Name: high-resolution episcopic microscopy (hrem) - simple and robust protocols for processing and visualizing organic materials
Uploaded: 2017-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials at JoVE.com

المؤلفين أشكر تيم موهون لمساهماته إنفالوبال في تطوير هرم والبتراء هفيتر لتقديم العينات.

وقد أجريت جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية في جامعة فيينا الطبية. 1. إعداد العينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأجنة والأجنة الجنين (تصل إلى 5 × 5 × 5 مم 3 ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الأجنة أو أجزاء من الأجنة في 4٪ بفا / برنامج تلفزيوني أو تثبيتي بوين في 4 درجات مئوية لمدة 16-24 ساعة على الأقل تحت هزاز مستمر. ملاحظة: الأجنة من عدة أنواع ومراحل تنموية مختلفة يمكن استخدامها، مثل الزرد 48 ساعة، 19-h الفرخ والسمان، وكذلك الأجنة الماوس قبل الولادة، والتي استخدمت هنا (انظر ممثل النتائج ). تم حصاد العينات ونقلها إلى برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة للتدريج، قبل وضعها في تثبيتي. إذا لزم الأمر، وتقليم العينات مع مقص الصغيرة أو مشرط قبل التثبيت لتناسب قوالب التضمين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة تثبيتي وغسل الأنسجة الجنين في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية تحت روكين ثابتز لمدة 24 ساعة (2-3 تغييرات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفف العينات في 70٪، 80٪، 90٪، 96٪ من الإيثانول في 4 درجات مئوية لمدة 2 - 3 ساعات لكل منهما. وضع أنابيب تحتوي على عينات على المدورة. ملاحظة: بالنسبة للعينات الصغيرة (&lt;2 × 2 × 2 مم 3 )، يمكن تقليل الوقت الذي تقع فيه العينة في كل إيثانول إلى 60 دقيقة. للعينات الكبيرة (&gt; 5 × 5 × 5 مم 3 )، يمكن تمديده إلى 4 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ الخطوات التالية تسلل تحت غطاء الدخان ارتداء قفازات واقية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حل تسلل بإضافة 1.25 غرام البنزويل بيروكسيد (المحفز الملدن) و 0.4 غرام يوزين إلى 100 مل من الحل A (لمزيد من التفاصيل، انظر جدول المواد ). تحريك هذا في كوب على لوحة التحريك المغناطيسي في 4 درجات مئوية حتى يوزين ومحفز يذوب تماما (2 - 3 ح). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العينات لمدة 12-24 ساعة في حل تسلل. يبقيه في 4 درجات مئوية تحت الهزاز المستمر أو التناوب. استبدال محلول تسلل مع حل جديد بعد 3 و 12ح. ملاحظة: تمديد وقت تسلل إلى 48 ساعة للأجنة الكبيرة (&gt; 1 سم تاج / طول رمي). </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد عينات الأنسجة الكبار (تصل إلى 5 × 5 × 7 مم 3 ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الأنسجة في 2٪ بفا / برنامج تلفزيوني يحتوي على 4٪ حمض الكربوليك في 4 درجات مئوية لمدة 3 أيام على الأقل. ملاحظة: عينة الأنسجة الناجمة عن الجلد والكبد والبنكرياس والكلى والغدة الدرقية والقلب والعضلات المخططة والدماغ والأعصاب ونماذج الورم من العديد من حديثي الولادة والبالغين البشر والقوارض والخنازير والذباب الفاكهة، وأسماك حمار وحشي يمكن أن تكون ثابتة في هذا الحل ومن ثم معالجتها للتصوير هرم (نحن إثبات تثبيت العينات؛ انظر ممثل النتائج ). استئصال عينات الأنسجة مع المباضع، مقص أو اللكمات الخزعة ونقلها مباشرة إلى تثبيتي. لتثبيت استخدام الأنسجة العصبية 4٪ بفا / برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة تثبيتي وغسل الأنسجة تحت تشغيل مياه الصنبور لمدة 3-6 ح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى العينات من قبل مكان لاحقفي 70٪، 80٪، 90٪، 96٪ من الإيثانول، مختلطة مع 0.4 غرام يوزين لكل 100 مل (2 - 3 ساعات لكل منهما). الحفاظ على الحلول مع العينات في 4 درجات مئوية تحت هزاز مستمر أو على المدورة. ملاحظة: بالنسبة للعينات الصغيرة (&lt;2 × 2 × 2 مم 3 )، يمكن تقليل الوقت الذي تقع فيه العينة في كل إيثانول إلى 60 دقيقة. لعينات كبيرة (&gt; 5 × 5 × 5 مم 3 )، ويمكن تمديدها إلى 4-8 ح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ جميع الخطوات التالية تسلل تحت غطاء الدخان ارتداء قفازات واقية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حل تسلل بإضافة 1.25 غرام البنزويل بيروكسيد (المحفز الملدن) و 0.4 غرام يوزين إلى 100 مل من الحل A (لمزيد من التفاصيل، انظر جدول المواد ). تحريك في كوب على لوحة التحريك المغناطيسي في 4 درجات مئوية حتى يوزين ومحفز يذوب تماما (2 - 3 ح). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع عينات في محلول تسلل لمدة 24 - 36 ساعة. يبقيه في 4 درجات مئوية تحت الهزاز المستمر أو التناوب. استبدال محلول تسلل مع حل جديد بعد 3 و12 ح. ملاحظة: للحصول على عينات كبيرة (&gt; 5 × 5 × 5 مم 3 ) تمديد وقت تسلل إلى 48 ساعة. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المواد العضوية الأخرى ملاحظة: تقليم بدائل الجلد والورق إلى الحجم المطلوب مع مقص العادية. لا حاجة إلى تثبيت. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخطي خطوات التثبيت والغسيل والجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ جميع الخطوات التالية تسلل تحت غطاء الدخان ارتداء قفازات واقية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حل تسلل بإضافة 1.25 غرام البنزويل بيروكسيد (المحفز الملدن) و 0.4 غرام يوزين إلى 100 مل من الحل A (لمزيد من التفاصيل، انظر جدول المواد ). تحريك في كوب في 4 درجات مئوية على لوحة التحريك المغناطيسي حتى يوزين ومحفز يتم حلها تماما (2 - 3 ح). