Name: high-resolution episcopic microscopy (hrem) - simple and robust protocols for processing and visualizing organic materials
Uploaded: 2017-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
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著者はTim Mohunに、サンプルを提供するためのHREMとPetra Heffeterの開発に貢献してくれたことに感謝します。

すべての手順は、ウィーン医科大学の倫理ガイドラインに従って実施した。 サンプル調製<ol><li> 胚と胚の組織を準備する（最大5 x 5 x 5 mm 3 ） <ol><li> 4℃で4％PFA / PBSまたはBouin固定液中の胚または胚の一部を固定し、少なくとも16〜24時間一定ロッキング下で固定する。 注：48時間のゼブラフィッシュ、19時間のニワトリおよびウズラ、および出生前のマウス胚など、いくつかの種および様々な発達段階の胚を使用することができます（ 代表結果を参照）。検体を採取し、固定液に入れる前に、ステージングのために室温でPBSに移した。必要に応じて、埋め込み型にフィットするように固定する前に、マイクロハサミまたはメスで標本をトリムします。 </li><li>固定液を除去し、4℃でPBS中の胚組織を洗浄する。一定のロッキング下でgで24時間（2-3回の変化）。 </li><li> 70％、80％、90％、96％エタノール中のサンプルを4℃で2〜3時間脱水する。試料が入っているチューブを回転装置に置きます。 注：小さなサンプル（&lt;2 x 2 x 2 mm 3 ）では、サンプルが各エタノールに入っている時間を60分に短縮することができます。大きなサンプル（&gt; 5 x 5 x 5 mm 3 ）では、4時間まで延長することができます。 </li><li>防護手袋を着用している煙霧ボンネットの下で以下の浸透ステップを実行します。 <ol><li> 1.25gの過酸化ベンゾイル（可塑化触媒）と0.4gのエオシンを100mLの溶液Aに添加することにより浸潤溶液を調製する（詳細については、 表の表を参照）。エオシンと触媒が完全に溶解するまで（2-3時間）、磁気攪拌プレート上のビーカーで4℃で撹拌する。 </li><li>浸潤溶液に試料を12〜24時間置く。連続的な揺れや回転のもとで4℃に保つ。 3と12の後に浸透溶液を新鮮な溶液に交換するh。 注：大型胚（&gt; 1cmクラウン/臀部の長さ）では、浸潤時間を48時間に延長する。 </li></ol></li></ol></li><li> 成体組織サンプルを調製する（最大5×5×7mm 3 ） <ol><li>少なくとも3日間4℃で4％のコール酸を含む2％PFA / PBSで組織を固定する。 注：このソリューションでは、皮膚、肝臓、膵臓、腎臓、甲状腺、心臓、線条筋肉、脳、神経およびいくつかの新生児および成人、げっ歯類、ブタ、ミバエおよびゼブラフィッシュの腫瘍モデルに由来する組織サンプルを固定することができますHREMイメージングのために処理されます（サンプルの修正を示します; 代表結果を参照）。メス、はさみまたは生検パンチで組織サンプルを切り出し、固定剤に直接移す。神経組織を固定するには、4％PFA / PBSを使用する。 </li><li>固定剤を除去し、実行中の水道水の下で組織を3〜6時間洗う。 </li><li>続いてプラックでサンプルを脱水する70％、80％、90％、96％エタノール中でそれらを100mL当たり0.4gのエオシン（各2-3時間）と混合する。サンプルを4°Cで一定のロッキングまたはローテーター下に保ちます。 注：小さなサンプル（&lt;2 x 2 x 2 mm 3 ）では、サンプルが各エタノールに入っている時間を60分に短縮することができます。大きなサンプル（&gt; 5 x 5 x 5 mm 3 ）では、4〜8時間に延長することができます。 </li><li>防護手袋を着用したヒュームフードの下で以下の浸透ステップをすべて実行してください。 <ol><li> 1.25gの過酸化ベンゾイル（可塑化触媒）と0.4gのエオシンを100mLのSolution Aに加えて浸透溶液を調製する（詳細は表の表を参照）。エオシンと触媒が完全に溶解するまで（2-3時間）、磁気攪拌プレート上のビーカーに4℃でかき混ぜる。 </li><li>試料を24〜36時間浸透溶液に入れる。連続的な揺れや回転のもとで4℃に保つ。 3の後、浸透溶液を新鮮な溶液に交換する。12時間。 注：大きなサンプル（&gt; 5 x 5 x 5 mm 3 ）の場合、浸透時間を48時間に延長します。 </li></ol></li></ol></li><li> 他の有機材料の準備 注：通常のはさみで、皮膚の代用品と用紙を所望のサイズにトリムします。固定は必要ありません。 <ol><li>固定、脱水、脱水の手順を省略します。 </li><li>防護手袋を着用したヒュームフードの下で以下の浸透ステップをすべて実行してください。 <ol><li> 1.25gの過酸化ベンゾイル（可塑化触媒）と0.4gのエオシンを100mLのSolution Aに加えて浸透溶液を調製する（詳細は表の表を参照）。エオシンと触媒が完全に溶解するまで（2〜3時間）、磁気攪拌プレート上で4℃でビーカー中で撹拌する。 </li><li>浸透溶液にサンプルを3〜12時間置く。連続的な揺れや回転のもとで4℃に保つ。浸透溶液を1〜2時間後に新しい溶液に交換する。 </li></ol> &lt;/ li&gt; </ol></li></ol>埋め込み注記：保護手袋を着用しているフュームフードの下ですべての手順を実行します。 <ol><li>上記のように新鮮な浸潤溶液を調製する（ステップ1.1.4.1）。