קרנות לעבודה זו סופקה באמצעות איגוד הלב האמריקני (16SDG29870005), מחקר אוניברסיטת מדינת צפון קרוליינה, חדשנות זרע מימון.

1-יום 1: תא והכנות ריאגנט הערה: הכנה התא ואת ריאגנט יש לבצעו בבטיחות הביולוגי הקבינט למניעת זיהום של דגימות.
<ol><li>חמים מסונן Dulbecco &#39; s נשר שונה &#39; s בינוני (DMEM), סרום שור עוברית (FBS),-גלוטמין ו פניצילין/סטרפטומיצין באמבט מים 37 ° C.</li>
	<li>הכן מדיה neonatal פיברובלסט עורי אנושי (HDFn) על ידי שכשהם חימם DMEM עם 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 1%-גלוטמין.</li>
	<li>להפשיר בקבוקון של מוקפאים HDFns ולא צנטריפוגה במשך 8 דקות ב- 200 גרם x כדי להסיר הקפאה קריוגנית בינוני. Resuspend תאים בתקשורת HDFn מוכן-צפיפות של עונה 1 פרק 10 6 תאים למ"ל ו זרע לתוך בקבוקון התרבות T-75.</li>
	<li>המקום את הבקבוק בתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) כדי לאפשר התפשטות תא.</li>
	<li>HDFn חנות המדיה ב- 4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>להכין ריאגנטים pro - ו אנטי - migratory לפי הצורך.</li>
</ol> 2. יום 3: ספרואיד הכנה <ol><li>לבצע את הפעולות הבאות בברדס תרבות למניעת זיהום של דגימות.</li>
	<li>כאשר תאים להגיע 80% confluency, תשאף מדיה ולהוסיף 5 מ של 0.25% טריפסין-EDTA. חנות את הבקבוק בתוך חממה 37 ° C עבור 5 דקות להתנתק באופן מלא תאים מפני השטח את הבקבוק.</li>
	<li>הוסף 5 מ של מדיה ומחוממת הבקבוק כדי לנטרל את טריפסין.</li>
	<li>בשפופרת microcentrifuge, לערבב μL 10 של Trypan Blue μL 10 של התליה תא.</li>
	<li>צנטריפוגה ההשעיה תא המקורית במשך 8 דקות ב- 200 g. x</li>
	<li>בעוד הוא להיות centrifuged התליה תא, להוסיף 10 μL של התליה תא Trypan Blue hemocytometer ולבצע ספירת תא.</li>
	<li>בעקבות צנטריפוגה, תשאף מדיה ללא הם מוציאים בגדר התא. Resuspend בגדר תא-ריכוז של 1.25 x 10 5 תאים למ"ל.</li>
	<li>הוסף 5 מ ל תמיסת סטרילית פוספט buffered (PBS) לתחתית של 10 ס מ פטרי כדי לשמור על סביבה רטוב במהלך צמיחה ספרואיד.</li>
	<li>היפוך את מכסה צלחת פטרי. הוסף מספר טיפות μL 20 של התליה תא אל השטח הפנימי של מכסה פטרי.</li>
	<li>במהירות להפוך שוב את המכסה ומניחים אותו בתחתית של המנה, נזהר לא לנתק את הטיפות לתלייה. איור 1 מדגימה תלוי בהצלחה בנוי טיפות.</li>
	<li>בקפידה למקם את המנה חממה 37 ° C ולאפשר spheroids לגדול תלייה טיפה תרבות לתקופה של ה 72</li>
</ol> 3. יום 6: הטבעה Spheroids לתוך מטריצה תלת-ממד <ol><li>לבצע את הפעולות הבאות בברדס תרבות למניעת זיהום של דגימות.</li>
	<li>על היווצרות שכבת פיברין הראשון, ליצור פתרון קריש הדם של נפח מספיק כדי להוסיף 100 μL של קריש דם פתרון לכל טוב של בארות רבות ככל הנדרש (1 ספרואיד לאדם טוב). קרישי דם מורכבות של 10% 10 X HEPES מאגר נפח (250 מ מ HEPES, 1500 מ"מ. NaCl, CaCl 50 מ מ 2, pH 7.4), פיברינוגן האנושי 2 מ"ג/מ"ל ו 0.1 U/mL תרומבין אלפא אנושי. השארית של אמצעי האחסון קריש הדם מורכבת מים אלקטרופורזה.
	<ol><li>תרומבין הוספה אחרונה ובמהירות להוסיף פתרון וולס הרצוי לתוך צלחת 48-טוב כדי למנוע קרישי דם polymerizing לפני להתווסף וולס.</li>
	</ol></li> <li>בעדינות לנער/ברז צלחת טוב על מנת להבטיח כי תערובת קריש פיברין ציפוי כולו טוב, ולאחר מכן מקם טוב צלחת בחממה עבור h 1 כדי לאפשר התחתון קריש לשכבה פולימריזציה. אל תלחץ חזק מספיק לגרום היווצרות בועה; טוב צלחת פשוט רוק צלחת לפי הצורך עד מצופה מכלול של הבאר. אם נעשה שימוש אחסון קריש דם גדולים יותר, צעד זה לא יהיה נחוץ.</li>
	<li>העברת spheroids על שכבת פיברין.
	<ol><li>הסר הבאר צלחת הפטרי המכיל spheroids ב התליה ירידה תרבות מן החממה, לבחון spheroids תחת מיקרוסקופ. ואז למקם את המנה וחטף תרבות.</li>
		<li>להפוך בזהירות את מכסה הפטרי כדי לאפשר גישה כדי התליה שחרר תרבויות.</li>
		<li>בזהירות באמצעות מחט 21 G המצורפת מזרק 1 מ"ל, להעביר טיפה אחת מן המכסה הפוך לתוך המרכז של כל טוב, מקפיד לא לנקב את שכבת פיברין polymerized ציפוי בתחתית הבאר. להעביר ביעילות את המסירה, לאט לאט למשוך את הירידה לתוך המחט. תפסיק למשוך את הבוכנה בחזרה ברגע הירידה כולו נמצא בתוך המחט; מושך את הירידה בחזרה לכת עשוי להציג בועות אוויר, אשר יכול לשבש העברה ספרואיד יעיל או על יצירת תמונות עוקבות.</li>