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات مكان في حل تسلل لمدة 3-12 ساعة. يبقيه في 4 درجات مئوية تحت الهزاز المستمر أو التناوب. استبدال محلول تسلل مع حل جديد بعد 1 و 2 - 4 ح. </li></ol> &lt;/ لى&gt; </ol></li></ol> 2. التضمين ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات تحت غطاء الدخان ارتداء قفازات واقية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حل تسلل جديدة كما هو موضح أعلاه (الخطوة 1.1.4.1). إضافة 4 مل سولوتيون B (لمزيد من التفاصيل، انظر جدول المواد ) إلى 100 مل حل تسلل لإعداد الحل التضمين. ملاحظة: إذا كان التوجه الدقيق للعينة في قوالب التضمين مطلوب والسماح لتضمين عدة عينات في موازاة ذلك، وإبطاء البلمرة من الحل الأسهم عن طريق وضع الكأس في حمام الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام صواني كوب صب (لمزيد من التفاصيل، انظر جدول المواد ) مع قوالب وجود حجم روتيني من 6 × 8 × 5 مم 3 أو 13 × 19 × 5 مم 3 ، أو قوالب مخصصة مع وحدات تخزين تصل إلى 8 × 10 × 15 ملم 3 ( الشكل 2 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء قوالب مع حل التضمين ونقل العينة في القالب باستخدامملعقة. أثناء النقل ضمان أن العينة مغطاة بالكامل مع تضمين الحل لتجنب محاصرة الهواء. ملاحظة: يمكن القيام بذلك في درجة حرارة الغرفة، إذا بدأت مباشرة بعد جمع العينات وحل التضمين من الثلاجة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توجيه العينة داخل القالب باستخدام الإبر أو ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حالما يبدأ الحل التضمين يصبح لزج، وضع حامل كتلة (انظر جدول المواد ) على رأس القالب وإضافة حل التضمين من خلال الثقب المركزي لحامل كتلة حتى يتم تغطية قاعدة حامل كتلة مع 1 - 2 مم من حل التضمين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم علبة صب صب من خلال تغطيتها مع السائل البارافين الشمع وانتظر حتى تصلب. بدلا من ذلك وضع علبة كوب صب الثانية رأسا على عقب على علبة كوب صب مع عينات وختم عليه مع شريط لاصق للهواء واقية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح كتل لإنهاء البلمرة عن طريق تخزين صواني كأس صب مختومة ل 1 -2 أيام في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالنسبة إلى معالجة ما بعد البلمرة، ضع صواني الكوب الصب مع الكتل المبلمرة في فرن مختبر معياري وقم بخبزها عند 70 - 80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن يوم واحد إلى يومين حتى تصبح حمراء داكنة. جمع الصواني من الفرن وإزالة الكتل من القالب. ملاحظة: يمكن أن يتم الخبز في ظل الظروف البيئية العادية. علبة كؤوس صب الصب، التي تضمن ختم الهواء في المرحلة الأولى بعد التضمين، يمكن إزالتها للسماح لفحص لون الراتنج بعد 10 ساعة. مباشرة بعد الخبز، الراتنج لينة والكتل يمكن إزالتها بسهولة من علبة صب صب. في غضون 2 - 3 ساعات هم من الصعب ويمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر. </li></ol> 3. توليد البيانات ملاحظة: يتضمن النموذج هرم 18 ، 25 المستخدمة هنا العناصر التالية: (1) مشراح دوار مع حامل كتلةالذي يتوقف بعد كل قطع في نقطة تحول العليا. (2) القياسية، غير القابل للتصرف مشراح سكين، المعادن الصلبة، الشخصية D (لمزيد من التفاصيل، انظر جدول المواد ). (إي) رئيس المجهر مضان مجمع مع مسدس موضوعي و غفب مرشح مكعب (الإثارة 470/40، فلتر الانبعاثات 525/50) في محورها البصري. يتم ترتيب المحور البصري عمودي على سطح قطع حديثا من كتلة شنت على مشراح ويقف من قبل الجهاز الذي يسمح الحركة صعودا وهبوطا. (4) الجدول عبر الآلية بمحرك مشراح. يمكن تحويل الجدول في اتجاه المحور البصري وأفقيا. (v) كاميرا فيديو رقمية تعلق على المجهر المركب الفلورسنت. (6) مصدر الضوء أحادي اللون (470 نانومتر). &#39;7&#39; الحاسوب المتصل بالكاميرا، مع برمجيات لتوليد البيانات (للاطلاع على التفاصيل، انظر جدول المواد ). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد المنطقة التي تهمك. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مختبر القياسية لي(انظر جدول المواد ) لتوجيه الضوء الأبيض بشكل غير مباشر إلى سطح الكتلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الخطوط العريضة للمادة المضمنة كما أنها مشاريع لسطح الكتلة. تشير إلى المنطقة ذات الاهتمام ومجال الرؤية في وقت لاحق على سطح كتلة باستخدام القلم أو شفرة حلاقة. ملاحظة: هذه الخطوة إلزامية لتحديد مدى مجال الرؤية قبل التقسيم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد مجال الرؤية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل كتلة الراتنج مع عينة على مشراح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل حامل كتلة إلى موقف وقفها (نقطة تحول العليا من رحلة حامل كتلة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تشغيل الكاميرا الرقمية وبرامج توليد البيانات، والحصول على صورة حية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار عدسة موضوعية، مع التكبير المناسب لتغطية منطقة الاهتمام المشار إليها على سطح الكتلة. ملاحظة: الأهداف مع التكبير 2.5X، 5X، 10X، 20X والفتحات الرقمية بين 0.07 و 0.40 تستخدم عادة. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البصرية صعودا وهبوطا ومشراح أفقيا باستخدام الجدول الصليب الآلية حتى تتطابق المنطقة ذات الاهتمام مع مجال الرؤية المعروضة على شاشة الكمبيوتر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التركيز. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء خطوة بخطوة دليل سيكتيونينغ حتى الهياكل الأولى من العينة تصبح مرئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترتيب سطح كتلة في مستوى التركيز من البصرية، عن طريق تحريك مشراح في اتجاه المحور البصري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار سمك القسم. ويوصى سمك القسم من 0.5 إلى 5 ميكرون. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد البيانات ومعالجتها <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء البرنامج الروتيني الذي ينظم التقسيم والتقاط الصور. اتبع التعليمات الموثقة من برامج التقاط التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف البرامج الروتينية ووضع شريحة التحجيم أمام سطح كتلة بمجرد أن مقطوع تماما العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صورة تفاعلية للحصول على معايرة في وقت لاحقنشوئها. ملاحظة: يجب أن يتم ذلك في كل مرة يتم استخدام الهدف في ترتيب رتبت حديثا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل سلسلة الصورة إلى 8 بت الصور الرمادي مقياس in.jpg. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل سلسلة صورة في برنامج التصور 3D وضبط التناقضات. ملاحظة: يمكن أن يتم تحويل الصورة والتصور 3D مع مختلف البرامج التجارية أو المتاحة بحرية حزم البرمجيات القياسية، وفقا للتعليمات من البرنامج المعني. </li></ol></li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