浸透溶液100mLに溶液B（詳細は表を参照）4mLを加えて包埋溶液を調製する。 注記：包埋モールド内の試料の正確な向きが必要であり、いくつかのサンプルを平行に埋め込むことができるようにするには、ビーカーを氷浴に入れてストック溶液の重合を遅くします。 </li><li> 6 x 8 x 5 mm 3または13 x 19 x 5 mm 3の定型容積の金型または最大8 x 10 x 15 mmのボリュームを持つカスタマイズされた金型を使用して、成形カップトレイ（詳細は表を参照）を使用してください3 （ 図2 ）。 </li><li>金型に包埋溶液を充填し、金型に試料を移す。スプーン。移送中は、空気トラップを避けるためにサンプルが包埋溶液で完全に覆われていることを確認してください。 注：これは、試料および冷蔵庫からの包埋溶液を収集した直後に開始する場合、室温で行うことができる。 <ol><li>ニードルまたは鉗子を使用して型の内側にサンプルを向ける。 </li><li>埋め込み溶液が粘性になるとすぐに、金型の上にブロックホルダー（ 材料の表を参照）を置​​き、ブロックホルダーの底面が1〜2で覆われるまでブロックホルダーの中心穴に埋め込み溶液を加えますmmである。 </li><li>モールドカップトレイを液体パラフィンワックスで覆いシールし、硬化するまで待ちます。あるいは、サンプル付きのモールドカップトレイに第2のモールドカップトレイを上下逆に置き、粘着テープで密封して防塵します。 </li></ol></li><li>密封された成形カップのトレイを1〜室温で2日間。 </li><li>重合後処理のためには、標準的な実験室オーブンに重合ブロックを入れた成形カップトレイを置き、暗赤色になるまで最低1〜2日間70〜80℃で焼きます。オーブンからトレイを収集し、金型からブロックを取り出します。 注：ベーキングは通常の環境条件で行うことができます。埋め込み後の第1段階の気密シールを確実にする被覆成形カップトレイは、10時間後に樹脂の色をチェックできるように取り除くことができる。ベーキングの直後、樹脂は柔らかく、ブロックは成形カップトレイから容易に取り外すことができる。 2〜3時間以内に、それらは硬く、数ヶ月間室温で保存することができます。 </li></ol> 3.データ生成注：ここで使用されているHREMプロトタイプ18,25は、以下の項目で構成されています。（i）ブロックホルダー付きロータリーミクロトーム各切断の後にその上方転向点で停止する。 （ii）標準の使い捨てではないミクロトームナイフ、硬質金属、プロファイルD（詳細は表を参照）。 （iii）対物レボルバーおよびGFP-フィルター立方体（励起470/40;発光フィルター525/50）をその光軸に有する蛍光化合物顕微鏡のヘッド。光軸は、ミクロトームに取り付けられたブロックの新たに切断された表面に対して垂直に配置され、上下運動を可能にする装置によって保持される。 （iv）ミクロトームを担持する電動クロステーブル。テーブルは、光軸の方向および横方向にシフトすることができる。 （v）蛍光化合物顕微鏡に取り付けられたデジタルビデオカメラ。 （vi）モノクローム光源（470nm）。 （vii）カメラに接続されたコンピュータ、データ生成ソフトウェア（詳細は表を参照）。 <ol><li> 手順 <ol><li>関心のある領域を示します。 <ol><li>標準的な実験室のリ白色光をブロック面に斜めに照射するための光源（ 表の表を参照）。 </li><li>埋め込みマテリアルの輪郭をブロックサーフェスに投影する際にその輪郭を特定します。ペンまたはカミソリの刃を使用して、関心領域および後の視野をブロック表面上に示す。 注：この手順は、セクション化する前に視野の範囲を定義するために必須です。 </li></ol></li><li>視野を定義します。 <ol><li>ミクロトーム上にサンプルを含む樹脂ブロックをマウントします。 </li><li>ブロックホルダーを停止位置に移動します（ブロックホルダーエクスカーションの上部転回点）。 </li><li>デジタルカメラとデータ生成ソフトウェアを起動し、ライブイメージを取得します。 </li><li>ブロック面に表示された関心領域をカバーするために適切な倍率で対物レンズを選択します。 注：倍率が2.5倍、5倍、10倍、20倍、開口数が0.07〜0.40のものがよく使用されます。 </li&gt; <li>関心領域がコンピュータ画面上に表示される視野と一致するまで、電動クロステーブルを使用して、視神経を上下左右に動かします。 </li></ol></li><li>フォーカス。 <ol><li>サンプルの最初の構造が目に見えるようになるまで手動でセクションを段階的に実行します。 </li><li>ミクロトームを光軸の方向に動かすことによって、光学系の焦点面内にブロック面を配置する。 </li><li>セクションの厚さを選択します。セクションの厚さは0.5〜5μmが推奨されます。 </li></ol></li></ol></li><li> データの生成と処理 <ol><li>セクションとイメージのキャプチャを調整するソフトウェアルーチンを起動します。画像キャプチャソフトウェアの文書化された指示に従ってください。 </li><li>ソフトウェアルーチンを停止し、サンプルが完全に分割されるとすぐにブロックサーフェスの前面にスケーリングスライドを配置します。 </li><li>後のキャリブレーションのために画像をインタラクティブにキャプチャする。 注：これは、新たに設定された設定で目的が使用されるたびに実行されなければなりません。 </li><li>画像シリーズを8ビットグレースケール画像in.jpg形式に変換します。 </li><li>画像シリーズを3Dビジュアライゼーションソフトウェアにロードし、コントラストを調整します。 注：イメージ変換と3Dビジュアライゼーションは、それぞれのソフトウェアの指示に従って、さまざまな商用または自由に利用可能な標準ソフトウェアパッケージで行うことができます。 </li></ol></li></ol>