		<li>לבחון את הצלחת היטב תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח כי spheroids העבירו כראוי לתוך וולס הרצוי כל.</li>
	</ol></li> <li>להיווצרות שכבת פיברין השני, ליצור פתרון קריש דם אחר באמצעות הכנת אותו לעיל עבור יצירה של השכבה הראשונה פיברין (שלב 3.2). פיפטה 100 μL על גבי כל טיפה המכילות ספרואיד ובזהירות לבדוק תחת מיקרוסקופ שוב כדי לוודא spheroids עדיין לא נדחקו על הקצוות של הבארות.</li>
	<li>להחזיר את הצלחת היטב את החממה, לאפשר לשכבה השנייה פולימריזציה עבור ה 1</li>
</ol> 4. יום 6: תוספת של Pro-נודדים או גורמים מעכבים <ol><li>HDFn חמים למדיה-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לבצע את הפעולות הבאות בברדס למניעת זיהום.</li>
	<li>להכין מדיה עבור כל קבוצה כולל המתאים ריכוזי pro/אנטי-migratory סוכנים להערכה.</li>
	<li>הסר את לוחית טוב של חממה ומקום בשכונה תרבות.</li>
	<li>ΜL להוסיף 500 של מדיה סטנדרטי בכל טוב של קבוצת הביקורת ספרואיד μL 500 של מדיה מעכבות כל טוב של הקבוצה ספרואיד עכבות ההעברה, μL 500 של מדיה פרו-נודדת כל טוב של הקבוצה ספרואיד משופרת ההעברה.</li>
	<li>להחזיר את הצלחת היטב החממה.</li>
	<li>שינוי מדיה בכל ה 48</li>
</ol> 5. ימים 6-9: הערכה של נדידת תאים והתפשטות spheroids <ol><li>התמונה באמצעות מיקרוסקופ brightfield מיד לאחר תוספת של תקשורת (0 h), ואז כל 24 שעות עבור ה 72 אופציונלי: בכל נקודה בזמן, לקחת תמונה z-מחסנית כדי לקבוע אם ההעברה מתרחש במישורים מחוץ לאזור הראשי של המוקד. מניסיוננו זה אינו מתרחש; עם זאת, זה שימושי להבטיח זה המקרה בבכל ניסוי.</li>
	<li>שימוש ImageJ כדי לקבוע תא תוצר כל היטב על-ידי ניתוח הגדלת אחוז באזור עבור כל ספרואיד על ידי מעקב גבול התא עבור כל ספרואיד בכל נקודה בזמן רצופים באמצעות &#34; מידה &#34; פונקציה כדי להשיג את האזור.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chester, D., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+biophysical+properties+of+provisional+matrix+proteins+in+wound+repair.">The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair.</a> Matrix Biol. , (2016).</li><li>Martin, P., Leibovich, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+cells+during+wound+repair:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).</li><li>Lin, B., Yin, T., Wu, Y. I., Inoue, T., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+chemotaxis+and+contact+inhibition+of+locomotion+determines+exploratory+cell+migration.">Interplay between chemotaxis and contact inhibition of locomotion determines exploratory cell migration.</a> Nat Commun. 6, 6619 (2015).</li><li>Ngalim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+Adhesive+and+Soluble+Gradients+for+Imaging+Cell+Migration+with+Fluorescence+Microscopy.">Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li><li>Charras, G., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+influences+of+the+extracellular+environment+on+cell+migration.">Physical influences of the extracellular environment on cell migration.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 15 (12), 813-824 (2014).</li><li>Petrie, R. J., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+Lead+the+Way:+A+Unified+View+of+3D+Cell+Motility.">Fibroblasts Lead the Way: A Unified View of 3D Cell Motility.</a> Trends Cell Biol. 25 (11), 666-674 (2015).</li><li>Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonpolarized+signaling+reveals+two+distinct+modes+of+3D+cell+migration.">Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration.</a> J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).</li><li>Carlson, M. W., Dong, S., Garlick, J. A., Egles, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineered+Models+for+the+Study+of+Cutaneous+Wound-Healing.">Tissue-Engineered Models for the Study of Cutaneous Wound-Healing.