Name: high-resolution episcopic microscopy (hrem) - simple and robust protocols for processing and visualizing organic materials
Uploaded: 2017-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
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Los autores agradecen a Tim Mohun por su invalubale contribuciones en el desarrollo de HREM y Petra Heffeter para proporcionar muestras.

Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las directrices éticas de la Universidad Médica de Viena. 1. Preparación de la muestra <ol><li> Preparación de embriones y tejidos embrionarios (hasta 5 x 5 x 5 mm 3 ) <ol><li> Fijar los embriones o partes de los embriones en 4% de PFA / PBS o fijador de Bouin a 4 ° C durante al menos 16 - 24 h bajo balanceo constante. NOTA: Pueden utilizarse embriones de varias especies y de diversas etapas de desarrollo, como el pez cebra de 48 h, el pollo y la codorniz de 19 h, y también los embriones de ratón prenatal, que se usaron aquí (ver Resultados Representativos ). Los especímenes se cosecharon y se transfirieron a PBS a temperatura ambiente para la estadificación, antes de que se pusieran en fijador. Si es necesario, recortar los especímenes con micro-tijeras o escalpelos antes de la fijación para encajar en los moldes de incrustación. </li><li> Quitar el fijador y lavar el tejido del embrión en PBS a 4 ° C bajo rockin constanteG durante 24 h (2-3 cambios). </li><li> Deshidratar las muestras en etanol al 70%, 80%, 90% y 96% a 4 ° C durante 2 - 3 h cada una. Coloque los tubos que contienen las muestras en un rotador. NOTA: Para muestras pequeñas (&lt;2 x 2 x 2 mm 3 ), el tiempo de reposo de una muestra en cada etanol puede reducirse a 60 min. Para muestras grandes (&gt; 5 x 5 x 5 mm 3 ), puede extenderse hasta 4 h. </li><li> Realice los siguientes pasos de infiltración debajo de una campana extractora con guantes protectores. <ol><li> Preparar la solución de infiltración añadiendo 1,25 g de peróxido de benzoilo (catalizador plastificado) y 0,4 g de eosina a 100 ml de solución A (para más detalles ver Tabla de Materiales ). Se agita esto en un vaso de precipitados sobre una placa de agitación magnética a 4 ° C hasta que la eosina y el catalizador se disuelven completamente (2 - 3 h). </li><li> Colocar las muestras durante 12 - 24 h en la solución de infiltración. Manténgalo a 4 ° C bajo balanceo continuo o rotación. Reemplazar la solución de infiltración con solución fresca después de 3 y 12marido. NOTA: Extienda el tiempo de infiltración a 48 h para embriones grandes (&gt; 1 cm de corona / longitud de nalga). </li></ol></li></ol></li><li> Preparación de muestras de tejidos adultos (hasta 5 x 5 x 7 mm 3 ) <ol><li> Fijar los tejidos en PFA al 2% / PBS que contiene 4% de ácido carbólico a 4 ° C durante al menos 3 días. En esta solución se puede fijar una muestra de tejido procedente de piel, hígado, páncreas, riñón, tiroides, corazón, músculo estriado, cerebro, nervios y modelos tumorales de varios humanos neonatales y adultos, roedores, cerdos, moscas de la fruta y peces cebra Y luego se procesan para la imagen HREM (demostramos la fijación de las muestras, ver Resultados Representativos ). Excise las muestras de tejido con bisturíes, tijeras o punzones de biopsia y transferirlos directamente en fijador. Para la fijación del tejido nervioso se utiliza PFA al 4% / PBS. </li><li> Retire el fijador y lave el tejido con agua corriente del grifo durante 3-6 h. </li><li> Deshidrate las muestras posteriormenteEn etanol al 70%, 80%, 90% y 96%, mezclado con 0,4 g de eosina por 100 ml (2 - 3 h cada uno). Mantener las soluciones con muestras a 4 ° C bajo balanceo constante o en un rotador. NOTA: Para muestras pequeñas (&lt;2 x 2 x 2 mm 3 ), el tiempo de reposo de una muestra en cada etanol puede reducirse a 60 min. Para muestras grandes (&gt; 5 x 5 x 5 mm 3 ), se puede extender a 4-8 h. </li><li> Realizar todos los siguientes pasos de infiltración bajo una campana de humos con guantes protectores. <ol><li> Preparar la solución de infiltración añadiendo 1,25 g de peróxido de benzoilo (catalizador plastificado) y 0,4 g de eosina a 100 ml de Solución A (para más detalles ver Tabla de Materiales ). Se agita en un vaso de precipitados sobre una placa de agitación magnética a 4 ° C hasta que la eosina y el catalizador se disuelven completamente (2 - 3 h). </li><li> Colocar las muestras en solución de infiltración durante 24 - 36 h. Manténgalo a 4 ° C bajo balanceo continuo o rotación. Reemplazar la solución de infiltración con solución fresca después de 3 y12 h. NOTA: Para muestras grandes (&gt; 5 x 5 x 5 mm 3 ) prolongar el tiempo de infiltración a 48 h. </li></ol></li></ol></li><li> Preparación de otros materiales orgánicos NOTA: Recorte los sustitutos de la piel y el papel con el tamaño deseado con tijeras ordinarias. No se requiere fijación. <ol><li> Pasar los pasos de fijación, lavado y deshidratación. </li><li> Realizar todos los siguientes pasos de infiltración bajo una campana de humos con guantes protectores. <ol><li> Preparar la solución de infiltración añadiendo 1,25 g de peróxido de benzoilo (catalizador plastificado) y 0,4 g de eosina a 100 ml de Solución A (para más detalles ver Tabla de Materiales ). Se agita en un vaso de precipitados a 4ºC en una placa de agitación magnética hasta que la eosina y el catalizador se disuelven completamente (2 - 3 h). </li><li> Colocar las muestras en solución de infiltración durante 3 - 12 h. Manténgalo a 4 ° C bajo balanceo continuo o rotación. Reemplazar la solución de infiltración con solución fresca después de 1 y 2 - 4 h. </li></ol> &lt;Li </ol></li></ol> 2. Incorporación NOTA: Realice todos los pasos bajo una campana extractora de humos usando guantes protectores. <ol><li> Preparar solución de infiltración fresca como se ha descrito anteriormente (paso 1.1.4.1). Añadir 4 mL de Solución B (para más detalles, ver Tabla de Materiales ) a 100 mL de solución de infiltración para preparar la solución de incrustación. NOTA: Si se requiere una orientación precisa de la muestra en los moldes de empotramiento y para permitir la incrustación de varias muestras en paralelo, ralentizar la polimerización de la solución madre poniendo el vaso en un baño de hielo. </li><li> Utilice