著者は何も開示することはない。

HREMは、生物医学および産業分野で使用される広範囲の有機材料を視覚化するのに理想的な、非常に堅牢な顕微鏡法である18,21,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37 、 38,39,40 。それは、発達障害メカニズム（DMDD）プログラム41,42によって現在使用されているように、独占イメージングモダリティとして使用することができる<sup&gt;、 43,44またはマルチモーダルイメージングパイプライン45の統合部分として使用することができる。 完全に機能するHREMデータ生成装置は、従来の実験室構成要素から組み立てることができ、電動ミクロトーム、顕微鏡、電動クロステーブル、および適切なソフトウェア25を備えたコンピュータを含む。定義された位置で各セクションの後に再現可能に停止するブロックホルダーと、光路内のGFPフィルターキューブを備えたミクロトームを使用することが重要です。ただし、完全に機能するオールインクルーシブソリューションは、Indigo Scientificなどの企業から購入できます。 HREMは、切片作成または切片マウント中にアーチファクトが導入されないことを除いて、すべての組織学的技術と同じ制限に直面する。しかし、切片化する前に標本を染色する必要性から生じる制限があります。埋め込み材料の特性から決定する。十分な組織のコントラストを得るためには、標本全体を通してのエオシンの浸透が必要である。脂肪組織および無機物質は、エオシンの浸透を効果的に妨げ、この結果、物体の中心に染色されていない組織が生じる。特別な固定剤を使用すると、皮膚の標本を汚すのに役立ちますが、問題を完全に解決するための適切な方法はまだありません。もう1つの制限は、2cmよりも高くブロックする樹脂が切断中に破損する傾向があることである。これは、試料と加工部品を別々に切断することによって部分的に回避することができます。 埋め込みの間に金型内の不規則な表面を有する小さなサンプルまたはサンプルの正しい位置決めが問題となることが多い。アガロースでサンプルをカバーし、プロトコルに記載されているようにアガロースブロックを処理すると、通常この問題が解決されます19 。別の方法は、ブロックが部門間に壊れた場合に役立ちます既に硬化したブロックをそのホルダーから取り外し、前述の埋め込み手順に従って新たに埋め込むことである。 典型的なHREMデータセットは、500から3,000の単一画像を含む。その数値分解能は、連続画像間の距離（ すなわち 、断面厚さ）、カメラターゲットの特性、および利用される光学系の特性によって決定される。提示されたプロトコールはアーチファクト20,46からの輝きを完全に排除するものではないが、1μm〜5μmの断面厚さを使用し、良好な結果を達成した。これらのアーチファクトは、ブロック内部の深部に位置する激しく染色された組織によって引き起こされ、その結果ブロック表面上の組織情報のぼけが生じる。 カメラの目標寸法は、2,560×1,920ピクセル2,2048×2,048ピクセル2,4,096×4,096ピクセル2であり、コンビネーション1.25倍、2.5倍、5倍、10倍、20倍の対物レンズを搭載しています。これは、0.18×0.18μm2と5.92×5.92μm2の間の数値ピクセルサイズをもたらし、これは、組織構造および細胞形状の3D解析、ならびに核の視覚化に十分であることが判明した。高い数値分解能が与えられれば、他の細胞オルガネラも同様に可視であるべきである。単純なエオシン染色のためにコントラストが不十分であり、目的物の光学特性が構造を識別する可能性を劇的に低下させる。開口数を考慮したHREMデータの最大真の空間分解能はおよそ1 x 1 x 1μm3であるため、およそ3 x 3 x 3μm3を超える構造の有効な識別が可能になります。 すべてのデジタル画像技術に共通する問題は、視野の大きさと、表示可能な標本の部分を定義するカメラターゲット上のd、および画像の数値解像度。視野が広いほど、可能な限り最大の数値分解能が得られます46 。ここで使用するHREM設定では、0.18 x 0.18μm2および12.12 x 12.12 mm 2 （1.25X対物レンズ）の数値分解能で表示された0.74 x 0.74 mm 2 （20X対物レンズ） 2.96×2.96μm2の数値分解能。代替の商業化されたセットアップは、より大きな視野を提供することができますが、真の解決を犠牲にします。それにもかかわらず、DMDDプログラム47のホームページに表示されるデータから明らかなように、優れた結果を提供する。