</a> Bioengineering Research of Chronic Wounds. , 263-280 (2009).</li><li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration.">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> J Cell Bio. 184 (4), 481-490 (2009).</li><li>Fraley, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinctive+role+for+focal+adhesion+proteins+in+three-dimensional+cell+motility.">A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility.</a> Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).</li><li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+versus+directionally+persistent+cell+migration.">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).</li><li>Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Z&#228;nker, K. S., Dittmar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cell+Migration+within+a+Three-dimensional+Collagen+Matrix.">Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix.</a> J Vis Exp. (92), (2014).</li><li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy.">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).</li><li>L&#228;mmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li><li>Chen, Z., Yang, J., Wu, B., Tawil, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Three-Dimensional+Wound+Healing+Model.">A Novel Three-Dimensional Wound Healing Model.</a> J Dev Biol. 2 (4), 198-209 (2014).</li><li>Ross, R., Benditt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+and+collagen+formation.">Wound healing and collagen formation.</a> The J Cell Biol. 12 (3), 533-551 (1962).</li><li>Sproul, E. P., Argraves, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytokine+axis+regulates+elastin+formation+and+degradation.">A cytokine axis regulates elastin formation and degradation.</a> Matrix Biol. 32 (2), 86-94 (2013).</li><li>Almine, J. F., Wise, S. G., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+signaling+in+wound+repair.">Elastin signaling in wound repair.</a> Birth Defects REs C Embryo Today. 96 (3), 248-257 (2012).</li><li>Tracy, L. E., Minasian, R. A., Caterson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Matrix+and+Dermal+Fibroblast+Function+in+the+Healing+Wound.">Extracellular Matrix and Dermal Fibroblast Function in the Healing Wound.</a> Adv Wound Care. 5 (3), 119-136 (2016).</li><li>Cox, S., Cole, M., Tawil, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+Human+Dermal+Fibroblasts+in+Three-Dimensional+Fibrin+Clots:+Dependence+on+Fibrinogen+and+Thrombin+Concentration.">Behavior of Human Dermal Fibroblasts in Three-Dimensional Fibrin Clots: Dependence on Fibrinogen and Thrombin Concentration.</a> Tissue Eng. 10 (5-6), 942-954 (2004).</li><li>Brown, A. C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin-based+biomaterials:+Modulation+of+macroscopic+properties+through+rational+design+at+the+molecular+level.">Fibrin-based biomaterials: Modulation of macroscopic properties through rational design at the molecular level.</a> Acta Biomaterialia. 10 (4), 1502-1514 (2014).</li><li>Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+anti-inflammatory+mesenchymal+stem/precursor+cells+(MSCs)+through+sphere+formation+using+hanging+drop+culture+technique.">Preparation of anti-inflammatory mesenchymal stem/precursor cells (MSCs) through sphere formation using hanging drop culture technique.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 28, (2014).</li><li>Bainbridge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+and+the+role+of+fibroblasts.">Wound healing and the role of fibroblasts.</a> J Wound Care. 22 (8), 410-412 (2013).