bandejas para molduras (para detalles, véase la Tabla de Materiales ) con moldes que tengan un volumen rutinario de 6 x 8 x 5 mm 3 o 13 x 19 x 5 mm 3 , o moldes personalizados con volúmenes de hasta 8 x 10 x 15 mm 3 ( Figura 2 ). </li><li> Llenar los moldes con solución de incrustación y transferir la muestra al molde usandouna cuchara. Durante la transferencia asegúrese de que la muestra esté completamente cubierta con solución de incrustación para evitar el atrapamiento de aire. NOTA: Esto se puede hacer a temperatura ambiente, si se inicia inmediatamente después de recoger las muestras y la solución de incrustación del refrigerador. <ol><li> Oriente la muestra dentro del molde usando agujas o fórceps. </li><li> Tan pronto como la solución de empotramiento empieza a volverse viscoso, coloque un soporte de bloque (véase la Tabla de Materiales ) encima del molde y añada la solución de incrustación a través del orificio central del soporte del bloque hasta que la base del soporte del bloque esté cubierta con 1 - 2 Mm de solución de incrustación. </li><li> Selle la bandeja de la taza de moldeo cubriéndola con cera de parafina líquida y espere hasta que se haya endurecido. Alternativamente, coloque una segunda bandeja de la taza de moldeo al revés en la bandeja de la taza de moldeo con muestras y séllela con cinta adhesiva a prueba de aire. </li></ol></li><li> Permita que los bloques terminen la polimerización almacenando las bandejas selladas de la taza del moldeado para 1 -2 días a temperatura ambiente. </li><li> Para el procesamiento posterior a la polimerización, coloque las bandejas de molduras con los bloques polimerizados en un horno de laboratorio estándar y hornee a 70-80 ° C durante un mínimo de 1 a 2 días hasta que se vuelvan de color rojo oscuro. Recoger las bandejas del horno y quitar los bloques del molde. NOTA: El horneado se puede hacer bajo condiciones ambientales normales. La bandeja de cubeta de moldeo que asegura el sellado hermético en la primera fase después del empotramiento, se puede retirar para permitir la comprobación del color de la resina después de 10 h. Inmediatamente después de hornear, la resina es blanda y los bloques se pueden quitar fácilmente de la bandeja de la taza de moldeo. Dentro de 2 - 3 h son duros y se pueden almacenar a temperatura ambiente durante varios meses. </li></ol> 3. Generación de datos NOTA: El prototipo HREM 18 , 25 utilizado aquí comprende los siguientes elementos: (i) Microtomo rotatorio con un soporte de bloqueQue se detiene después de cada corte en su punto de giro superior. (Ii) Cuchillo de microtomo estándar, no desechable, metal duro, perfil D (para detalles, ver Tabla de Materiales ). (Iii) Cabeza de microscopio compuesto fluorescente con revólver objetivo y un cubo de filtro GFP (excitación 470/40, filtro de emisión 525/50) en su eje óptico. El eje óptico está dispuesto perpendicular a la superficie recién cortada de un bloque montado en el microtomo y está sujeto por un dispositivo que permite el movimiento hacia arriba y hacia abajo. (Iv) Mesa transversal motorizada que lleva el microtomo. La mesa puede desplazarse en la dirección del eje óptico y lateralmente. (V) Cámara de video digital conectada al microscopio compuesto fluorescente. (Vi) Fuente de luz monocromática (470 nm). Vii) Ordenador conectado a la cámara, con software de generación de datos (para más detalles, véase Tabla de materiales ). <ol><li> Procedimiento <ol><li> Indique la región de interés. <ol><li> Utilizar laboratorio de laboratorio estándarGht (véase la Tabla de materiales ) para dirigir la luz blanca oblicuamente a la superficie del bloque. </li><li> Identificar los contornos del material incrustado a medida que se proyecta a la superficie del bloque. Indique la región de interés y el campo de visión posterior sobre la superficie del bloque utilizando una pluma o una hoja de afeitar. NOTA: Este paso es obligatorio para definir el alcance del campo de visión antes de seccionar. </li></ol></li><li> Defina el campo de visión. <ol><li> Monte el bloque de resina con la muestra en el micrótomo. </li><li> Mueva el soporte del bloque a su posición de parada (punto de giro superior de la excursión del soporte del bloque). </li><li> Inicie la cámara digital y el software de generación de datos, y adquiera una imagen en vivo. </li><li> Elija una lente objetivo, con una ampliación adecuada para cubrir la región de interés indicada en la superficie del bloque. NOTA: Los objetivos con ampliaciones 2.5X, 5X, 10X, 20X y aberturas numéricas entre 0.07 y 0.40 se utilizan comúnmente. </li&gt; <li> Mueva la óptica hacia arriba y hacia abajo y el microtomo lateralmente usando la mesa cruzada motorizada hasta que la región de interés coincida con el campo de visión que se muestra en la pantalla del ordenador. </li></ol></li><li> Atención. <ol><li> Realizar el corte manual paso a paso hasta que las primeras estructuras de la muestra sean visibles. </li><li> Coloque la superficie del bloque en el plano de enfoque de la óptica, moviendo el micrótomo en la dirección del eje óptico. </li><li> Elija el grosor de la sección; Se recomiendan espesores de sección de 0,5 a 5 μm. </li></ol></li></ol></li><li> Generación y procesamiento de datos <ol><li> Inicie la rutina de software que orquesta secciones y captura de imágenes. Siga las instrucciones documentadas del software de captura de imágenes. </li><li> Detenga la rutina de software y coloque una diapositiva de escalado delante de la superficie del bloque tan pronto como la muestra esté completamente seccionada. </li><li> Capturar una imagen de forma interactiva para calibración posteriorCión. NOTA: Esto debe hacerse cada vez que se utiliza un objetivo en una configuración recién configurada. </li><li> Convierta la serie de imágenes en imágenes de escala de grises de 8 bits en formato .jpg. </li><li> Cargue las series de imágenes en el software de visualización 3D y ajuste los contrastes. NOTA: La conversión de imágenes y la visualización en 3D pueden realizarse con varios paquetes de software estándar comercialmente o libremente disponibles, siguiendo las instrucciones del software respectivo. </li></ol></li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