هريم هو طريقة مجهرية قوية للغاية التي هي مثالية لتصور مجموعة واسعة من المواد العضوية المستخدمة في الطب الحيوي والصناعة 18 و 21 و 26 و 27 و 28 و 29 و 30 و 31 و 32 و 33 و 34 و 35 و 36 و 37 ، 38 ، 39 ، 40 . ويمكن استخدامه كطريقة تصوير حصرية، كما تستخدم حاليا من قبل آليات اضطرابات النمو (دمد) برنامج 41 ، 42 <sup&gt;، 43 ، 44 ، أو كجزء تكاملي من خطوط الأنابيب التصوير المتعدد الوسائط 45 . ويمكن تجميع جهاز توليد البيانات هرم يعمل بشكل كامل من مكونات المختبر التقليدية ويضم مشراح الآلية، المجهر، طاولة الصليب الآلية، وجهاز كمبيوتر مع البرامج المناسبة 25 . فمن الأهمية بمكان لاستخدام مشراح مجهزة حامل كتلة التي تتكاثر بشكل متكرر بعد كل قسم في موقف محدد ومكعبات مرشح غفب داخل المسار البصري. ومع ذلك، يمكن شراء حلول شاملة تماما من شركات مثل إنديجو سسينتيفيك. يواجه هرم نفس القيود مثل جميع التقنيات النسيجية، إلا أنه لا يتم إدخال أي القطع الأثرية أثناء التقسيم أو قسم التركيب. ومع ذلك، هناك قيود، والتي تنتج عن ضرورة وصمة عار العينات قبل التقسيم ومن خصائص مادة التضمين. مطلوب اختراق يوزين من خلال العينة بأكملها للحصول على تناقضات الأنسجة كافية. مواد كثيفة جدا، والأنسجة الدهنية والمواد غير العضوية تعيق بشكل فعال يوزين الاختراق وهذا يؤدي إلى الأنسجة غير ملوثين في وسط الكائنات. باستخدام مثبتات خاصة يساعد على وصمة عار عينات الجلد، ولكن لا يزال هناك أي طريقة مناسبة للتغلب على المشكلة تماما. هناك قيود أخرى هي أن الراتنجات التي تمنع أعلى من 2 سم تميل إلى كسر أثناء التقسيم. ويمكن تجنب ذلك جزئيا عن طريق قطع العينات وأجزاء المعالجة بشكل منفصل. تحديد المواقع الصحيحة من العينات الصغيرة أو العينات مع الأسطح غير النظامية في القوالب أثناء التضمين غالبا ما يكون إشكالية. تغطي العينات مع الاغاروز وتجهيز كتل الاغاروز كما هو موضح في البروتوكول عادة ما يحل هذه المسألة 19 . نهج بديل، الذي يساعد أيضا إذا كتل كسر خلال سكتيعلى إزالة كتلة صلبة بالفعل من حاملها وتضمينها من جديد، بعد إجراء التضمين وصفها. وتتألف مجموعة بيانات نموذجية هرم من 500 إلى 3000 صورة مفردة. يتم تحديد قرارها العددي عن طريق المسافة بين الصور المتعاقبة ( أي ، من خلال سمك القسم)، وخاصية الهدف الكاميرا، وخصائص البصريات المستخدمة. استخدمنا سمك القسم بين 1 ميكرون و 5 ميكرون وحققت نتائج جيدة، على الرغم من أن البروتوكولات المقدمة لا القضاء تماما مشرقة من التحف 20 ، 46 . وتنتج هذه التحف عن طريق الأنسجة الملطخة بشكل مكثف تقع في عمق كتلة، مما أدى إلى طمس معلومات الأنسجة على أسطح كتلة من قبل. كانت الكاميرات تستهدف أبعاد 2،560 × 1،920 بكسل 2 ، 2،048 × 2،048 بكسل 2 ، و 4،096 × 4،096 بكسل 2 وكانت كومبينيد مع 1.25X، 2.5X، 5X، 10X، و 20X العدسات الموضوعية. وأدى هذا إلى أحجام بكسل رقمية بين 0.18 × 0.18 ميكرون 2 و 5.92 × 5.92 ميكرون 2 ، والتي أثبتت أنها كافية لتحليل 3D من بنية الأنسجة والأشكال الخلية، وحتى لتصور نوى. ونظرا لارتفاع القرار الرقمي، يجب أن تكون عضيات الخلايا الأخرى مرئية كذلك. تناقضات غير كافية بسبب تلطيخ يوسين بسيطة، والخصائص البصرية للأهداف يقلل بشكل كبير من إمكانية التمييز الهياكل. القرار المكاني الحقيقي الأقصى للبيانات هرم، الذي يأخذ في الاعتبار الفتحة الرقمية، هو تقريبا 1 × 1 × 1 ميكرون 3 ، وبالتالي يسمح فقط التمييز الفعال للهياكل أكبر من حوالي 3 × 3 × 3 ميكرون 3 . وهناك مشكلة مشتركة لجميع تقنيات التصوير الرقمي هو التبادل بين حجم مجال الرؤية، والذي يحدد جزء من العينة التي يمكن عرضهاd على هدف الكاميرا، والقرار الرقمي للصورة. وكلما كان مجال الرؤية أكبر، كلما انخفض القرار الرقمي الأقصى 46 . يسمح الإعداد هرم المستخدمة هنا توليد بيانات هرم مع مجال الرؤية بين 0.74 × 0.74 مم 2 (20X الهدف) عرضها في قرار رقمي 0.18 × 0.18 ميكرون 2 و 12.12 × 12.12 مم 2 (1.25X الهدف) المعروضة في وهو قرار رقمي 2.96 × 2.96 ميكرون 2 . يمكن للمجموعات البديلة والمتجانسة أن توفر مجالات أوسع من وجهات النظر، ولكن على حساب الحل الحقيقي. ومع ذلك، فإنها توفر نتائج ممتازة، كما يتضح من البيانات المعروضة على الصفحة الرئيسية لبرنامج دمد 47 .