有機および無機材料の構造解析は、その物理的性質および機能を理解するための第一歩である。そのような分析の基礎は、組織構造、細胞形態およびトポロジー、分子組成および生体力学的特性の詳細を抽出する、様々な単純で洗練された画像化方法を用いて、組織学的セクションを注意深く観察することによって得られる二次元（2D） 2,3 。しかしながら、2D情​​報は、空間的に複雑な配置を研究するのには適していない。したがって、デジタルボリュームデータの生成を可能にする生体 内および生体外の方法の数が過去数十年に確立され、さらに多くが開発中である。 大部分のボリュームデータ生成方法の原理的な原理は、仮想スタックの生成であるオブジェクトの仮想または物理的な区切りによって得られたセクションを表示するデジタル画像のことである。セクションイメージが適切に整列されている場合は、仮想断面平面で再分割するか、3Dサーフェスおよびボリュームレンダリングモデルを作成するためにボリュームを作成します。人間とより大きな生物学的試料を可視化するための一般的な技術は、磁気共鳴断層撮影（MRT）、コンピュータ断層撮影（CT）、陽電子放射断層撮影（PET）および単一光子放出コンピュータ断層撮影（SPECT）である。小さな検体は、通常、マイクロ磁気共鳴イメージング（μMRI）、光学投影トモグラフィー（OPT）、光干渉断層撮影（OCT）、光音響トモグラフィー（PAT）、組織学的断面化法、共焦点顕微鏡法、および電子断層撮影法を用いて視覚化される。 、 7,8,9,10 <sup&gt;、 11,12,13,14,15,16,17 。 小標本および組織学的組織サンプルのデジタルデータを生成する比較的新しいボリュームデータ生成技術は、Tim Mohun 18,19と密接に協力して開発されたHREM法です。これは、ミクロトーム上で切片化された樹脂埋め込み材料からデジタルボリュームデータを生成する、単純な顕微鏡ベースの技術である。このデータは、組織構造および細胞分布の詳細な分析ならびに中間の光学顕微鏡レベルでの小さな特徴のメトリック分析を容易にする。 HREMは、eからキャプチャしたように見える、本質的に整列したデジタル画像のスタックを生成しますosinで染色された組織切片。視野に関する組織コントラストおよびデータ解像度は、μCT、μMRI、およびOPTで生成されるデータのそれを上回るが、共焦点、光シートおよび電子顕微鏡で得られるデータよりも低い20 。しかし、後者とは対照的に、HREMは、5×5×7mm 3までの比較的大きな体積の組織標本を組織学的品質で視覚化することができる。最近のいくつかの研究では、単一イメージング技術の長所と短所の詳細な特徴付けと比較が行われており、客観性のために、それらの限界と応用分野4,21,22,23,24,26,27,28,29,27,28,29 、 24 。 本研究では、HREMイメージング法に焦点を当て、広いスペクトルの有機材料のHREMデータを生成するための非常に簡単なプロトコルと、その応用の例。 HREMデータを作成するワークフローは簡単で、メタクリレート樹脂に埋め込むことができるすべての材料に適用されます（ 図1 ）。しかし、試料調製には組織特異的な違いがあり、考慮する必要があります。したがって、我々は様々な試料を調製するための3つの標準的なプロトコルを提供する。埋め込みとデータ生成プロトコルの手順は、すべて同じです。