HREM es un método microscópico muy robusto que es ideal para visualizar un amplio espectro de materiales orgánicos utilizados en la biomedicina y la industria ( 18 , 21 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37). , 38 , 39 , 40 . Puede emplearse como una modalidad de imagen exclusiva, tal como se utiliza actualmente en el programa de Mecanismos de los Trastornos del Desarrollo (DMDD) 41 , 42 <suP&gt;, 43 , 44 , o como una parte integradora de tuberías de imágenes multimodales [ 45] . Un aparato de generación de datos HREM completamente funcional puede ser ensamblado a partir de componentes de laboratorio convencionales y comprende un microtomo motorizado, un microscopio, una tabla cruzada motorizada y un ordenador con un software apropiado 25 . Es crítico utilizar un microtomo equipado con un soporte de bloque que se detiene reproduciblemente después de cada sección en una posición definida y cubos de filtro GFP dentro de la vía óptica. Sin embargo, las soluciones integrales que funcionan plenamente se pueden adquirir en compañías como Indigo Scientific. HREM se enfrenta a las mismas limitaciones que todas las técnicas histológicas, excepto que no se introducen artefactos durante la sección o la sección de montaje. Sin embargo, existen limitaciones, que resultan de la necesidad de teñir los especímenes antes de seccionar yA partir de las características del material de incrustación. La penetración de eosina a través de todo el espécimen se requiere para obtener suficientes contrastes de tejido; El material muy denso, los tejidos adiposos y las sustancias anorgales obstaculizan eficazmente la penetración de eosina y esto da lugar a tejidos no teñidos en el centro de los objetos. El uso de fijadores especiales ayuda a manchar las muestras de piel, pero todavía no hay un método adecuado para superar el problema. Otra limitación es que las resinas que bloquean más de 2 cm tienden a romperse durante la sección. Esto se puede evitar parcialmente cortando los especímenes y las piezas de procesamiento por separado. La colocación correcta de pequeñas muestras o muestras con superficies irregulares en los moldes durante la incorporación es a menudo problemática. Cubrir las muestras con agarosa y procesar los bloques de agarosa como se describe en el protocolo por lo general resuelve este problema [ 19] . Un enfoque alternativo, que también ayuda si los bloques se rompen durante la sectiEs quitar el bloque ya endurecido de su soporte e insertarlo de nuevo, siguiendo el procedimiento de incrustación descrito. Un conjunto de datos HREM típico comprende de 500 a 3.000 imágenes individuales. Su resolución numérica está determinada por la distancia entre las imágenes sucesivas ( es decir , por el grosor de la sección), la característica del objetivo de la cámara y las propiedades de la óptica utilizada. Utilizamos espesores de sección entre 1 μm y 5 μm y obtuvimos buenos resultados, aunque los protocolos presentados no eliminan totalmente el brillo de los artefactos 20 , 46 . Estos artefactos son causados ​​por los tejidos intensamente teñidos localizados profundamente dentro del bloque, dando por resultado la borrosidad de la información del tejido en las superficies del bloque cerca. Las cámaras tenían dimensiones de objetivo de 2,560 x 1,920 píxeles 2 , 2,048 x 2,048 píxeles 2 , y 4,096 x 4,096 píxeles 2 y eran combiNizado con lentes objetivos 1.25X, 2.5X, 5X, 10X y 20X. Esto resultó en tamaños de píxeles numéricos entre 0,18 x 0,18 μm 2 y 5,92 x 5,92 μm 2 , que resultó ser suficiente para el análisis 3D de la arquitectura de los tejidos y las formas celulares, e incluso para visualizar núcleos. Dada la alta resolución numérica, otros organelos celulares también deben ser visibles. Los contrastes insuficientes debidos a la simple tinción con eosina y las propiedades ópticas de los objetivos disminuyen drásticamente la posibilidad de discriminar las estructuras. La máxima resolución espacial real de los datos HREM, que tiene en cuenta la apertura numérica, es de aproximadamente 1 x 1 x 1 μm 3 , y por lo tanto sólo permite una discriminación efectiva de estructuras mayores que aproximadamente 3 x 3 x 3 μm 3 . Un problema común a todas las técnicas de imagen digital es el intercambio entre el tamaño del campo de visión, que define la parte del espécimen que puede ser displayeD en el objetivo de la cámara y la resolución numérica de la imagen. Cuanto mayor sea el campo visual, menor será la resolución numérica máxima posible 46 . La configuración HREM utilizada aquí permite la generación de datos HREM con un campo de visión entre 0,74 x 0,74 mm 2 (objetivo 20X), visualizado en una resolución numérica de 0,18 x 0,18 μm 2 y 12,12 x 12,12 mm 2 (objetivo 1,25X) Una resolución numérica de 2,96 x 2,96 μm 2 . Los montajes alternativos y comercializados pueden proporcionar campos de visión más amplios, pero a costa de una verdadera resolución. Sin embargo, proporcionan excelentes resultados, como es evidente a partir de los datos mostrados en la página principal del programa DMDD 47 .