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מאפשר הבחינה של נדידת תאים בריפוי הפצע הקשורים ECMs באמצעות מודל במבחנה תלת-ממד. צעד מכריע בביצוע תקין של ההליך הוא התפתחות נאותה של פיברובלסט spheroids; תא ריכוז במהלך ההכנה היה אופטימיזציה לתת של ריכוז הראשונית של תאים 2,500/שחרור, ומאפשר spheroids לטופס באופן אמין על תקופת דגירה של 72 h. אם מספר לא מספיק של תאים משמשים, spheroids ולא צבורים ביעילות, ייתכן נשברים ברגע להיות מועברים ומוטבעים לתוך שכבות פיברין. אם סוגי תאים שונים משמשים, הריכוז ההתחלתי תא ו/או ספרואיד הבשלה הזמן ייתכן יותאם על מנת לקבל צורה ספרואיד עקבית, יציב. עבור סוגי התאים להתרבות בקצב איטי יותר מאשר fibroblasts, ריכוז גבוה יותר תא הראשונית ייתכן שיהיה צורך להבטיח היווצרות ספרואיד נאותה בתוך טווח זמן של 72 שעות. התאים לא יישאר בבית תלייה טיפה תרבות יותר מאשר 72 h בשל חוסר היכולת לשנות את אמצעי התקשורת על spheroids בעוד בתרבות. הבדלים בגודל ספרואיד הראשונית צפויים עקב השתנות ביולוגי הגלום; אנו הכתובת ההשתנות החל ספרואיד היווצרות מספר עקבית של תאים כדי למזער את גודל ההבדלים ככל האפשר ועל ידי נרמול צמיחה לאורך זמן כדי לאפשר להשוואות נתונים.
האתגר העיקרי ליישום של שיטה זו הוא העברת spheroids של תלייה ולשחרר תרבות לתוך המטריקס קריש דם. פרוטוקול זה משתמש מחט מזרק לרוקן את ה-droplet המכילות ספרואיד מ המכסה הפוך פטרי, אך שיטות אחרות, כגון השימוש של פינצטה או של micropipettes קשורה טיפים החתוך, ויכול להיות מיושם גם להעביר ביעילות spheroids על הדמויות ירידה מטריקס. Spheroids יועבר באופן אמין על ידי משיכת הבוכנה של המזרק אחורה מעט לפני העברת ה-droplet, ועל -ידי הבטחת כי ה-droplet הוא נשאב המחט לאט כך בועות גז לא הציג לתוך ה-droplet. הבוכנה מזרק צריך רק להיות התרחקה מספיק כדי להביא את ה-droplet כולו לתוך המחט; מושך בחזרה כל עוד יותר גם להציג בועות ומשבשים את העברת אמין spheroids לתוך הבארות של צלחת היטב. תלוי מיוחדים ירידה תרבות צלחות עשוי לשמש גם כדי לפשט את התרבות ספרואיד, אבל הם פחות עלות יעיל אמצעי לעשות זאת מאשר פשוט באמצעות צלחת רגילה.
במהלך ריפוי ויווהפצע, fibroblasts זה לפלוש לאזור הפצע לייצר נרחב סרין פרוטאזות שתוצאתה פיברין מטריקס השפלה. תאים אלה לאחר מכן לסנתז חדש מטריצה חוץ-תאית, המורכב ברובו קולגן, לתיקון רקמות פגועות. 23 מנגנון ההעברה מאפשר פלישה מבוקרת, דבר לא נתפס על ידי השיטה שלנו ומייצג מגבלה של המערכת. יש גם לציין כי fibroblasts מנוצל בשיטה זו יפרישו פרוטאזות לאורך זמן לבזות את הרשת פיברין; לכן, אם לטווח ארוך (&gt; 72 שעות) העברת מחקרים הם הרצויה, מעכבי פרוטאז, כגון aprotinin, אמור להתווסף למדיה התרבות תאים.
למרות מגבלות אלו, בשיטה זו מספק שיטה פשוטה, חסכונית, לשחזור שבו ללמוד 3D תא העברה במבחנה. בזמן מתן סביבה רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית מאשר מודלים 2D נפוץ, ניתוח צמיחה דגם התלת-ממד המתוארים בזאת שומרת על הניתוח ישר קדימה המסופקים על ידי מודלים דו-מימדית. Spheroids קל להמחיש באמצעות מיקרוסקופ brightfield או שלב פשוט, אם רצונך בכך, שיטה זו יכול בקלות לשנות עבור שימוש במיקרוסקופ זריחה fluorescently תיוג קרום התא, מטריקס חלבונים. פרוטוקול זה עשה שימוש neonatal fibroblasts עורי האדם בשל תפקידו של פיברובלסט ההעברה ב רקמות תיקון/שיפוץ. אם רצונך בכך, נויטרופילים, מקרופאגים, keratinocytes או סוגי תאים אחרים יכול לשמש assay הזה כדי להעריך כיצד שינויים במבנה קריש פיברין משפיעים על העברה של סוגי תאים אחרים המעורבים ריפוי הפצע. החומר 3D ניתן לשינוי לפי הצורך; בהתאם ליישום המבוקש, קולגן או חומרים אחרים מטריקס תלת-ממד עשוי לשמש במקום מטריצה פיברין על מנת לספק מודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. מודל שימושי ללמוד סוגיות נדידת תאים בסביבה, כמו פצע יכולה להיות מושגת עם פרוטוקול זה באמצעות keratinocytes ואת קולגן יותר מאשר fibroblasts פיברין. בשיטות המתוארות גם מאפשרים גמישות רבה יותר וחסכון נדידת תאים, פצע ריפוי מחקרים תוך יישום מודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית במבחנה , במקום לדרוש עבודה מיידית אין ויוו בעקבות מחקרים קלאסי מימדי במבחנה .

