Name: application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices
Uploaded: 2017-07-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
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ホワイトホール財団の資金援助に感謝します。貴重なコメントをいただいたSamuel T. Kissinger氏に感謝します。

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	<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li><li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+liposome+preparation+for+imaging+and+patch-clamp+electrophysiology.">Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo.">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).</li><li>Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MATLAB-based+automated+patch-clamp+system+for+awake+behaving+mice.">MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice.</a> J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+operation+of+the+autopatcher+for+automated+intracellular+neural+recording+in+vivo.">Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo.</a> Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+autopatching+with+automated+pipette+and+cell+detection+in+vitro.">Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro.</a> J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).</li><li>Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computer-assisted+multi-electrode+patch-clamp+system.">A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system.</a> J Vis Exp. (80), e50630 (2013).</li><li>Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+cell+patch+clamp+recording+performed+on+a+planar+glass+chip.">Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip.</a> Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller.">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. (20), (2008).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li><li>Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACQ4:+an+open-source+software+platform+for+data+acquisition+and+analysis+in+neurophysiology+research.">ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research.</a> Front Neuroinform. 8 (3), (2014).</li><li>Kolb, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning+patch-clamp+pipettes+for+immediate+reuse.">Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li></ol>

米国特許出願第15 / 353,719号（非特許文献2）は、2016年11月16日に出願された非暫定的特許出願である「バイロの自動イメージ誘導パッチクランプ電気生理学のためのシステムおよび方法」（Ref。番号：PRF 67270-02。

ここでは、インビトロで自動画像ガイドパッチクランプ記録のための方法を説明する。このプロセスの主要なステップを以下に要約します。まず、コンピュータビジョンを使用して、顕微鏡で取得した一連の画像を使用してピペットチップを自動的に認識させます。この情報は、次に、顕微鏡とマニピュレータ座標系との間の座標変換関数を計算するために使用される。コンピュータビジョンは、蛍光標識された細胞を自動的に検出し、それらの座標を同定するために使用される。これらのステップは、オープンソースのPythonプログラミング言語、PyQT、およびOpenCVライブラリを使用したピペットターゲティングと自動パッチ適用アルゴリズムと統合されています。 既存のインビトロパッチクランプ法と比較して、このシステムはいくつかの領域において顕著な改善を行う。人間の介入を最小限に抑えます。このシステムは、パッチクランプ実験のほとんどのステップを自動化し、req人間の介入のための欲求。低/高倍率顕微鏡レンズの切り替えを含む、残りの手動ステップの一部は、追加の電動ハードウェアを使用して自動化することができます。 パッチクランプ法はスループットを向上させます。このシステムを使用したパッチクランプ実験は、試行ごとに高い成功率と短い時間を達成し、全体のスループットを大幅に向上させました。蛍光細胞検出およびピペットチップ検出のコンピュータビジョンアルゴリズムは非常に堅牢であり、エラー率は非常に低かった。ピペットチップ検出の平均誤差は1.6μmであり、蛍光細胞検出の偽陽性率は4.9％±2.25％であった。従来の手動パッチと自動パッチの詳細な比較が行われました6 。 実験の詳細な文書化が可能です。各試行のパッチログを保存し、 事後分析することができます。そのような詳細な以前のマニュアルによるパッチ適用では利用できませんでした。これにより、独自の実験条件、細胞型、種およびスライス調製におけるパッチ試験の系統的分析が可能になる。 この方法は、標準のインビトロパッチクランプ装置との互換性を示す。この原稿で示されているように、私たちのシステムは、既存のインビトロパッチクランプリグを増強し、自動パッチ適用の能力を与えるように設計されています。平面パッチのアプローチとは異なり、このシステムは、手作業によるパッチクランプを行っているラボで、機器を最小限のコストで変換するのに適しています。同時に、同じシステムを使用して手動または半自動的にパッチを適用するオプションがあります。 上記のシステムの適応性のために、ハードウェアの接続とソフトウェアの構成は、システムを初めてセットアップするときに実験者が必要とします。問題が生じる可能性があります特定のハードウェアを制御するための不適切なポート割り当てと不適切なドライバライブラリから発生します。トラブルシューティングを行う場合は、手順1.2〜1.4を参照してください。 既存のシステムの部分的自動化と比較して、このシステムは、従来の急性脳スライス（および他のインビトロ調製物）のインビトロパッチクランプにおいて最大レベルの自動化を実現する。これは図7に示すように 、11パッチにセル検出からピペット校正に、すべてのステップについても同様です。唯一のボトルネックは、パッチピペットを塗りつぶし、変更する手作業のプロセスです。パッチピペットの再使用における最近の進展は、この問題を潜在的に解決する可能性があります12 。スライス準備の質に加えて、失敗した試行の最も一般的な理由は、マニピュレータの機械的誤差とチャンバ内のスライスの動きに起因します。これらの制限は、現在のシステム。この問題を説明するために、閉ループのリアルタイムの検出およびピペットの動きの制御を実施する努力がなされている。 将来の発展のために、我々は現在の蛍光細胞検出能力をDIC光学系の一般的な細胞検出に拡張することに興味がある。