El análisis estructural de materiales orgánicos y anorgánicos es el primer paso para comprender sus propiedades físicas y su función. La base de este análisis suele ser la información bidimensional (2D) obtenida mediante la observación cuidadosa de las secciones histológicas, con una variedad de métodos de imagen sencillos y sofisticados que extraen detalles de la arquitectura tisular, la morfología celular y la topología, la composición molecular y las propiedades biomecánicas 1 , 2 , 3 . Sin embargo, la información 2D no es adecuada para investigar arreglos espacialmente complejos. Por lo tanto, un número creciente de métodos in vivo y ex vivo que permiten la generación de datos de volumen digital se establecieron en las últimas décadas 4 y muchos más están en desarrollo. El principio metódico de la mayoría de los métodos de generación de datos de volumen es la generación de pilas virtualesDe imágenes digitales que muestran secciones ganadas por la sección virtual o física de un objeto. Si las imágenes de la sección están alineadas correctamente, se crea un volumen, que puede seccionarse en planos de sección virtual o utilizado para crear modelos de superficie y volumen 3D renderizados. Las técnicas más populares para la visualización de humanos y especímenes biológicos más grandes son la tomografía por resonancia magnética (RMT), la tomografía computarizada (CT), la tomografía por emisión de positrones (PET) y la tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT). Los especímenes pequeños se visualizan generalmente mediante imágenes de resonancia micro-magnética (RMM), tomografía de proyección óptica (OPT), tomografía de coherencia óptica (OCT), tomografía fotoacústica (PAT), métodos de corte histológico, microscopía confocal y tomografía electrónica 5,6 . , 7 , 8 , 9 , 10 <sUp&gt;, 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Una técnica de generación de datos de volumen relativamente nueva, que produce datos digitales de pequeños especímenes y muestras histológicas de tejidos es el método HREM, que se desarrolló en estrecha cooperación con Tim Mohun 18 , 19 . Es una técnica basada en un microscopio simple, que genera datos de volumen digital de material embebido en resina que se secciona en un microtomo. Los datos facilitan el análisis detallado de la arquitectura del tejido y las distribuciones de células, así como el análisis métrico de pequeñas características a un nivel microscópico de luz intermedia. HREM produce pilas de imágenes digitales inherentemente alineadas que aparecen como capturadas de eOsin manchado secciones histológicas. El contraste de los tejidos y la resolución de los datos con respecto al campo de visión superan a los datos producidos con μCT, μMRI y OPT, pero son inferiores a los obtenibles con microscopía confocal, de láminas y microscopía electrónica 20 . Sin embargo, a diferencia de este último, HREM es capaz de visualizar especímenes con volúmenes relativamente grandes de hasta 5 x 5 x 7 mm 3 en calidad histológica. Una serie de estudios recientes proporcionan caracterizaciones detalladas y comparaciones de ventajas y desventajas de las técnicas de imagen única y, en aras de la objetividad, nos referimos a ellas para obtener más información con respecto a sus limitaciones y campos potenciales de aplicaciones 4 , 21 , 22 , 23 , 24 . Este estudio se centra en el método de imagen HREM y tiene como objetivo proporcionarProtocolos muy simples para generar datos HREM de un amplio espectro de materiales orgánicos, así como ejemplos de su aplicación. El flujo de trabajo para crear datos HREM es simple y se aplica a todos los materiales que pueden incrustarse en resina de metacrilato ( Figura 1 ). Sin embargo, existen diferencias específicas en los tejidos en la preparación de la muestra, que deben tenerse en cuenta. Por lo tanto, proporcionamos tres protocolos estándar para preparar varias muestras. Los pasos del protocolo de incorporación y generación de datos son idénticos para todos ellos.