ריפוי הפצע הוא תהליך מורכב אשר התוצאות השיקום של רקמות תקינות בעקבות פגיעה. תהליך זה מחולק לארבעה שלבים חופפים הקיף על ידי hemostasis, דלקת, התפשטות, שיפוץ, שמווסתים אחד על ידי שילוב מורכב של רמזים מסיסים, תא-מטריקס אינטראקציות ותקשורת תא-תא. 1 , 2 העיבוד התזמורתי של רמזים אלה שולט שפע של תגובות הסלולר ב ריפוי הפצע כולל, חשוב, נדידת תאים. 3 , 4 נדידת תאים הוא תהליך דינמי מאוד תלויה פנוטיפים הסלולר והן את המאפיינים הביוכימי ו ביופיזיקלי של הסביבה שבה התרחשה מטריצה חוץ-תאית. 5 תאים ללא הרף לחקור את סביבתם מטריצה חוץ-תאית בתיווך אינטגרין מסלולים; תהליך זה מאפשר תאים לחוש מגוון רחב של נכסים מטריקס כולל הטופוגרפיה, קשיחות של כליאה. ניתוח דו מימדי (2D) של נדידת תאים מדגים כי ההעברה הוא מונע על ידי היווצרות lamellipodia בחוד דרך הדור של אקטין פילמנט חבילות. לאחר מכן היווצרות הידבקויות מוקד בחוד, בשילוב עם actomyosin מונע הכחשה להתכווצות בקצה נגרר, כונני התא קדימה. 6 ההעברה סלולרית תלת מימדי (3D) כיום אינה מובנת היטב, אולם מחקרים אחרונים מדגימים כי ההעברה 3D הוא שונה במידה ניכרת מאשר שצויינו תיאר מנגנון בדו מימד, והוא ככל הנראה מונע על ידי מנגנונים alterative. לדוגמה, מחקרים שנעשו לאחרונה על ידי פיטרי ואח. הפגינו, בהתאם, את המאפיינים של ה-ECM תאים ב- 3D מטריצות באפשרותך לעבור בין lamellipodium לבין lobopodium מונע מנגנונים של הגירה. 7 כיוון נדידת תאים הוא מרכיב קריטי של הפצע ריפוי התגובה, דגמי תלת-ממד של נדידת תאים הם קריטיים להבנת תגובות פיזיולוגיות לגירויים שונים במהלך ריפוי הפצע. למרות בהתנהגות התא נודדים על משטחים 2D הוכח שפתרון של ההעברה ב- 3D מטריצות, ביותר במבחנה המודלים הנוכחיים של נדידת תאים במהלך תהליך, כולל assay מאפס, ומבוססת על ריפוי הפצע לנצל 2D טפט תרבויות. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 יותר לאחרונה פיתח מבחני נעזרו מטריצה תלת-ממד, אך עדיין התרבות תאים חד שכבתי על גבי המטריצה, ובכך יגביל את היכולת באמת לסכם את אתמהא של הסביבה תא ויוו. 15
מטרת השיטה המתוארת כאן היא ללמוד נדידת תאים דגם תלת-ממד רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, ולא על משטח דו-מימדית, על מנת להשיג הבנה עמידים יותר של תגובות ההעברה המשויך הגירויים יישומית. שיטה זו מאפשרת על ההערכה של נדידת תאים בתוך מטריצה קריש פיברין 3D בנוכחות גורמים להפעיל או לעכב מסלולים הקשורים עם נדידת תאים. מטריצה פיברין נבחרה עבור שיטה זו עקב הפעלת פיברין תפקיד קריטי בשלבים המוקדמים של ריפוי הפצע; פגיעה הבאים, קריש פיברין נוצר בתוך הפצע סביבות לבלום את אובדן הדם ומשמש לפיגום חדירה לתא ההתחלתי במהלך שיפוץ ותיקון רקמות. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . בנוסף, פיברין משמש קלינית כמו איטום כירורגי, ההרכב של אוטמים היתה קשורה נדידת תאים ו- ultimate ריפוי תוצאות. מחקר קודמות מאת קוקס ואח. חקר פיברובלסט הגירה עם קרישי פיברין מורכבת פיברין משתנות ובתמצית תרומבין לצורך מיטוב של פיברין. במחקרים אלה, נדידה של תאים מחוץ קרישי פיברין על גבי כלים פלסטיק הייתה לכמת. 20 . אנו מציגים שיטה המאפשרת על כימות של נדידה של תאים בתוך הסביבה פיברין תלת-ממד. בעוד השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה באופן ספציפי משתמשת פיברין, מודל זה יכול בקלות להיות שונה להשתמש בחומרים אלטרנטיביים מטריקס כרצונכם, כגון קולגן או אחרים מטריצות תלת-ממד. בנוסף, אנו מציגים את השימוש פיברובלסט spheroids assay הזה כי ההעברה פיברובלסט. לתוך המיטה הפצע היא בעלת חשיבות עליונה סינתזה מטריצה חוץ-תאית, רקמות תיקון/שיפוץ. עם זאת, במהלך התיקון תהליך נויטרופילים הם סוג התא הראשון להעביר לתוך המיטה הפצע, ואחריו מקרופאגים. Fibroblasts אז מתחיל לחדור את הסביבה הפצע כ- 48 שעות לאחר הפגיעה, בתחילת השלב המקדימות תהליך ריפוי הפצע. 19 assay הזה יכול בקלות לשנות כדי לכלול נויטרופילים, מקרופאגים או סוגי תאים אחרים כדי להעריך כיצד שינויים במבנה קריש פיברין משפיעים על ההעברה אחד מסוגי התאים. 21
כדי ליישם את assay, ראשית, ספרואיד פיברובלסט נוצר באמצעות שינוי של טכניקות שתואר קודם לכן לתרבות תאי גזע. 22 ספרואיד פיברובלסט לאחר מכן מועבר לתוך מטריצה פיברין 3D ואז תוצר יכול להיות בקלות תחת פיקוח לכמת על פני מספר ימים. פרוטוקול זה לוקח בחשבון את מימד של מערכות פיזיולוגיות על-ידי הטבעת תא 3D spheroids בתוך מטריצה פיברין, וכך להימנע המגבלות ב רלוונטיות הביא על ידי באמצעות משטח צמיחה דו-מימדית טפט תא מודל להתנהגות הנדידה, בזמן מתן אפשרות להערכת בהתנהגות התא בסביבה מבוקרת מאוד במבחנה .