التحليل الهيكلي للمواد العضوية وغير العضوية هو الخطوة الأولى في فهم الخواص الفيزيائية والوظيفة. أساس هذا التحليل في كثير من الأحيان هو ثنائي الأبعاد المعلومات (2D) المكتسبة من قبل مراقبة دقيقة من الأقسام النسيجية، مع مجموعة متنوعة من أساليب التصوير بسيطة ومتطورة التي تستخرج تفاصيل بنية الأنسجة، مورفولوجيا الخلية والطوبولوجيا والتكوين الجزيئي والخصائص الميكانيكية الحيوية 1 ، 2 ، 3 . ومع ذلك، فإن المعلومات 2D غير مناسبة للبحث الترتيبات المعقدة مكانيا. وبالتالي فإن عددا متزايدا من في الجسم الحي والطرق خارج الجسم الحي التي تسمح بإنشاء بيانات حجم الرقمية في العقود الأخيرة 4 وغيرها الكثير قيد التطوير. المبدأ المنهجي لمعظم أساليب توليد البيانات حجم هو توليد مداخن الظاهريمن الصور الرقمية التي تعرض المقاطع المكتسبة عن طريق التقسيم الظاهري أو المادي للكائن. إذا تم محاذاة الصور القسم بشكل صحيح، وهذا يخلق وحدة تخزين، والتي يمكن إعادة المقطع في طائرات القسم الظاهري، أو استخدامها لخلق 3D سطح وحجم النماذج المقدمة. التقنيات الشائعة لتصور البشر وعينات بيولوجية أكبر هي التصوير المقطعي بالرنين المغناطيسي والتصوير المقطعي المحوسب والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (بيت) والتصوير المقطعي بالانبعاث أحادي الفوتون (سبيكت). وعادة ما تصور العينات الصغيرة باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي المغنطيسي (التصوير المقطعي بالرنين المغناطيسي) والتصوير المقطعي الضوئي البصري (أوبت) والتصوير المقطعي البصري التماسك (أوكت) والتصوير المقطعي الضوئي (بات) والطرق القائمة على التقطيع النسيجي والمجهر البؤري والتصوير المقطعي بالإلكترون 5 و 6 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 <sأوب&gt;، 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، 17 . وهناك طريقة جديدة نسبيا لتوليد البيانات الحجمية، والتي تنتج بيانات رقمية من العينات الصغيرة وعينات الأنسجة النسيجية هي طريقة هريم، الذي تم تطويره بالتعاون الوثيق مع تيم موهون 18 ، 19 . بل هو تقنية المجهر بسيطة تستند، الذي يولد البيانات حجم الرقمية من الراتنج جزءا لا يتجزأ من المواد التي مقطوع على مشراح. البيانات تسهيل تحليل مفصل لهندسة الأنسجة والتوزيعات الخلية وكذلك تحليل متري من الميزات الصغيرة على المستوى المجهري ضوء المتوسطة. تنتج هريم مجموعات من الصور الرقمية المحاذاة بطبيعتها والتي تظهر كما لو تم التقاطها من eأوسين أقسام نسيجية ملطخة. تباين الأنسجة ودقة البيانات فيما يتعلق مجال الرؤية تتجاوز تلك التي تنتجها مع μCT، μMRI، والأراضي الفلسطينية المحتلة، ولكن أقل من ذلك يمكن تحقيقه مع متحد البؤر، ورقة ضوء والمجهر الإلكتروني 20 . ومع ذلك، وعلى النقيض من هذا الأخير، هرم قادر على تصور العينات مع كميات كبيرة نسبيا تصل إلى 5 × 5 × 7 مم 3 في الجودة النسيجية. وهناك عدد من الدراسات الحديثة توفر خصائص مفصلة ومقارنات من مزايا وعيوب تقنيات التصوير واحد و، من أجل الموضوعية، نشير إلى تلك لمزيد من المعلومات بشأن القيود والمجالات المحتملة من التطبيقات 4 ، 21 ، 22 ، 23 ، 24 . وتركز هذه الدراسة على طريقة التصوير هرم ويهدف إلى توفيروبروتوكولات بسيطة جدا لتوليد البيانات هرم من مجموعة واسعة من المواد العضوية، فضلا عن أمثلة لتطبيقها. سير العمل لإنشاء بيانات هرم بسيطة ويسري على جميع المواد التي يمكن تضمينها في راتنج ميثاكريلات ( الشكل 1 ). ومع ذلك هناك اختلافات محددة الأنسجة في إعداد العينة، التي تحتاج إلى النظر فيها. ولذلك فإننا نقدم ثلاثة بروتوكولات القياسية لإعداد عينات مختلفة. التضمين وخطوات بروتوكول توليد البيانات متطابقة لكل منهم.