<table><tbody><tr><td>JB-4 Plus Embedding Kit</td><td>Polysciences Europe GmbH</td><td>18570-1</td><td>includes Benzoyl Peroxide, Plasticized (Catalyst) and Solution A+B</td></tr><tr><td>Polyethylene Molding Cup Trays, 6 x 8 x 5 mm hexagon (9 cavities)</td><td>Polysciences Europe GmbH</td><td>17177A-3</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Molding Cup Trays, 13 x 19 x 5 mm (9 cavities)</td><td>Polysciences Europe GmbH</td><td>17177C-3</td><td></td></tr><tr><td>JB-4 Plastic Block Holders</td><td>Polysciences Europe GmbH</td><td>15899-50</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Waldeck GmbH &amp;amp; Co. KG, Division Chroma</td><td>1A-196</td><td></td></tr><tr><td>Microtec CUT 4060E</td><td></td><td></td><td>rotary microtome</td></tr><tr><td>Leica DM LM, fluorescence compound microscope</td><td>Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP filter set</td><td>Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td><td>11090937180000</td><td></td></tr><tr><td>Motorised cross table</td><td>Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH &amp;amp; CO. KG</td><td>KT5-LSMA</td><td></td></tr><tr><td>Digital video camera SPOT-FLEX</td><td>Visitron Systems GmbH.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>precisExcite High-Power LED</td><td>Visitron Systems GmbH.</td><td></td><td>light source</td></tr><tr><td>VisiView 2.1.4</td><td>Visitron Systems GmbH.</td><td></td><td>Image capturing software</td></tr><tr><td>Hard metal knife (tungsten carbide), profile D</td><td>Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KL 2500 LCD</td><td>Schott AG</td><td></td><td>light source</td></tr></tbody></table>

high-resolution episcopic microscopy (hrem) - simple and robust protocols for processing and visualizing organic materials

Proporcionamos protocolos simples para generar datos de volumen digital con el método de alta resolución de microscopía episcopal (HREM). HREM es capaz de visualizar materiales orgánicos con volúmenes de hasta 5 x 5 x 7 mm 3 en resoluciones numéricas típicas entre 1 x 1 x 1 y 5 x 5 x 5 μm 3 . Los especímenes están embebidos en resina de metacrilato y seccionados en un microtomo. Después de cada sección se captura una imagen de la superficie del bloque con una cámara de video digital que se asienta sobre el fototubo conectado al cabezal del microscopio compuesto. El eje óptico pasa a través de un cubo de filtro de proteína fluorescente verde (GFP) y está alineado con una posición, en la que el brazo de soporte de bock se apoya después de cada sección. De este modo, se producen una serie de imágenes digitales inherentemente alineadas, mostrando subsiguientes superficies de bloques. Cargar una serie de imágenes en un software de visualización tridimensional (3D) facilita la conversión inmediata a datos de volumen digital, lo que permiteEn varios planos ortogonales y oblicuos y la creación de modelos computarizados de volumen y superficie. Presentamos tres sencillos protocolos específicos de tejidos para el procesamiento de diversos grupos de especímenes orgánicos, incluyendo embriones de ratón, pollo, codorniz, rana y cebra, biopsia humana, papel sin recubrir y material de reemplazo de piel.

