンクの球体を表しますメディアを表し紫球回転楕円体内のセル。<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56099/56099fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56099/56099fig2.jpg"> 
図 2: フィブリン行列の初期埋め込み後回転楕円体の外観 (t = 0 h、メディアの後) 10 倍の倍率に明視野顕微鏡を用いたイメージングします。(A, D)制御回転楕円体;(B, E)媒体の反渡り鳥のエージェントにさらされる回転楕円体(C, F)回転楕円体メディアのプロ渡り鳥エージェントにさらされています。画像が表示されます (D-F) と (A ~ C) のない白い線が伸長領域を決定するために使用する罫線を指定します。<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56099/56099fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56099/56099fig3.jpg"> 
図 3: 回転楕円体出現後 72 時間が 10 倍の倍率に明視野顕微鏡を使ってイメージ化します。(A, D)制御回転楕円体;(B, E)媒体の反渡り鳥のエージェントにさらされる回転楕円体(C, F)回転楕円体メディアのプロ渡り鳥エージェントにさらされています。画像が表示されます (D-F) と (A ~ C) のない白い線が伸長領域を決定するために使用する罫線を指定します。<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56099/56099fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56099/56099fig4.jpg"> 
図 4: 回転楕円体成長以上 72 h大幅に影響を与えるメディアのプロ渡り鳥や反渡り鳥のエージェントが表示されます。線維芽細胞の移行と 3 D 環境で増殖します。N = 3/グループ;* p を表す &#60; 0.0001。エラーバーは標準偏差を表しています。<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56099/56099fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56099/56099fig5.jpg"> 
図 5: 標準の 2D スクラッチ アッセイに比較します。(A) 標準的なスクラッチ試験 24 時間以上で細胞遊走の代表的なイメージ。線維芽細胞完備のプロまたは反 migratory 要因、メディアで栽培し、傷の閉鎖の違いは時間の経過と共に定量化されました。(B) コントロール、プロ渡り鳥、または反渡り鳥メディアに成長して線維芽細胞の時間をかけてパーセント閉鎖。3 D 回転楕円体アッセイ対この 2 D の試金に移行のモードの違いはありますが、移行の全体的な傾向は一貫性を維持します。N = 3/グループ;* p を表す &#60; 0.05。エラーバーは標準偏差を表しています。<a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56099/56099fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

このプロトコルの目的は、三次元フィブリン マトリックス内の細胞の移動に及ぼすプロおよび反 migratory 因子を評価するためです。

三次元培養細胞遊走を特徴付ける傷の環境

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

characterizing-cell-migration-within-three-dimensional-vitro-wound

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

7.6K ビュー.  North Carolina State University and The University of North Carolina - Chapel Hill. このプロトコルの目的は、三次元フィブリン マトリックス内の細胞の移動に及ぼすプロおよび反 migratory 因子を評価するためです。

ビデオ: Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

細胞浸潤および移行プロセスの評価: ビデオ顕微鏡ベースのスクラッチの比較創傷アッセイと boyden 教授区域の試金

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

がん研究

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

上に移動: シンプルかつ柔軟なIn Vitro三次元侵略試金のプロトコル

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

96ウェルプレートに細胞遊走/創傷治癒を行う装置

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

発生生物学

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

三次元コラーゲンマトリックス内の細胞移動の解析

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

生物工学

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

同心円状のゲルシステムは、3D細胞移動に対するマトリックスの微小環境の生物物理役割を研究する

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

新規In Vitro細胞移動を評価する癒しのアッセイを傷

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

免疫・感染学

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated experimental procedures, while potentially lacking in precision. In vitro culture of epithelial cell lines provides a suitable platform for researching the cell migratory behavior in wound healing and the impact of treatments on these cells. The physiology of epithelial cells is often studied in non-confluent conditions; however, this approach may not resemble natural wound healing conditions. Disrupting the epithelium integrity by mechanical means generates a realistic model, but may impede the application of molecular techniques. Consequently, microscopy based techniques are optimal for studying epithelial cell migration in vitro. Here we detail two specific methods, the artificial wound scratch assay and the artificial migration front assay, that can obtain quantitative and qualitative data, respectively, on the migratory performance of epithelial cells.

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

This manuscript describes how incision-like lesions made on cultured epithelial cell monolayers conveniently model wound healing in vitro, allowing for imaging by confocal or laser scanning microscopy, and which can provide high-quality quantitative and qualitative data for studying both cell behavior and the mechanisms involved in migration.

顕微鏡法によるIn Vitro創傷が治癒過程における上皮移行の評価

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

医学

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

インビトロでの細胞遊走および浸潤アッセイにおける

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

生物学

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

インビトロおよび創傷治癒の生体内分析のためのスクラッチ移行アッセイとドーサルスキンフォールドチャンバー

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

Quantifying Three-Dimensional Cell Migration Within and Into Granular Hydrogel Biomaterials

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for tissue integration. This article introduces two novel approaches for quantifying cell migration within and into granular hydrogels, highlighting the distinct applications of these scaffolds. First, a cell monolayer interface assay that simulates tissue growth into granular hydrogels for integration purposes is presented. Second, a spheroid-based assay is described, designed to track cell movement within the hydrogel matrix, specifically suited for applications involving cell delivery. Both methods enable precise and controlled measurements of cell migration, providing a comprehensive toolkit for researchers utilizing granular hydrogel scaffolds. The motivation for these methods stems from the need for tailored control over cell migration within the scaffold to align with specific applications. By optimizing and standardizing these quantification techniques, researchers can iteratively refine granular hydrogel properties, ensuring their effectiveness in diverse regenerative medicine contexts. This robust set of quantitative tools offers new opportunities to enhance granular hydrogel scaffolds, advancing their use in both cell delivery and tissue integration applications.

A protocol for the quantitative evaluation of 3D cell migration within and into the interface of granular hydrogels is presented here.

粒状ハイドロゲル生体材料内および粒状ハイドロゲル生体材料内への三次元細胞移動の定量化

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for ...