<table><tbody><tr><td>JB-4 Plus Embedding Kit</td><td>Polysciences Europe GmbH</td><td>18570-1</td><td>includes Benzoyl Peroxide, Plasticized (Catalyst) and Solution A+B</td></tr><tr><td>Polyethylene Molding Cup Trays, 6 x 8 x 5 mm hexagon (9 cavities)</td><td>Polysciences Europe GmbH</td><td>17177A-3</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Molding Cup Trays, 13 x 19 x 5 mm (9 cavities)</td><td>Polysciences Europe GmbH</td><td>17177C-3</td><td></td></tr><tr><td>JB-4 Plastic Block Holders</td><td>Polysciences Europe GmbH</td><td>15899-50</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Waldeck GmbH &amp;amp; Co. KG, Division Chroma</td><td>1A-196</td><td></td></tr><tr><td>Microtec CUT 4060E</td><td></td><td></td><td>rotary microtome</td></tr><tr><td>Leica DM LM, fluorescence compound microscope</td><td>Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP filter set</td><td>Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td><td>11090937180000</td><td></td></tr><tr><td>Motorised cross table</td><td>Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH &amp;amp; CO. KG</td><td>KT5-LSMA</td><td></td></tr><tr><td>Digital video camera SPOT-FLEX</td><td>Visitron Systems GmbH.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>precisExcite High-Power LED</td><td>Visitron Systems GmbH.</td><td></td><td>light source</td></tr><tr><td>VisiView 2.1.4</td><td>Visitron Systems GmbH.</td><td></td><td>Image capturing software</td></tr><tr><td>Hard metal knife (tungsten carbide), profile D</td><td>Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KL 2500 LCD</td><td>Schott AG</td><td></td><td>light source</td></tr></tbody></table>

high-resolution episcopic microscopy (hrem) - simple and robust protocols for processing and visualizing organic materials

نحن نقدم بروتوكولات بسيطة لتوليد البيانات حجم الرقمية مع عالية الدقة ابيسكوبي المجهري (هريم) الأسلوب. هريم قادر على تصوير المواد العضوية مع وحدات التخزين تصل إلى 5 × 5 × 7 مم 3 في قرارات رقمية نموذجية بين 1 × 1 × 1 و 5 × 5 × 5 ميكرون 3 . يتم تضمين العينات في راتنج ميثاكريلات ومقسم على مشراح. بعد كل قسم يتم التقاط صورة من سطح كتلة مع كاميرا الفيديو الرقمية التي يجلس على فوتوتوب متصلا رئيس المجهر المركب. المحور البصري يمر عبر بروتين الفلورسنت الأخضر (غفب) مرشح مكعب ويتماشى مع الموقف، الذي الذراع بوك حامل يأتي للراحة بعد كل قسم. وبهذه الطريقة، يتم إنتاج سلسلة من الصور الرقمية الانحياز بطبيعتها، وعرض الأسطح كتلة لاحقة. تحميل مثل هذه السلسلة صورة في ثلاثي الأبعاد (3D) برنامج التصور يسهل التحويل الفوري إلى البيانات حجم الرقمية، والتي تسمح الظاهرية قإكتينغ في مختلف الطائرات المتعامدة والمائلة وإنشاء حجم والسطحية نماذج الكمبيوتر المقدمة. نقدم ثلاثة بروتوكولات محددة، الأنسجة محددة لمعالجة مجموعات مختلفة من العينات العضوية، بما في ذلك الماوس والفرخ والسمان والضفدع والأجنة زيبرا الأسماك، والمواد خزعة الإنسان، ورقة غير مصقول ومواد استبدال الجلد.