HREM genera series de imágenes digitales inherentemente alineadas con contrastes similares a imágenes de secciones histológicas teñidas con hematoxilina / eosina. A diferencia de las imágenes de la sección 2D, las pilas de imágenes HREM permiten la visualización y el análisis de la arquitectura del tejido, la morfología y la topología de una amplia variedad de materiales orgánicos en 3D. El alto contraste facilita a menudo la visualización 3D rápida y simple de los modelos de computadora rendidos del volumen y de los resultados semiautomáticos del contorno para la generación de modelos rendidos de la superficie. El tamaño de los datos HREM varía según el tamaño del objetivo de la cámara, el modo de captura de imágenes (8, 12, 16 bits, escala de grises, color) y el número de imágenes de una sola cara de bloque. Los conjuntos de datos más pequeños de 1.000 8-bit.jpg imágenes de escala de grises de 2.048 píxeles x 2.048 píxeles tienen un tamaño de alrededor de 900 MB. Grandes conjuntos de datos de 3.000 8-bit.jpg imágenes en escala de grises de 4.096 pIxel x 4.096 píxeles tienen volúmenes de aproximadamente 20 GB. Los protocolos proporcionados son simples y robustos, y durante la última década, se emplearon para generar datos HREM de muchos especímenes diferentes. La sección 1.1 del protocolo se optimizó para procesar embriones enteros de organismos modelo biomédicos con una longitud de hasta 1 cm y muestras de tejido embrionario con una dimensión de hasta 5 x 5 x 5 mm 3 ; Se utilizó este método para producir datos HREM de embriones de las siguientes especies: ratón ( Mus musculus) , gallina gallus , pez cebra ( Danio rerio ), codorniz ( Coturnix coturnix) , rana con garras africanas ( Xenopus laevis ), caballo Equus ferus caballus ), insecto de la algaroba ( Oncopeltus fasciatus ), cocodrilo ( Crocodylia ) y pulpo ( Octopus vulgaris ). Los datos de todas las especies fueron de excelente calidad ( por ejemplo , la Figura 3 ) 3 y se empleó para visualizar muestras de tejido de la muestra ( Homo sapiens ), ratones ( Mus musculus ), ratas ( Rattus norvegicus ), cerdos ( Sus scrofa domestica ) hurón ( Mustela ( Mustela )), de la piel, hígado, páncreas, riñón, tiroides, corazón, músculo estriado, Furo ), mosca de la fruta ( Drosophila melanogaster ) y peces cebra ( Danio rerio ). Si bien los resultados fueron excelentes con la mayoría de los especímenes ( p . Ej. , Figura 4 , Animación 1 ), las partes muy centrales de la piel (con epidermis) y especímenes cerebrales mayores de 3 x 3 x 3 mm 3 a menudo permanecían sin manchas debido a la penetración insuficiente de eosina a través de Estos tejidos. Protocolo mLa ecuación 1.3 fue optimizada para procesar material orgánico fibroso y empleada para visualizar la arquitectura de fibra de papel revestido, papel no revestido, material sustitutivo dérmico nativo y material sustitutivo dérmico sembrado de células madre. Estas muestras fueron fáciles y rápidas de procesar. Los datos del papel sin recubrir y la mayoría de los sustitutos de la piel fueron de buena calidad ( Figura 5 , Animación 2 ). Se produjeron problemas en el procesamiento del papel revestido, cuando el material anorgánico impedía la penetración de la eosina. Otro problema ocurrió al procesar los sustitutos de la piel a base de agar porque se convirtieron en parte digeridos por la solución de infiltración. <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig1.jpg" /> Figura 1: Flujo de trabajo. Los pasos mostrados en las casillas rojas requieren modificaciones de acuerdo con las características de la muestra. Los pasos en las casillas verdes son los queSon similares en todas las muestras. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/56071fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig2.jpg" /> Figura 2: Moldes personalizados. Los moldes se pueden adaptar cortando un agujero en el molde original, insertando el bulbo de una pipeta de Pasteur y sellándolo con el material de modelado. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/56071fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig3.jpg" /> Figura 3: Embriones ejemplarizados. (A, B) Embrión de ratón cosechado en el día embrionario, E = 9,5. La imagen de la sección HREM se muestra en (A) </Fuerte El modelo 3D que muestra la superficie se muestra en (B) . (C) Sección sagital virtual a través de un modelo de volumen volcado del cuello de un embrión de ratón E15.5. (D) Embrión de pollo en desarrollo Hamburger Hamilton (HH) etapa 18. Modelo de superficie de la lumina de los componentes cardiovasculares combinado con la producción de volumen de todos los tejidos del embrión. Barras de escala = 200 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/56071fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig4.jpg" /> Figura 4: Muestras de tejidos adultos visualizados de forma ejemplar. (A) Parte de una imagen de sección HREM a través de un nervio humano. El recuadro muestra una sección de la imagen con más detalle. (B) Parte de una imagen de la sección HREM a través del hígado porcino. Observe el nUclei (C) Parte de una imagen de sección HREM de tejido linfático humano. (D, E) Piel gruesa de una almohadilla humana del pulgar. Volumen renderizado modelo 3D de toda la biopsia. (D) Modelos rendidos superficiales de arterias, venas y nervios frente a una resección virtual a través de datos HREM (E) . (F) Tumor experimental en tejido de ratón adulto. Volumen renderizado modelo 3D delante de tres secciones virtuales a través de datos HREM. Observe las partes necróticas (puntas de flecha). Barras de escala = 200 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/56071fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig5.jpg" /> Figura 5: Material fibroso visualizado de forma ejemplar. (A, B) Imagen de sección HREM de papel marrón sin recubrir. (SEGUNDO) </sTrong&gt; muestra una sección de (A) . Observe las fibras y su luz. (C) sección HREM de papel revestido. Observe que las fibras permanecen sin manchas. (D) Modelo volcado en volumen de material sustitutivo dérmico nativo. Observe el calibre diferente y la forma de las fibras. Barras de escala = 100 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/56071fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Película 1" src="/files/ftp_upload/56071/56071mov1.jpg" /> Animación 1: Volume Rendered Modelo de la piel gruesa de una almohadilla del pulgar humano. El tamaño del bloque de tejido es de aproximadamente 4,2 x 2,7 x 2,7 mm 3 . El tamaño de Voxel es 1,07 x 1,07 x 2 mu m 3 . <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/animation1.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para ver este video. (Haga clic derecho para descargar.)</a> <pClass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Película 2" src="/files/ftp_upload/56071/56071mov2.jpg" /> Animación 2: Modelo de Rendimiento de Volumen de Material Dermal Substituto Nativo. El tamaño de la muestra es de aproximadamente 1,2 x 0,85 x 0,4 mm3. El tamaño de Voxel es 0,54 x 0,54 x 2 mu m 3 . <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56071/animation2.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para ver este video. (Haga clic derecho para descargar.)</a>