<table><tbody><tr><td>JB-4 Plus Embedding Kit</td><td>Polysciences Europe GmbH</td><td>18570-1</td><td>includes Benzoyl Peroxide, Plasticized (Catalyst) and Solution A+B</td></tr><tr><td>Polyethylene Molding Cup Trays, 6 x 8 x 5 mm hexagon (9 cavities)</td><td>Polysciences Europe GmbH</td><td>17177A-3</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Molding Cup Trays, 13 x 19 x 5 mm (9 cavities)</td><td>Polysciences Europe GmbH</td><td>17177C-3</td><td></td></tr><tr><td>JB-4 Plastic Block Holders</td><td>Polysciences Europe GmbH</td><td>15899-50</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Waldeck GmbH &amp;amp; Co. KG, Division Chroma</td><td>1A-196</td><td></td></tr><tr><td>Microtec CUT 4060E</td><td></td><td></td><td>rotary microtome</td></tr><tr><td>Leica DM LM, fluorescence compound microscope</td><td>Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP filter set</td><td>Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td><td>11090937180000</td><td></td></tr><tr><td>Motorised cross table</td><td>Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH &amp;amp; CO. KG</td><td>KT5-LSMA</td><td></td></tr><tr><td>Digital video camera SPOT-FLEX</td><td>Visitron Systems GmbH.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>precisExcite High-Power LED</td><td>Visitron Systems GmbH.</td><td></td><td>light source</td></tr><tr><td>VisiView 2.1.4</td><td>Visitron Systems GmbH.</td><td></td><td>Image capturing software</td></tr><tr><td>Hard metal knife (tungsten carbide), profile D</td><td>Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KL 2500 LCD</td><td>Schott AG</td><td></td><td>light source</td></tr></tbody></table>

high-resolution episcopic microscopy (hrem) - simple and robust protocols for processing and visualizing organic materials

我々は、高分解能肛門鏡検査（HREM）法を用いてデジタルボリュームデータを生成するための簡単なプロトコルを提供する。 HREMは、1 x 1 x 1と5 x 5 x 5μm3の間の典型的な数値分解能で最大5 x 5 x 7 mm 3までの体積の有機材料を画像化することができます。標本はメタクリレート樹脂に包埋され、ミクロトーム上で切片化される。各セクションの後に、ブロック表面の画像が複合型顕微鏡ヘッドに接続された光電管上に置かれたデジタルビデオカメラで取り込まれる。光軸は、緑色蛍光タンパク質（GFP）フィルターキューブを通過し、各セクション後にボックホルダーアームが静止する位置に位置合わせされる。このようにして、後続のブロック表面を表示する一連の固有に整列されたデジタル画像が生成される。このような画像シリーズを3次元（3D）視覚化ソフトウェアにロードすることにより、デジタルボリュームデータへの即座の変換が容易になり、仮想データさまざまな直交平面および斜めの平面での動作、およびボリュームおよび表面レンダリングされたコンピュータモデルの作成。我々は、マウス、ニワトリ、ウズラ、カエルおよびゼブラフィッシュの胚、ヒト生検材料、コーティングされていない紙および皮膚代替材料を含む様々な有機体標本を処理するための3つの簡単で組織特異的なプロトコルを提示する。