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;Materials&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine</td><td>VWR</td><td>VWRL0148-0500</td><td>DMEM already containing L-glutamine can also be used</td></tr><tr><td>100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic</td><td>VWR</td><td>10861-594</td><td>Dishes of any size can be used for hanging drop culture&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C-500ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1680149</td><td>Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Human Dermal Fibroblasts, neonatal</td><td>Thermo Fisher</td><td>C0045C</td><td>Can be replaced with other cell type of interest</td></tr><tr><td>21 G x 1 1/2&#039; needle</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>305167</td><td>22 G x 1 1/2 needles will also work</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>VWR</td><td>89174-491</td><td>Syringes of any volume can be used</td></tr><tr><td>Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells)</td><td>VWR</td><td>82051-004&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>FIB 3</td><td>Can be replaced with matrix protein of interest</td></tr><tr><td>Human Alpha Thrombin</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>HT 1002a</td><td>May not be necessary depending on matrix protein of interest</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;Equipment&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSL2 cell culture hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope with 10X objective</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge compatibile with 15 mL tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

characterizing cell migration within three-dimensional in vitro wound environments

כיום, רוב במבחנה מודלים של פצע ריפוי, כגון מבחני מאפס ומבוססת, לערב לומד תא העברה וגמר הסגר על משטחים דו-ממדית. עם זאת, הסביבה פיזיולוגיות אשר ויוו ריפוי הפצע מתקיים הוא תלת מימדי ולא דו מימדי. כעת ברור יותר ויותר בהתנהגות התא משתנה במידה רבה בין מימדי לעומת סביבות תלת-מימדי; לכן, אין צורך יותר מבחינה פיזיולוגית הרלוונטיים במבחנה מודלים עבור לומד התנהגויות ההעברה תא לסגירת הפצע. השיטה המתוארת במסמך זה מאפשר לחקר נדידת תאים במודל תלת-ממדי שמשקף טוב יותר בתנאים פיזיולוגיים מאשר שנקבעו קודם מימדי מבחני מאפס. מטרת מודל זה היא להעריך תא תוצר באמצעות הבחינה של נדידת תאים מהגוף ספרואיד מוטבע בתוך מטריצה פיברין בנוכחות גורמים פרו - או אנטי - migratory. באמצעות שיטה זו, תוצר תא מהגוף ספרואיד במטריצה תלת מימדי יכול להיות שנצפו והוא לכימות בקלות לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופ brightfield וניתוח של ספרואיד הגוף באזור. גם ניתן להעריך את ההשפעה של גורמים פרו-נודדים ו/או מעכבות על נדידת תאים במערכת זו. שיטה זו מספקת חוקרים שיטה פשוטה של ניתוח נדידת תאים הפצע תלת ממדי משויכות מטריצות במבחנה, ובכך מגדילים את הרלוונטיות של חוץ גופית בתוך התא מחקרים לפני השימוש ב- vivo חיה מודלים.