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High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

Proporcionamos protocolos simples y robustos para procesar material de biopsia de varias especies, embriones de organismos modelo biomédicos y muestras de otros tejidos orgánicos para permitir la generación de datos de volumen digital con el método de microscopía episcopal de alta resolución.

Microscopía Episcopal de Alta Resolución (HREM) - Protocolos simples y robustos para procesar y visualizar materiales orgánicos

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

high-resolution-episcopic-microscopy-hrem-simple-robust-protocols-for

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

10.1K vistas.  Medical University of Vienna.  Proporcionamos protocolos simples y robustos para procesar material de biopsia de varias especies, embriones de organismos modelo biomédicos y muestras de otros tejidos orgánicos para permitir la generación de datos de volumen digital con el método de microscopía episcopal de alta resolución. 

Video: High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

De alta resolución de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imágenes

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Investigación

Bioingeniería

Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) morphometric data. Here, we describe the detailed protocol to image the entire mouse embryo. The protocol consists of four major sections: sample preparation, embedding, image acquisition and finally, 3D visualization. The technology requires specimens to be stained with a fluorescent dye, which can be problematic for large or dense specimens. To overcome this limitation, we have improved the existing protocol to enhance tissue penetration of the dye by pretreating the specimen with a solution containing urea and sodium dodecyl sulfate. The protocol uses only routine laboratory equipment and reagents for easy adaptation in standard laboratory settings. We show that the resulting high-resolution 3D images faithfully recapitulate the detailed morphologic features of the internal organs of mouse embryos, thereby permitting morphometric analyses. Together, we present a detailed and improved protocol using standard laboratory equipment to acquire high-resolution 3D images of small and large sized specimens.

We describe a detailed protocol using high-resolution episcopic microscopy to acquire three-dimensional (3D) images of mouse embryos. This improved protocol utilizes a modified tissue preparation method to enhance penetration of the fluorescent dye, thereby permitting morphometric analysis of both small and large-sized specimens.

Adquisición rápida de imágenes en 3D de alta resolución Usando Episcópico Microscopía

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) ...

Biología del Desarrollo

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, methods involved in processing different biological samples involve unique practices. All conventional practices described in the literature for processing samples still find useful applications, but subtle changes in the sample preparation can alter image quality, as well as, introduce artifacts. Hence, using a unique sample preparation technique specific to the type of tissue analyzed is required to obtain a good quality image with ultrastructural resolution. The focus of this study is to provide the optimal sample preparation protocols for imaging embryos, rigid eggshells, and fungal cultures using SEM. The following optimizations were recommended to yield good results for the three different delicate biological samples studied. Use of milder fixatives like 4% paraformaldehyde or 3% glutaraldehyde followed by dehydration with ethanol series is mandatory. Fungal mycelium on agar blocks obtained by slide cultures yields a better ultrastructural integrity compared to cultures taken directly from agar plates. Chemical drying of embryos with HMDS provides drying without introducing surface tension artifacts compared to critical point drying. HMDS prevents cracking caused by shrinkage as samples are less brittle during drying. However, for fungal culture, critical point drying provides acceptable image quality compared to chemical drying. Eggshells can be imaged with no special preparation steps except for thorough washing and air drying prior to mounting. Preparation methodologies were standardized based on acceptable image quality obtained with each trial.&#160;

Here, we present detailed processing protocols for imaging delicate tissue samples using scanning electron microscopy (SEM). Three different processing methods, namely, hexamethyl disilazana (HMDS) chemical drying, simple air drying, and critical point drying are described for preparing rigid eggshells, embryos at early developmental stages, and fungal cultures respectively.