HREMは、ヘマトキシリン/エオジン染色組織切片の画像と同様のコントラストを有する一連の本来的に整列したデジタル画像を生成する。 2D断面画像とは対照的に、HREM画像のスタックは、3Dにおける幅広い種類の有機材料の組織構造、形態およびトポロジーの可視化および分析を可能にする。高いコントラストは、表面レンダリングされたモデルの生成のために、体積レンダリングされたコンピュータモデルおよび半自動等高線所見の迅速かつ簡単な3D視覚化を容易にする。 HREMデータのサイズは、カメラターゲットのサイズ、画像キャプチャモード（8,12,16ビット、グレースケール、カラー）、およびシングルブロック顔画像の数によって異なります。 2,048ピクセル×2,048ピクセルの1,000個の8ビット.jpgグレースケール画像のより小さいデータセットは、約900 MBのサイズを有する。 4,096 pの3,000 8ビット.jpgグレースケール画像のより大きいデータセットixel x 4,096ピクセルの容量は約20 GBです。 提供されるプロトコルはシンプルで堅牢であり、過去10年間に多くの異なる標本のHREMデータを生成するために使用されました。プロトコールセクション1.1は、最大1cmの長さを有する生物医学モデル生物の全胚および5x5x5mm 3までの胚組織サンプルを処理するために最適化された。マウス（ Mus musculus） 、ニワトリ（ Gallus gallus ）、ゼブラフィッシュ（ Danio rerio ）、ウズラ（ Coturnix coturnix） 、アフリカツメガエル（ Xenopus laevis ）、ウマ（ Hepidae）の胚のHREMデータを作成するためにこの方法を使用した。 イクサツメガエル ）、ミルクウィードバグ（ Oncopeltus fasciatus ）、ワニ（ Crocodylia ）、タコ（ Octopus vulgaris ）すべての種のデータは優れた品質であった（ 図3 ） 3までの大きさの若年性および成人組織サンプルを処理するために最適化され、かつ、組織サンプルを視覚化するために使用された。 （ ホモ・サピエンス ）、マウス（ Mus musculus ）、ラット（ Rattus norvegicus ）、ブタ（ Sus scrofa domestica ）フェレット（ Mustela ）から採取した皮膚、肝臓、膵臓、腎臓、甲状腺、心臓、 （ Drosophila melanogaster ）、およびゼブラフィッシュ（ Danio rerio ）のような魚類が含まれる。結果はほとんどの標本（ 図4 アニメーション1など ）では優れていましたが、3 x 3 x 3 mm 3より大きい皮膚の中央部分（表皮付き）および脳標本は、エオシンの不十分な浸透のためにしばしば染色されずに残っていましたこれらの組織。 プロトコル1.3は、繊維状有機材料を処理するために最適化され、コート紙、コーティングされていない紙、天然の真皮代替材料および幹細胞播種された真皮代替材料の繊維構造を視覚化するために用いられた。これらのサンプルは簡単かつ迅速に処理できました。コーティングされていない紙およびほとんどの皮膚代替物のデータは良好な品質であった（ 図5 、 アニメーション2 ）。無機材料がエオシンの浸透を妨げると、コート紙の処理に問題が生じた。別の問題は、浸透溶液によって部分的に消化されたため、寒天を基礎にして皮膚を代用するときに発生しました。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig1.jpg" /> 図1：ワークフロー。赤いボックスに示されているステップは、サンプルの特性に応じて変更する必要があります。緑色のボックスの手順は、すべてのサンプルにおいて同様である。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/56071fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig2.jpg" /> 図2：カスタマイズされた金型。金型は、元の金型に穴を切って、パスツールピペットの球を挿入し、モデリング材料でそれを密封することによって適合させることができる。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/56071fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig3.jpg" /> 図3：例示的に視覚化された胚。 （A、B）胚の日に採取したマウス胚、E = 9.5。 HREM断面画像を（A）に、 </強い&gt;。表面を示す体積レンダリングされた3Dモデルが（B）に示されている。 （C） E15.5マウス胚の頸部のボリュームレンダリングモデルによる仮想矢状断面。 （D）発生Hamburger Hamilton（HH）段階でのニワトリ胚18.すべての胚組織のボリュームレンダリングと組み合わせた心血管コンポーネントの管腔の表面モデル。スケールバー=200μm。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/56071fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig4.jpg" /> 図4：典型的に視覚化された成人組織サンプル。 （A）人間の神経を通したHREM切片像の一部。インレイは、イメージのセクションをより詳細に示します。 （B）ブタ肝臓を通したHREM切片画像の一部。 nに注意してくださいuclei。 （C）ヒトリンパ組織のHREM切片画像の一部。 （D、E）人間の親指パッドの厚い肌。全体の生検のボリュームレンダリングされた3Dモデル。 （D） HREMデータ（E）による仮想切除の前の動脈、静脈、および神経の表面レンダリングされたモデル。 （F）成体マウス組織における実験的腫瘍。ボリュームレンダリングされた3Dモデルは、HREMデータを介して3つの仮想セクションの前にレンダリングされます。壊死部分（矢頭）に注意してください。スケールバー=200μm。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/56071fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig5.jpg" /> 図5：例示的に視覚化された繊維材料。 （A、B） HREMセクションのコートされていない、茶色の用紙の画像。 （B） </strong&gt;は（A）のセクションを示しています。繊維とその内腔に注意してください。 （C）コート紙のHREMセクション。繊維は染色されないままであることに留意されたい。 （D）天然の代用材料の体積表示モデル。ファイバーの異なる口径と形状に注意してください。スケールバー=100μm。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/56071fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="映画1" src="/files/ftp_upload/56071/56071mov1.jpg" /> アニメーション1：人間の親指パッドの太い皮のボリュームレンダリングモデル。組織ブロックのサイズは、約4.2×2.7×2.7mm 3である 。ボクセルのサイズは1.07×1.07×2μm3です。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/animation1.mp4" target="_blank">このビデオを見るにはここをクリックしてください。 （右クリックしてダウンロードしてください）</a> <pclass = &quot;jove_content&quot; fo：keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="映画2" src="/files/ftp_upload/56071/56071mov2.jpg" /> アニメーション2：ネイティブの皮膚代用物質のボリュームレンダリングモデル。サンプルのサイズは、約1.2×0.85×0.4mm 3である 。ボクセルサイズは0.54×0.54×2μm3です。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/animation2.mp4" target="_blank">このビデオを見るにはここをクリックしてください。 （右クリックしてダウンロードしてください）</a>