هريم يولد سلسلة من الصور الرقمية الانحياز بطبيعتها مع تناقضات مماثلة لصور الهيماتوكسيلين / يوسين أقسام النسيجية الملون. على عكس الصور القسم 2D، مداخن من الصور هريم تسمح لتصور وتحليل بنية الأنسجة، التشكل، وطوبولوجيا مجموعة واسعة من المواد العضوية في 3D. التباين العالي في كثير من الأحيان يسهل التصور 3D سريعة وبسيطة من نماذج الكمبيوتر التي تم تقديمها حجم ونتائج كفاف شبه التلقائي لتوليد نماذج سطح المقدمة. يختلف حجم البيانات هرم وفقا لحجم الهدف الكاميرا، ووضع التقاط الصور (8، 12، 16 بت، مقياس الرمادية واللون) وعدد من الصور كتلة واحدة الوجه. مجموعات بيانات أصغر من 1000 8-bit.jpg صور مقياس رمادي من 2،048 بكسل × 2،048 بكسل حجمها حوالي 900 مب. مجموعات بيانات أكبر من 3000 8-bit.jpg الصور مقياس رمادي من 4،096 ص<html> بكسل × 4،096 بكسل لديها حجم ما يقرب من 20 غيغابايت. البروتوكولات المقدمة هي بسيطة وقوية، وخلال العقد الماضي، كانوا يعملون لتوليد بيانات هرم للعديد من العينات المختلفة. تم تحسين القسم بروتوكول 1.1 لمعالجة الأجنة كاملة من الكائنات الحية النموذجية الطبية مع طول يصل إلى 1 سم وعينات الأنسجة الجنين مع بعد تصل إلى 5 × 5 × 5 مم 3 ؛ استخدمنا هذه الطريقة لإنتاج بيانات هرم من الأجنة من الأنواع التالية: الفأر ( موس موسولوس) ، فرخ ( غالوس غالوس )، زيبرا فيش ( دانيو ريريو )، السمان ( كوترنيكس كوترنيكس) ، الضفدع الأفريقي المخلب ( زينوبوس ليفيس ) إكوس فيروس كابالوس )، علة اللبن ( أونكوبيلتوس فاسياتوس )، التمساح ( كروكوديليا )، والأخطبوط ( الأخطبوط فولغاريس ). وكانت بيانات جميع الأنواع ذات نوعية ممتازة (على سبيل المثال ، الشكل 3 ) أس = &quot;jove_content&quot; فو: كيب-together.within-بادج = &quot;1&quot;&gt; تم تحسين القسم بروتوكول 1.2 لمعالجة عينات الأنسجة والأنسجة البالغة بأبعاد تصل إلى 5 × 5 × 7 مم 3 ، وتستخدم لتصوير عينات الأنسجة من والجلد والكبد والبنكرياس والكلى والغدة الدرقية والقلب والعضلات المخططة والدماغ والأعصاب ونماذج الورم التي تحصد من البشر ( هومو سابينز ) والفئران ( موس موسولوس ) والجرذان ( راتوس نورفيجيكوس ) والخنازير ( سوس سكروفا دوميستيكا ) فيريت ( مستيلا فورو )، ذبابة الفاكهة ( ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر )، والأسماك زيبرا ( دانيو ريريو ). في حين كانت النتائج ممتازة مع معظم العينات (على سبيل المثال ، الشكل 4 ، الرسوم المتحركة 1 )، الأجزاء المركزية جدا من الجلد (مع البشرة) وعينات الدماغ أكبر من 3 × 3 × 3 مم 3 في كثير من الأحيان بقيت غير ملوثين بسبب عدم كفاية اختراق يوسين من خلال هذه الأنسجة. البروتوكول sوكان الأمثل 1.3 إكتيون لمعالجة المواد العضوية الليفية وتستخدم لتصور بنية الألياف من الورق المطلي، ورقة غير مصقول، المواد بديلا الجلد الأصلي والخلايا الجذعية المصنفة الجلد المواد بديلا. وكانت هذه العينات سهلة وسريعة لمعالجة. كانت البيانات من الورق غير المصقول ومعظم بدائل الجلد ذات نوعية جيدة ( الشكل 5 ، الرسوم المتحركة 2 ). حدثت مشاكل في معالجة الورق المطلي، عندما أعاقت المواد غير العضوية اختراق يوزين. حدثت مشكلة أخرى عند معالجة بدائل الجلد على أساس أجار لأنها هضمت جزئيا من قبل حل تسلل. <img alt="شكل 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig1.jpg" /> الشكل 1: سير العمل. الخطوات المعروضة في الصناديق الحمراء تتطلب تعديلات وفقا لخصائص العينة. الخطوات في الصناديق الخضراء هي تلك التيهي مماثلة في جميع العينات. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/56071fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig2.jpg" /> الشكل 2: قوالب مخصصة. قوالب يمكن تكييفها عن طريق قطع حفرة في القالب الأصلي، وإدراج لمبة من ماصة باستور وختم ذلك مع المواد النمذجة. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/56071fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig3.jpg" /> الشكل 3: الأجنة تصور بشكل غير عادي. (A، B) الجنين الماوس تحصد في يوم الجنينية، E = 9.5. تظهر صورة قسم هريم في (A) </قوية&gt;. يظهر حجم عرض نموذج 3D يظهر السطح في (B) . (C) قسم سهمي الظاهري من خلال حجم نموذج المقدمة من الرقبة من جنين الماوس E15.5. (D) الجنين الفرخ في هامبورجر التنموية هاميلتون (ه) المرحلة 18. نموذج السطح من لومينا من مكونات القلب والأوعية الدموية جنبا إلى جنب مع حجم تقديم جميع أنسجة الجنين. مقياس الحانات = 200 ميكرون. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/56071fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig4.jpg" /> الشكل 4: عينات الأنسجة الكبار تصور بشكل غير عادي. (A) جزء من صورة قسم هرم من خلال العصب البشري. ترصيع يظهر مقطع من الصورة بمزيد من التفصيل. (B) جزء من صورة قسم هرم من خلال الكبد الخنازير. لاحظ nuclei. (C) جزء من صورة قسم هرم من الأنسجة اللمفاوية البشرية. (D، E) جلد سميك من لوحة الإبهام الإنسان. حجم المقدمة نموذج 3D من الخزعة بأكملها. (D) نماذج سطح المقدمة من الشرايين والأوردة والأعصاب أمام استئصال الظاهري من خلال بيانات هرم (E) . (F) الورم التجريبي في الأنسجة الماوس الكبار. حجم تقديم نموذج 3D أمام ثلاثة أقسام افتراضية من خلال بيانات هريم. لاحظ أجزاء نخرية (السهام). مقياس الحانات = 200 ميكرون. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/56071fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig5.jpg" /> الشكل 5: المواد الليفية المرئية بشكل غير عادي. (A، B) هريم صورة القسم من غير مصقول، ورقة البني. (ب) </s<html> ترونغ&gt; يظهر قسم من (A) . لاحظ الألياف وتجويفها. (C) قسم هريم من الورق المطلي. لاحظ أن الألياف لا تزال غير ملوثين. (D) حجم تقديم نموذج من المواد البدلة الجلد الأصلي. لاحظ عيار مختلف وشكل من الألياف. الحانات مقياس = 100 ميكرون. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/56071fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="فيلم 1" src="/files/ftp_upload/56071/56071mov1.jpg" /> الرسوم المتحركة 1: حجم المقدمة نموذج من الجلد السميك من وسادة الإبهام الإنسان. حجم كتلة الأنسجة حوالي 4.2 × 2.7 × 2.7 مم 3 . حجم فوكسل هو 1.07 × 1.07 × 2 ميكرون 3 . <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/animation1.mp4" target="_blank">الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)</a> كلاس = &quot;jove_content&quot; فو: كيب-together.within-بادج = &quot;1&quot;&gt; <img alt="فيلم 2" src="/files/ftp_upload/56071/56071mov2.jpg" /> الرسوم المتحركة 2: حجم تقديم نموذج من المواد الأصلية الجلد البديل. حجم العينة حوالي 1.2 × 0.85 × 0.4 مم 3 . حجم فوكسل هو 0.54 × 0.54 × 2 ميكرون 3 . <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/animation2.mp4" target="_blank">الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials at JoVE.com