パッチクランプ技術は、興奮性膜のイオンチャンネルを研究するために1970年代にNeherとSakmannによって最初に開発されました1 。それ以来、パッチクランプは、ニューロン、心筋細胞、アフリカツメガエル卵母細胞、人工リポソームを含む多くの異なる細胞タイプにおいて、細胞、シナプスおよび回路レベル（ インビトロおよびインビボの両方） で多くの異なる被験者の研究に適用されている2 。このプロセスは、細胞の正確な同定および標的化、細胞に近接してパッチピペットを動かすための複雑なマイクロマニピュレーター制御、適切な時間に陽圧および陰圧をピペットに適用して緊密なギガシールパッチを確立すること、セル全体のパッチ構成を確立するためのブレークインなどがあります。パッチクランプは、通常は手作業で行われ、マスタリングには大規模なトレーニングが必要です。パッチを経験した研究者であってもクランプ、成功率は比較的低いです。より最近では、パッチクランプ実験を自動化するためのいくつかの試みがなされている。自動化を達成するために2つの主要な戦略が進化しました。標準的なパッチクランプ装置を増強して、パッチ適用プロセスの自動制御と、新しい装置と技術の設計を根本から行いました。前者の戦略は、既存のハードウェアに適応可能であり、 インビボブラインドパッチクランプ3、4、5、急性脳切片のin vitroでのパッチクランプ、器官型スライス培養物を含め、パッチクランプ種々の用途に使用することができ、培養解離ニューロン6 。これは、複数のマイクロマニピュレータを同時に使用することにより、複雑なローカル回路の照会を可能にします7 。平面パッチ法は、新しい開発戦略の一例であり、高スループットの同時p薬物スクリーニング目的のための懸濁液中の細胞のクランプクランプ8 。しかしながら、平面パッチ法は、全ての細胞型、特に、長いプロセスを有するニューロンまたは広範な接続を含むインタクトな回路には適用できない。これは、従来のパッチクランプ技術の重要な利点である、神経系の複雑な回路をマッピングすることへのその適用を制限する。 我々は、標準的なパッチクランプハードウェアを増強することにより、手動パッチクランププロセスをインビトロで自動化するシステムを開発しました。当社のシステムであるオートパックャーIGは、自動ピペット校正、蛍光細胞標的同定、ピペット移動の自動制御、自動全細胞パッチ、およびデータロギングを提供します。このシステムは、異なる深さの脳スライスの複数の画像を自動的に獲得することができる。コンピュータビジョンを使ってそれらを分析する。蛍光標識された細胞の座標を含む情報を抽出する。この情報は、目的の細胞を標的とし、自動的にそれをパッチするために使用される。このソフトウェアは、いくつかのオープンソースライブラリを使用して、無料のオープンソースプログラミング言語であるPythonで書かれています。これにより、他の研究者へのアクセシビリティが確保され、電気生理学実験の再現性と厳しさが向上します。このシステムはモジュラー設計を採用しているため、追加のハードウェアをここで示した現在のシステムと容易にインターフェースすることができます。