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High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

我々は、高解像度腺鏡検査法を用いたデジタルボリュームデータの生成を可能にするために、様々な種の生検材料、生物医学モデル生物の胚および他の有機組織の試料を処理するための簡単で堅牢なプロトコルを提供する。

高分解能断層顕微鏡（HREM） - 有機材料の処理および可視化のための簡単で堅牢なプロトコル

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

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Developmental Biology

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

10.1K ビュー.  Medical University of Vienna. 我々は、高解像度腺鏡検査法を用いたデジタルボリュームデータの生成を可能にするために、様々な種の生検材料、生物医学モデル生物の胚および他の有機組織の試料を処理するための簡単で堅牢なプロトコルを提供する。 

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High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

高分解能光ファイバMicroendoscopy用その場で細胞イメージング

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

生物工学

Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) morphometric data. Here, we describe the detailed protocol to image the entire mouse embryo. The protocol consists of four major sections: sample preparation, embedding, image acquisition and finally, 3D visualization. The technology requires specimens to be stained with a fluorescent dye, which can be problematic for large or dense specimens. To overcome this limitation, we have improved the existing protocol to enhance tissue penetration of the dye by pretreating the specimen with a solution containing urea and sodium dodecyl sulfate. The protocol uses only routine laboratory equipment and reagents for easy adaptation in standard laboratory settings. We show that the resulting high-resolution 3D images faithfully recapitulate the detailed morphologic features of the internal organs of mouse embryos, thereby permitting morphometric analyses. Together, we present a detailed and improved protocol using standard laboratory equipment to acquire high-resolution 3D images of small and large sized specimens.

We describe a detailed protocol using high-resolution episcopic microscopy to acquire three-dimensional (3D) images of mouse embryos. This improved protocol utilizes a modified tissue preparation method to enhance penetration of the fluorescent dye, thereby permitting morphometric analysis of both small and large-sized specimens.

高解像度落射顕微鏡を用いた3次元画像の迅速な取得

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) ...

発生生物学

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, methods involved in processing different biological samples involve unique practices. All conventional practices described in the literature for processing samples still find useful applications, but subtle changes in the sample preparation can alter image quality, as well as, introduce artifacts. Hence, using a unique sample preparation technique specific to the type of tissue analyzed is required to obtain a good quality image with ultrastructural resolution. The focus of this study is to provide the optimal sample preparation protocols for imaging embryos, rigid eggshells, and fungal cultures using SEM. The following optimizations were recommended to yield good results for the three different delicate biological samples studied. Use of milder fixatives like 4% paraformaldehyde or 3% glutaraldehyde followed by dehydration with ethanol series is mandatory. Fungal mycelium on agar blocks obtained by slide cultures yields a better ultrastructural integrity compared to cultures taken directly from agar plates. Chemical drying of embryos with HMDS provides drying without introducing surface tension artifacts compared to critical point drying. HMDS prevents cracking caused by shrinkage as samples are less brittle during drying. However, for fungal culture, critical point drying provides acceptable image quality compared to chemical drying. Eggshells can be imaged with no special preparation steps except for thorough washing and air drying prior to mounting. Preparation methodologies were standardized based on acceptable image quality obtained with each trial.&#160;

Here, we present detailed processing protocols for imaging delicate tissue samples using scanning electron microscopy (SEM). Three different processing methods, namely, hexamethyl disilazana (HMDS) chemical drying, simple air drying, and critical point drying are described for preparing rigid eggshells, embryos at early developmental stages, and fungal cultures respectively.

電子顕微鏡検査用胚、卵殻、真菌培養の処理

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

環境学

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a combination of light and electron microscopy. Samples embedded in resin are sectioned into arrays consisting of ribbons of hundreds of ultrathin sections and deposited on pieces of silicon wafer or conductively coated coverslips. Arrays are imaged at low resolution using a digital consumer like smartphone camera or light microscope (LM) for a rapid large area overview, or a wide field fluorescence microscope (fluorescence light microscopy (FLM)) after labeling with fluorophores. After post-staining with heavy metals, arrays are imaged in a scanning electron microscope (SEM). Selection of targets is possible from 3D reconstructions generated by FLM or from 3D reconstructions made from the SEM image stacks at intermediate resolution if no fluorescent markers are available. For ultrastructural analysis, selected targets are finally recorded in the SEM at high-resolution (a few nanometer image pixels). A ribbon-handling tool that can be retrofitted to any ultramicrotome is demonstrated. It helps with array production and substrate removal from the sectioning knife boat. A software platform that allows automated imaging of arrays in the SEM is discussed. Compared to other methods generating large volume EM data, such as serial block-face SEM (SBF-SEM) or focused ion beam SEM (FIB-SEM), this approach has two major advantages: (1) The resin-embedded sample is conserved, albeit in a sliced-up version. It can be stained in different ways and imaged with different resolutions. (2) As the sections can be post-stained, it is not necessary to use samples strongly block-stained with heavy metals to introduce contrast for SEM imaging or render the tissue blocks conductive. This makes the method applicable to a wide variety of materials and biological questions. Particularly prefixed materials e.g., from biopsy banks and pathology labs, can directly be embedded and reconstructed in 3D.