ספרואיד תרבות יכול להיות מנוצל כדי להעריך את ההשפעה של סוכנים pro אנטי הנדידה על ההעברה פיברובלסט במבחנה בהצלחה Spheroids פיברובלסט 3D יכול להיווצר באמצעות תלוי תרבות טיפה על פני תקופה של 72 h (איור 1). בעקבות תקופת תרבות, spheroids מוטמעים בתוך המטריצה קריש דם, עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ brightfield (איור 2). האזורים הראשונית של spheroids (מתואר באיור כמו האזורים ותחום על-ידי גבולות לבן) היו נחושים באמצעות ImageJ ומשמשת כנקודת התייחסות כדי לקבוע את מידת תא עוקבות תוצר של הגופים ספרואיד. מידות שטח ממוצע הראשוני עבור spheroids נקבעו להיות 4.3 x 104 μm2 ± 1.1 x 104 μm2 עבור spheroids שליטה, 4.4 x 104 μm2 ± 1.1 x 104 μm2 עבור נודדות-pro spheroids, 4.5 x 104 ± 7.7 x 103 μm2 עבור spheroids אנטי-הנדידה. המדיה המכילה גורמים פרו - או אנטי - migratory נוספה הקרישים המכילות ספרואיד, תוצר תא מהגוף ספרואיד הראשוני היה עם תמונה כל 24 שעות, עם סופי תמונות שצולמו 72 h אחרי התקשורת המקורית נוספה (איור 3).
עם סיום הניסוי, ספרואיד צמיחה לאורך זמן נותחו באמצעות ImageJ כדי לחשב את השינויים באזור ספרואיד עבור כל דגימה. כפי שמוצג באיור3, הקצה החיצוני של האשכול תא בכל נקודה בזמן שימש כדי לקבוע את מידת הזמן ספציפי תא תוצר. אנו מצפים כי המקומות out-of-להתמקד בתרשים 3 הם שאריות תאים, אנחנו. לא להחשיב את זה בכימות שלנו. תמונות בגודל מלא להראות גבול ברור, רציף תא העולה מן הגוף ספרואיד; . זה גבול זה זה נמצא במעקב כאשר קביעת תוצר... תא תוצר הייתה לכמת על ידי נרמול האזור תוצר תא יחסית באזור הגוף ספרואיד המקורי ב- t = 0 h ולאחר מכן לבטא את הצמיחה כאחוז באזור ספרואיד המקורי. כימות של תוצר התא על התקופה 72 h מגלה spheroids נחשף סוכן pro-נודדת התערוכה תואר ולעלייה משמעותית של הגירה, והגוף ספרואיד המקורי לעומת spheroids חשוף סוכן הגירה-מעכבות וכדי spheroids שליטה נחשפים סטנדרטיים מדיה (p &#60; 0.0001, איור 4). לעומת זאת, spheroids נחשף סוכן אנטי-הנדידה הציג ירד משמעותית מעלות הגירה, והגוף ספרואיד המקורי בהשוואה לשלוט spheroids (p &#60; 0.0001).
לשם השוואה, סיפקנו דוגמה assay מאפס (איור 5). Assay זה בוצע על ידי זריעה fibroblasts תאים/cm 500,0002 -24 באר-צלחות מצופה פיברינוגן 2 מ"ג/מ"ל. Fibroblasts הותר לגדל בן לילה. השטח טוב אז היתה שרוטה. עם טיפ פיפטה, נדידת תאים לתוך אזור האחסון הזמני צולמה מעל 24 שעות. כפי שמוצג להחליפן בתמונות שהוצגו איור 5א, קיימות מגבלות כדי assay הזה; שריטות אינם מאוד לשחזור, במקרים מסוימים, הגבולות לא ברור מפורטים. עם זאת, המגמות ההעברה הכוללת בנוכחות גורמים פרו - ו אנטי - migratory הם זהים לאלה נוכח וזמינותו ספרואיד תלת-ממד, למרות השונות הנ ל ואת ההבדלים מצבים של ההעברה. יצוין, כי מחירי העברה מהירים ב- 2D וזמינותו מאפס, בהשוואה וזמינותו ספרואיד תלת-ממד. הסגר המהירה בנוכחות הסוכן pro-הנדידה, כל דוגמאות תרבותי בנוכחות הסוכן pro-הנדידה נסגרו לחלוטין בתוך 24 שעות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56099/56099fig1.jpg"> 
איור 1 : האדם fibroblasts עורי בתלייה טיפה תרבות. תאים נותרו בתלייה טיפה תרבות 72 h לזירוז ספרואיד היווצרות. העליון (A) עם נוף צדדי (B) של התליה טיפה תרבות מוצגים. (ג) מפרטים טכניים המתארים נוף צדדי היווצרות ספרואיד בטיפה לתלייה. הקו השחור מייצג את החלק העליון של הצלחת, לספרה ורוד מייצג את המדיה, ולייצג הכדורים הסגולים התאים בתוך ספרואיד. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56099/56099fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56099/56099fig2.jpg"> 
איור 2 : ספרואיד המראה לאחר ההטמעה הראשונית במטריצת פיברין (t = 0 h אחרי תוספת של מדיה) עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ brightfield בהגדלה X 10- (א, ד) ספרואיד שליטה; (B, E) ספרואיד נחשף סוכן אנטי-הנדידה בתקשורת; (ג, F) ספרואיד נחשף סוכן pro-הנדידה בתקשורת. ללא (A-C) לבן והקווים זה של תמונות מוצגות עם (D-F) מצביעים על גבולות לקביעת אזור תוצר. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56099/56099fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56099/56099fig3.jpg"> 
איור 3 : המראה ספרואיד לאחר 72 h עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ brightfield בהגדלה X 10- (א, ד) ספרואיד שליטה; (B, E) ספרואיד נחשף סוכן אנטי-הנדידה בתקשורת; (ג, F) ספרואיד נחשף סוכן pro-הנדידה בתקשורת. ללא (A-C) לבן והקווים זה של תמונות מוצגות עם (D-F) מצביעים על גבולות לקביעת אזור תוצר. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56099/56099fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56099/56099fig4.jpg"> 
איור 4 : צמיחה ספרואיד מעל 72 ה' סוכנים pro-הנדידה נודדת אנטי בתקשורת מוצגים כדי להשפיע באופן משמעותיפיברובלסט ההגירה והתפשטות בתוך סביבות תלת-ממד. N = 3/קבוצה; * מייצג p &#60; 0.0001. קווי שגיאה מייצגים סטיות תקן. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56099/56099fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56099/56099fig5.jpg"> 
איור 5 : השוואה עם תקן 2D assay מאפס. (א) להחליפן בתמונות של נדידת תאים ב- assay מאפס סטנדרטי מעל 24 שעות. Fibroblasts גדלו בתקשורת ממוזגים עם גורמים פרו - או אנטי - migratory, הבדלים הסגר מאפס היו לכמת לאורך זמן. (B) הסגר אחוז לאורך זמן fibroblasts גדל שליטה, pro-ציפורים נודדות, או מדיה אנטי הנדידה. למרות שיש הבדלים בין דרכי ההעברה נוכח זה וזמינותו 2D לעומת וזמינותו ספרואיד תלת-ממד, מגמות ההעברה הכוללת נשאר עקבי. N = 3/קבוצה; * מייצג p &#60; 0.05. קווי שגיאה מייצגים סטיות תקן. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56099/56099fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments at JoVE.com