Procesamiento de embriones, cáscara de huevo y cultivo de hongos para escanear microscopía electrónica

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

Medio ambiente

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a combination of light and electron microscopy. Samples embedded in resin are sectioned into arrays consisting of ribbons of hundreds of ultrathin sections and deposited on pieces of silicon wafer or conductively coated coverslips. Arrays are imaged at low resolution using a digital consumer like smartphone camera or light microscope (LM) for a rapid large area overview, or a wide field fluorescence microscope (fluorescence light microscopy (FLM)) after labeling with fluorophores. After post-staining with heavy metals, arrays are imaged in a scanning electron microscope (SEM). Selection of targets is possible from 3D reconstructions generated by FLM or from 3D reconstructions made from the SEM image stacks at intermediate resolution if no fluorescent markers are available. For ultrastructural analysis, selected targets are finally recorded in the SEM at high-resolution (a few nanometer image pixels). A ribbon-handling tool that can be retrofitted to any ultramicrotome is demonstrated. It helps with array production and substrate removal from the sectioning knife boat. A software platform that allows automated imaging of arrays in the SEM is discussed. Compared to other methods generating large volume EM data, such as serial block-face SEM (SBF-SEM) or focused ion beam SEM (FIB-SEM), this approach has two major advantages: (1) The resin-embedded sample is conserved, albeit in a sliced-up version. It can be stained in different ways and imaged with different resolutions. (2) As the sections can be post-stained, it is not necessary to use samples strongly block-stained with heavy metals to introduce contrast for SEM imaging or render the tissue blocks conductive. This makes the method applicable to a wide variety of materials and biological questions. Particularly prefixed materials e.g., from biopsy banks and pathology labs, can directly be embedded and reconstructed in 3D.

This protocol targets specific cells in tissue for imaging at nanoscale resolution using a scanning electron microscope (SEM). Large numbers of serial sections from resin-embedded biological material are first imaged in a light microscope to identify the target and then in a hierarchical manner in the SEM.

Proyección de imagen multimodal jerárquica de secciones seriadas para encontrar dianas celulares específicas dentro de grandes volúmenes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Análisis cuantitativo de la autofagia mediante microscopía de fluorescencia avanzada 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Biología

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualización del retículo endoplasmático subdominios en células cultivadas

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Visualización de estructuras sinápticas de la retina en 3D con microscopía electrónica volumétrica

Preparation of Retinal Samples for Volume Electron Microscopy

Volume electron microscopy (Volume EM) has emerged as a powerful tool for visualizing the 3D structure of cells and tissues with nanometer-level precision. Within the retina, various types of neurons establish synaptic connections in the inner and outer plexiform layers. While conventional EM techniques have yielded valuable insights into retinal subcellular organelles, their limitation lies in providing 2D image data, which can hinder accurate measurements. For instance, quantifying the size of three distinct synaptic vesicle pools, crucial for synaptic transmission, is challenging in 2D. Volume EM offers a solution by providing large-scale, high-resolution 3D data. It is worth noting that sample preparation is a critical step in Volume EM, significantly impacting image clarity and contrast. In this context, we outline a sample preparation protocol for the 3D reconstruction of photoreceptor axon terminals in the retina. This protocol includes three key steps: retina dissection and fixation, sample embedding processes, and selection of the area of interest.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Estudios de neurociencia de la retina con microscopía electrónica de volumen

This protocol describes the detailed steps for preparing retinal samples for volume electron microscopy, focusing on the structural features of retinal photoreceptor terminals.

Preparación de muestras de retina para microscopía electrónica volumétrica

Volume electron microscopy (Volume EM) has emerged as a powerful tool for visualizing the 3D structure of cells and tissues with nanometer-level ...

Neurociencias

<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo optimizado para la preparación de muestras de organoides de retina para TEM

Preparing Retinal Organoid Samples for Transmission Electron Microscopy

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) under specific conditions. Synapse development and maturation in ROs have been studied immunocytochemically and functionally. However, the direct evidence of the synaptic contact ultrastructure is limited, containing both special ribbon synapses and conventional chemical synapses. Transmission electron microscopy (TEM) is characterized by high resolution and a respectable history elucidating retinal development and synapse maturation in humans and various species. It is a powerful tool to explore synaptic structure in ROs and is widely used in the research field of ROs. Therefore, to better explore the structure of RO synaptic contacts at the nanoscale and obtain high-quality microscopic evidence, we developed a simple and repeatable method of RO TEM sample preparation. This paper describes the protocol, reagents used, and detailed steps, including RO fixation preparation, post fixation, embedding, and visualization.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Análisis de la ultraestructura sináptica en organoides retinales maduros utilizando TEM

This protocol provides an optimized and elaborate preparation procedure for retinal organoid samples for transmission electron microscopy. It is suitable for applications that involve the analysis of synapses in mature retinal organoids.

Preparación de muestras de organoides de retina para microscopía electrónica de transmisión

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem ...

Microscopía Episcopal de Alta Resolución (HREM) - Protocolos simples y robustos para procesar y visualizar materiales orgánicos

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De alta resolución de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imágenes

Adquisición rápida de imágenes en 3D de alta resolución Usando Episcópico Microscopía

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Análisis cuantitativo de la autofagia mediante microscopía de fluorescencia avanzada 3D

Visualización del retículo endoplasmático subdominios en células cultivadas

Preparación de muestras de retina para microscopía electrónica volumétrica

Preparación de muestras de retina para microscopía electrónica volumétrica

Preparación de muestras de retina para microscopía electrónica volumétrica

Preparación de muestras de organoides de retina para microscopía electrónica de transmisión