<table><tbody><tr><td>CCD Camera</td><td>QImaging</td><td>Rolera Bolt</td><td></td></tr><tr><td>Electrophysiology rig</td><td>Scientifica</td><td>SliceScope Pro 2000</td><td>Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is &amp;ldquo;Linlab2&amp;rdquo;.</td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td>computer-controlled microelectrode amplifier</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td>Axon Digidata 1550</td><td></td></tr><tr><td>LED light source</td><td>Cool LED</td><td>pE-100</td><td>488 nm wavelength</td></tr><tr><td>Data acquisition board</td><td>Measurement Computing</td><td>USB1208-FS</td><td>Secondary DAQ.&lt;br/&gt; See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf</td></tr><tr><td>Solenoid valves</td><td>The Lee Co.</td><td>LHDA0531115H</td><td></td></tr><tr><td>Air pump</td><td>Virtual industry</td><td>VMP1625MX-12-90-CH</td><td></td></tr><tr><td>Air pressure sensor</td><td>Freescale semiconductor</td><td>MPXV7025G</td><td></td></tr><tr><td>Slice hold-down</td><td>Warner instruments</td><td>64-1415 (SHD-40/2)</td><td>Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm</td></tr><tr><td>Python</td><td>Anaconda</td><td>version 2.7 (32-bit for windows)</td><td>https://www.continuum.io/downloads</td></tr><tr><td>Screw Terminals</td><td>Sparkfun</td><td>PRT - 08084</td><td>Screw Terminals 3.5 mm Pitch (2-Pin)</td></tr><tr><td>(2-Pin)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Channel MOSFET 60 V 30 A</td><td>Sparkfun</td><td>COM - 10213</td><td></td></tr><tr><td>DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-07937</td><td></td></tr><tr><td>LED - Basic Red 5 mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09590</td><td></td></tr><tr><td>LED - Basic Green 5mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09592</td><td></td></tr><tr><td>DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-12748</td><td></td></tr><tr><td>Wall Adapter Power Supply - 12 V DC 600 mA</td><td>Sparkfun</td><td>TOL-09442</td><td></td></tr><tr><td>Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-11367</td><td></td></tr><tr><td>Locking Male x Female x Female Stopcock</td><td>ARK-PLAS</td><td>RCX10-GP0</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings</td><td>Fisher scientific</td><td>14-171-129</td><td>Outer Diameter: 1/8 in.&lt;br/&gt; Inner Diameter: 1/16 in.</td></tr><tr><td>BNC male to BNC male coaxial cable</td><td>Belkin Components</td><td>F3K101-06-E</td><td></td></tr><tr><td>560 Ohm Resistor (5% tolerance)</td><td>Radioshack</td><td>2711116</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>General Valve</td><td>Picospritzer II</td><td></td></tr></tbody></table>

application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices

全細胞パッチクランプは、単細胞の電気的特性を測定する金標準的な方法です。しかし、 インビトロパッチクランプは、その複雑さおよびユーザの操作および制御への高い依存性のために、依然として困難で低スループットの技術である。この原稿は、急性脳スライスにおけるin vitro全細胞パッチクランプ実験のための画像ガイド自動パッチクランプシステムを実証しています。我々のシステムは、蛍光標識された細胞を検出し、マイクロマニピュレーターおよび内部のピペット圧力制御を用いた完全自動パッチングのためにそれらを標的にするコンピュータビジョンベースのアルゴリズムを実施する。プロセス全体は高度に自動化されており、人間の介入に対する必要条件は最小限に抑えられています。電気抵抗および内部ピペット圧力を含むリアルタイムの実験情報は、将来の分析および異なる細胞タイプへの最適化のために電子的に文書化されている。我々のシステムは、急性のbraiの文脈で記述されているn個のスライスレコーディングのために、解離ニューロン、器官型スライス培養物、および他の非ニューロン細胞タイプの自動画像誘導パッチクランプにも適用することができる。