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

המטרה של פרוטוקול זה היא להעריך את ההשפעה של גורמים פרו - ו אנטי - migratory על נדידת תאים בתוך מטריצה תלת מימדי פיברין.

אפיון נדידת תאים בתוך תלת מימדי במבחנה פצע סביבות

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

characterizing-cell-migration-within-three-dimensional-vitro-wound

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

7.6K Views.  North Carolina State University and The University of North Carolina - Chapel Hill. המטרה של פרוטוקול זה היא להעריך את ההשפעה של גורמים פרו - ו אנטי - migratory על נדידת תאים בתוך מטריצה תלת מימדי פיברין.

Video: Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

הערכה של הפלישה התא, תהליך ההעברה: השוואה של השריטה מבוסס-מיקרוסקופ וידאו פצע Assay ואת וזמינותו קאמרית בוידן

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Cancer Research

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

נעים כלפי מעלה: פשוט וגמיש במבחנה הפלישה תלת מימדי Assay פרוטוקול

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

מכשיר לביצוע נדידת תאים / ריפוי פצעים צלחת 96-ובכן

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Developmental Biology

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

מערכת ג&#39;ל קונצנטריים כדי ללמוד את תפקיד Biophysical של מטריקס מייקרו-סביבה על נדידת תאי 3D

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

הרומן במבחנה פצע ריפוי הנועד להעריך את נדידת תאים

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

Immunology and Infection

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated experimental procedures, while potentially lacking in precision. In vitro culture of epithelial cell lines provides a suitable platform for researching the cell migratory behavior in wound healing and the impact of treatments on these cells. The physiology of epithelial cells is often studied in non-confluent conditions; however, this approach may not resemble natural wound healing conditions. Disrupting the epithelium integrity by mechanical means generates a realistic model, but may impede the application of molecular techniques. Consequently, microscopy based techniques are optimal for studying epithelial cell migration in vitro. Here we detail two specific methods, the artificial wound scratch assay and the artificial migration front assay, that can obtain quantitative and qualitative data, respectively, on the migratory performance of epithelial cells.

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

This manuscript describes how incision-like lesions made on cultured epithelial cell monolayers conveniently model wound healing in vitro, allowing for imaging by confocal or laser scanning microscopy, and which can provide high-quality quantitative and qualitative data for studying both cell behavior and the mechanisms involved in migration.

מיקרוסקופ המבוסס על שיטות להערכה של נדידת תאים אפיתל במהלך במבחנה ריפוי הפצע

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Medicine

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

נדידת תאים במבחנה ומבחני פלישה

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Biology

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

שיטת העברת שריטות וחדר מתקפל לחלל מתורבת בניתוח Vivo של ריפוי פצעים

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

Quantifying Three-Dimensional Cell Migration Within and Into Granular Hydrogel Biomaterials

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for tissue integration. This article introduces two novel approaches for quantifying cell migration within and into granular hydrogels, highlighting the distinct applications of these scaffolds. First, a cell monolayer interface assay that simulates tissue growth into granular hydrogels for integration purposes is presented. Second, a spheroid-based assay is described, designed to track cell movement within the hydrogel matrix, specifically suited for applications involving cell delivery. Both methods enable precise and controlled measurements of cell migration, providing a comprehensive toolkit for researchers utilizing granular hydrogel scaffolds. The motivation for these methods stems from the need for tailored control over cell migration within the scaffold to align with specific applications. By optimizing and standardizing these quantification techniques, researchers can iteratively refine granular hydrogel properties, ensuring their effectiveness in diverse regenerative medicine contexts. This robust set of quantitative tools offers new opportunities to enhance granular hydrogel scaffolds, advancing their use in both cell delivery and tissue integration applications.

A protocol for the quantitative evaluation of 3D cell migration within and into the interface of granular hydrogels is presented here.

כימות נדידת תאים תלת מימדית בתוך ובתוך ביו-חומרים הידרוג'ל גרגירים

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for ...