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

نحن نقدم بروتوكولات بسيطة وقوية لمعالجة المواد خزعة من مختلف الأنواع والأجنة من الكائنات الحية الحيوية نموذج والعينات من الأنسجة العضوية الأخرى من أجل السماح الرقمية توليد البيانات حجم مع عالية الدقة المنهج المجهري إبيسكوبيك.

عالية الدقة مجهر ابيسكوبي (هريم) - بروتوكولات بسيطة وقوية لمعالجة وتصور المواد العضوية

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

high-resolution-episcopic-microscopy-hrem-simple-robust-protocols-for

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

10.1K Views.  Medical University of Vienna.  نحن نقدم بروتوكولات بسيطة وقوية لمعالجة المواد خزعة من مختلف الأنواع والأجنة من الكائنات الحية الحيوية نموذج والعينات من الأنسجة العضوية الأخرى من أجل السماح الرقمية توليد البيانات حجم مع عالية الدقة المنهج المجهري إبيسكوبيك. 

Video: High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

ذات دقة عالية الألياف الضوئية للMicroendoscopy في الموقع الخلوية التصوير

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Bioengineering

Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) morphometric data. Here, we describe the detailed protocol to image the entire mouse embryo. The protocol consists of four major sections: sample preparation, embedding, image acquisition and finally, 3D visualization. The technology requires specimens to be stained with a fluorescent dye, which can be problematic for large or dense specimens. To overcome this limitation, we have improved the existing protocol to enhance tissue penetration of the dye by pretreating the specimen with a solution containing urea and sodium dodecyl sulfate. The protocol uses only routine laboratory equipment and reagents for easy adaptation in standard laboratory settings. We show that the resulting high-resolution 3D images faithfully recapitulate the detailed morphologic features of the internal organs of mouse embryos, thereby permitting morphometric analyses. Together, we present a detailed and improved protocol using standard laboratory equipment to acquire high-resolution 3D images of small and large sized specimens.

We describe a detailed protocol using high-resolution episcopic microscopy to acquire three-dimensional (3D) images of mouse embryos. This improved protocol utilizes a modified tissue preparation method to enhance penetration of the fluorescent dye, thereby permitting morphometric analysis of both small and large-sized specimens.

سرعة اقتناء الصور 3D باستخدام عالية الدقة Episcopic المجهر

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) ...

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, methods involved in processing different biological samples involve unique practices. All conventional practices described in the literature for processing samples still find useful applications, but subtle changes in the sample preparation can alter image quality, as well as, introduce artifacts. Hence, using a unique sample preparation technique specific to the type of tissue analyzed is required to obtain a good quality image with ultrastructural resolution. The focus of this study is to provide the optimal sample preparation protocols for imaging embryos, rigid eggshells, and fungal cultures using SEM. The following optimizations were recommended to yield good results for the three different delicate biological samples studied. Use of milder fixatives like 4% paraformaldehyde or 3% glutaraldehyde followed by dehydration with ethanol series is mandatory. Fungal mycelium on agar blocks obtained by slide cultures yields a better ultrastructural integrity compared to cultures taken directly from agar plates. Chemical drying of embryos with HMDS provides drying without introducing surface tension artifacts compared to critical point drying. HMDS prevents cracking caused by shrinkage as samples are less brittle during drying. However, for fungal culture, critical point drying provides acceptable image quality compared to chemical drying. Eggshells can be imaged with no special preparation steps except for thorough washing and air drying prior to mounting. Preparation methodologies were standardized based on acceptable image quality obtained with each trial.&#160;

Here, we present detailed processing protocols for imaging delicate tissue samples using scanning electron microscopy (SEM). Three different processing methods, namely, hexamethyl disilazana (HMDS) chemical drying, simple air drying, and critical point drying are described for preparing rigid eggshells, embryos at early developmental stages, and fungal cultures respectively.