This protocol targets specific cells in tissue for imaging at nanoscale resolution using a scanning electron microscope (SEM). Large numbers of serial sections from resin-embedded biological material are first imaged in a light microscope to identify the target and then in a hierarchical manner in the SEM.

大ボリューム内の特定の細胞内標的を見つけるため連続切片的階層構造イメージング

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

高度な3D蛍光顕微鏡を用いたオートファジーの定量分析

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

生物学

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

培養細胞における小胞体サブドメインの可視化

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

<meta charset="utf8"></head><body>ボリューム電子顕微鏡による網膜シナプス構造の3D可視化

Preparation of Retinal Samples for Volume Electron Microscopy

Volume electron microscopy (Volume EM) has emerged as a powerful tool for visualizing the 3D structure of cells and tissues with nanometer-level precision. Within the retina, various types of neurons establish synaptic connections in the inner and outer plexiform layers. While conventional EM techniques have yielded valuable insights into retinal subcellular organelles, their limitation lies in providing 2D image data, which can hinder accurate measurements. For instance, quantifying the size of three distinct synaptic vesicle pools, crucial for synaptic transmission, is challenging in 2D. Volume EM offers a solution by providing large-scale, high-resolution 3D data. It is worth noting that sample preparation is a critical step in Volume EM, significantly impacting image clarity and contrast. In this context, we outline a sample preparation protocol for the 3D reconstruction of photoreceptor axon terminals in the retina. This protocol includes three key steps: retina dissection and fixation, sample embedding processes, and selection of the area of interest.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:ボリューム電子顕微鏡による網膜神経科学研究

This protocol describes the detailed steps for preparing retinal samples for volume electron microscopy, focusing on the structural features of retinal photoreceptor terminals.

体積電子顕微鏡法のための網膜サンプルの調製

Volume electron microscopy (Volume EM) has emerged as a powerful tool for visualizing the 3D structure of cells and tissues with nanometer-level ...

神経科学

<meta charset="utf8"></head><body>TEM用のレチナールオルガノイドサンプル調製のための最適化されたプロトコール

Preparing Retinal Organoid Samples for Transmission Electron Microscopy

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) under specific conditions. Synapse development and maturation in ROs have been studied immunocytochemically and functionally. However, the direct evidence of the synaptic contact ultrastructure is limited, containing both special ribbon synapses and conventional chemical synapses. Transmission electron microscopy (TEM) is characterized by high resolution and a respectable history elucidating retinal development and synapse maturation in humans and various species. It is a powerful tool to explore synaptic structure in ROs and is widely used in the research field of ROs. Therefore, to better explore the structure of RO synaptic contacts at the nanoscale and obtain high-quality microscopic evidence, we developed a simple and repeatable method of RO TEM sample preparation. This paper describes the protocol, reagents used, and detailed steps, including RO fixation preparation, post fixation, embedding, and visualization.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:TEMを使用した成熟Retinalオルガノイドのシナプス超微細構造の解析

This protocol provides an optimized and elaborate preparation procedure for retinal organoid samples for transmission electron microscopy. It is suitable for applications that involve the analysis of synapses in mature retinal organoids.

透過型電子顕微鏡法のためのレチナールオルガノイドサンプルの調製

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem ...

高分解能断層顕微鏡（HREM） - 有機材料の処理および可視化のための簡単で堅牢なプロトコル

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高分解能光ファイバMicroendoscopy用その場で細胞イメージング

高解像度落射顕微鏡を用いた3次元画像の迅速な取得

電子顕微鏡検査用胚、卵殻、真菌培養の処理

大ボリューム内の特定の細胞内標的を見つけるため連続切片的階層構造イメージング

高度な3D蛍光顕微鏡を用いたオートファジーの定量分析

培養細胞における小胞体サブドメインの可視化

体積電子顕微鏡法のための網膜サンプルの調製

体積電子顕微鏡法のための網膜サンプルの調製

体積電子顕微鏡法のための網膜サンプルの調製

透過型電子顕微鏡法のためのレチナールオルガノイドサンプルの調製