معالجة الجنين، قشر البيض، والثقافة الفطرية لمسح المجهر الإلكتروني

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

Environment

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a combination of light and electron microscopy. Samples embedded in resin are sectioned into arrays consisting of ribbons of hundreds of ultrathin sections and deposited on pieces of silicon wafer or conductively coated coverslips. Arrays are imaged at low resolution using a digital consumer like smartphone camera or light microscope (LM) for a rapid large area overview, or a wide field fluorescence microscope (fluorescence light microscopy (FLM)) after labeling with fluorophores. After post-staining with heavy metals, arrays are imaged in a scanning electron microscope (SEM). Selection of targets is possible from 3D reconstructions generated by FLM or from 3D reconstructions made from the SEM image stacks at intermediate resolution if no fluorescent markers are available. For ultrastructural analysis, selected targets are finally recorded in the SEM at high-resolution (a few nanometer image pixels). A ribbon-handling tool that can be retrofitted to any ultramicrotome is demonstrated. It helps with array production and substrate removal from the sectioning knife boat. A software platform that allows automated imaging of arrays in the SEM is discussed. Compared to other methods generating large volume EM data, such as serial block-face SEM (SBF-SEM) or focused ion beam SEM (FIB-SEM), this approach has two major advantages: (1) The resin-embedded sample is conserved, albeit in a sliced-up version. It can be stained in different ways and imaged with different resolutions. (2) As the sections can be post-stained, it is not necessary to use samples strongly block-stained with heavy metals to introduce contrast for SEM imaging or render the tissue blocks conductive. This makes the method applicable to a wide variety of materials and biological questions. Particularly prefixed materials e.g., from biopsy banks and pathology labs, can directly be embedded and reconstructed in 3D.

This protocol targets specific cells in tissue for imaging at nanoscale resolution using a scanning electron microscope (SEM). Large numbers of serial sections from resin-embedded biological material are first imaged in a light microscope to identify the target and then in a hierarchical manner in the SEM.

تصوير هرمي متعدد الوسائط من مقاطع المسلسل للعثور على أهداف محددة الخلوية داخل كميات كبيرة

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

التحليل الكمي الالتهام الذاتي باستخدام المجهر مضان المتقدم 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Biology

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

تصور هيولي باطني شبكية النطاقات الفرعية في الخلايا المستزرعة

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

<meta charset="utf8"></head><body>تصور الهياكل المشبكية للشبكية في 3D باستخدام المجهر الإلكتروني الحجمي

Preparation of Retinal Samples for Volume Electron Microscopy

Volume electron microscopy (Volume EM) has emerged as a powerful tool for visualizing the 3D structure of cells and tissues with nanometer-level precision. Within the retina, various types of neurons establish synaptic connections in the inner and outer plexiform layers. While conventional EM techniques have yielded valuable insights into retinal subcellular organelles, their limitation lies in providing 2D image data, which can hinder accurate measurements. For instance, quantifying the size of three distinct synaptic vesicle pools, crucial for synaptic transmission, is challenging in 2D. Volume EM offers a solution by providing large-scale, high-resolution 3D data. It is worth noting that sample preparation is a critical step in Volume EM, significantly impacting image clarity and contrast. In this context, we outline a sample preparation protocol for the 3D reconstruction of photoreceptor axon terminals in the retina. This protocol includes three key steps: retina dissection and fixation, sample embedding processes, and selection of the area of interest.

<meta charset="utf8"></head><body>كاشفة المؤلف: دراسات علم الأعصاب الشبكية مع المجهر الإلكتروني الحجمي

This protocol describes the detailed steps for preparing retinal samples for volume electron microscopy, focusing on the structural features of retinal photoreceptor terminals.

تحضير عينات الشبكية للفحص المجهري الإلكتروني الحجمي

Volume electron microscopy (Volume EM) has emerged as a powerful tool for visualizing the 3D structure of cells and tissues with nanometer-level ...

Neuroscience

<meta charset="utf8"></head><body>البروتوكول الأمثل لإعداد عينة الشبكية العضوية ل TEM

Preparing Retinal Organoid Samples for Transmission Electron Microscopy

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) under specific conditions. Synapse development and maturation in ROs have been studied immunocytochemically and functionally. However, the direct evidence of the synaptic contact ultrastructure is limited, containing both special ribbon synapses and conventional chemical synapses. Transmission electron microscopy (TEM) is characterized by high resolution and a respectable history elucidating retinal development and synapse maturation in humans and various species. It is a powerful tool to explore synaptic structure in ROs and is widely used in the research field of ROs. Therefore, to better explore the structure of RO synaptic contacts at the nanoscale and obtain high-quality microscopic evidence, we developed a simple and repeatable method of RO TEM sample preparation. This paper describes the protocol, reagents used, and detailed steps, including RO fixation preparation, post fixation, embedding, and visualization.

<meta charset="utf8"></head><body>تسليط الضوء على المؤلف: تحليل البنية التحتية المتشابكة في عضويات الشبكية الناضجة باستخدام TEM

This protocol provides an optimized and elaborate preparation procedure for retinal organoid samples for transmission electron microscopy. It is suitable for applications that involve the analysis of synapses in mature retinal organoids.

تحضير عينات الشبكية العضوية للمجهر الإلكتروني النافذ

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem ...

عالية الدقة مجهر ابيسكوبي (هريم) - بروتوكولات بسيطة وقوية لمعالجة وتصور المواد العضوية

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ذات دقة عالية الألياف الضوئية للMicroendoscopy في الموقع الخلوية التصوير

سرعة اقتناء الصور 3D باستخدام عالية الدقة Episcopic المجهر

معالجة الجنين، قشر البيض، والثقافة الفطرية لمسح المجهر الإلكتروني

تصوير هرمي متعدد الوسائط من مقاطع المسلسل للعثور على أهداف محددة الخلوية داخل كميات كبيرة

التحليل الكمي الالتهام الذاتي باستخدام المجهر مضان المتقدم 3D

تصور هيولي باطني شبكية النطاقات الفرعية في الخلايا المستزرعة

تحضير عينات الشبكية للفحص المجهري الإلكتروني الحجمي

تحضير عينات الشبكية للفحص المجهري الإلكتروني الحجمي

تحضير عينات الشبكية للفحص المجهري الإلكتروني الحجمي

تحضير عينات الشبكية العضوية للمجهر الإلكتروني النافذ