<html>我々のシステムは、急性脳スライス、ニューロンに分化したマウス誘発多能性幹細胞（iPSC）、および関心のあるチャネルを人工的に発現するHEK293細胞に細胞をパッチする能力に関して試験されている。 図3は、視覚野における蛍光標識層5ピラミッドニューロンを標的とするThy1-ChR2-YFPトランスジェニックマウス（B6.Cg-Tg（Thy1-COP4 / EYFP）18Gfng / J）を用いた実験を示す。標的細胞は、自動的に同定された緑色蛍光陽性細胞の1つであった（ 図3b ）。 図3aは、パッチされたニューロンの差分干渉コントラスト（DIC）画像である。全細胞構成は、ステップ2.5〜2.6での自動パッチ適用プロトコルによって達成され、ステップ電流注入誘発活動電位によって検証された（ 図3c ） 1 &quot;&gt;追加の「コマンドシーケンス」機能を実証するために、我々は、細胞にパッチを当てながら脳スライス上の3つの位置に500mMのKClを200ms送達した（ 図4 ）。 &quot;Memory1&quot;のGUIに保存された座標は、 &quot;Unit1&quot;の下の &quot;Command Sequence&quot; GUIにロードされました。これはKCl-左の列にコマンドを設定して、+ 5VのTTL信号を500ms、続いて0Vを10秒間（ 図4a ）、セカンダリDAQボードのポートAチャネル0から、 図4cは、パッチされた細胞が通常のスパイキングニューロンであることを示している。薬物適用ピペット（ユニット1）は、3つの選択された位置を横断した。（ 図4b ）、電圧クランプ下で各アプリケーションごとに10秒を記録しました（ 図4d ）。 図4dのトレースの色は、 図4bの境界色に対応する。 KClが細胞に吹き出されると、大きな内向きの電流が観察され、KClが拡散するにつれて徐々に減少した。赤色蛍光色素をKCl溶液に加えて、薬物送達の空間分布を示し、DICとエピ蛍光造影とを組み合わせて画像化した。この実験では、TTL信号によるマニピュレータ/顕微鏡の動きと外部ハードウェアを制御するためのシステムの容易さと柔軟性が示されました。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig1.jpg" /> 図1.圧力制御ユニット。 A：バルブを接続するプリント回路基板（PCB）、圧力センサー、エアーポンプなどがあります。左側には、プロトコルに記載されている出力のラベル付け位置を示すPCBの詳細が表示されます。右側には、PCBとエアポンプ、USBポート、および配管の接続が示されています。 B： PCBの回路マップ。 <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56010/56010fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig2.jpg" /> 図2.オートパッチャーのGUIプロトコルに記載されているボタンは、赤い四角で示され、番号が付けられています。 1：キャリブレーションの開始、2：キャリブレーションの保存、3：キャリブレーションのロード、4：セカンダリキャリブレーション、5：セルの検出、6：パッチコントロール、7：ターゲットセル座標の移動、8：パッチ。 <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56010/56010fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください</a>。 <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig3.jpg" /> 図3.パッチを当てたChR2-YFP陽性細胞の例。 A： DIC光学系で倍率40倍。 B：パネルAの同じ細胞のエピ蛍光画像（488nmでのLED照明）。 C：一連の過分極および脱分極段階電流注入中のパッチされた細胞からの電流クランプ記録。 <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56010/56010fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig4.jpg" /> 図4.自動薬物送達実験の実施 A： 「Command Sequence」GUIにロードされた選択された場所。左の列には座標のリスト、および右の列は、各位置のTTL信号の形式でのコマンドのリストを示す。 B： 3つの選択された場所に対応する薬物適用実験中のスクリーンショット。ユニット1はKCl含有ピペットであり、ユニット2はパッチピペットであった。 KCl溶液を赤色蛍光色素と混合して可視化した。画像はDICと蛍光イメージングを組み合わせて得た。 C：通常のスパイクニューロンを示す電流注入をステップする。 D： 3ヶ所の500mM KCl溶液の局所適用による電圧クランプ記録のトレース。 KCl適用がパッチされた細胞の近くにあったときに、内向き電流を伴う赤いトレースが試験から記録された。赤い矢印は、KCl適用のタイミングを示します。 <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56010/56010fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <table border="1"fo：keep-together.within-page = &quot;1&quot; fo：keep-with-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> PCB上のアウトレット </td><td> DAQボード上のポート名 </td><td> DAQボード上のポート番号 </td><td> リマーク </td></tr><tr><td> DOUT V1 </td><td>ポートAチャネル1 </td><td> 22 </td><td>コントロールバルブ1 </td></tr><tr><td> DOUT V2 </td><td>ポートAチャネル2 </td><td> 23 </td><td>コントロールバルブ2 </td></tr><tr><td> DOUT P </td><td>ポートAチャネル3 </td><td> 24 </td><td>コントロールエアポンプ</td></tr><tr><td> Gr </td><td>接地</td><td> 29 </td><td>接地</td></tr></tbody></table> 表1.プリント回路基板（PCB）と二次データ集録（DAQ）ボードの接続構成。このテーブルを使用して、PCB出力（最初の列は左から）をDAQボードのポート（左から2番目の列）。セカンダリDAQのポート名と番号はシングルエンドモードを指します。 <img alt="表2" src="/files/ftp_upload/56010/56010table2.jpg" /> 表2圧力制御ユニットからピペットホルダーへのチューブ接続。接続ごとに、灰色のボックスで強調表示された対応するポートを軟質チューブ（ 表の表を参照）を使用して接続します。

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Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

このプロトコルは、標準的なインビトロ電気生理学装置用に最近開発されたシステムを用いて自動画像ガイドパッチクランプ実験を行う方法を説明している。

脳スライスにおけるニューロン研究のための自動画像誘導パッチクランプの応用

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

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Universidad San Sebastian

Research

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Neuroscience

11.4K ビュー.  Purdue University. このプロトコルは、標準的なインビトロ電気生理学装置用に最近開発されたシステムを用いて自動画像ガイドパッチクランプ実験を行う方法を説明している。 

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Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent neuropsychiatric disorder that stems from the biophysical and cellular actions of nicotine on nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) throughout the central nervous system. Understanding the various nAChR subtypes that exist in brain areas relevant to nicotine addiction is a major priority.
Experiments that employ electrophysiology techniques such as whole-cell patch clamp or two-electrode voltage clamp recordings are useful for pharmacological characterization of nAChRs of interest. Cells expressing nAChRs, such as mammalian tissue culture cells or Xenopus laevis oocytes, are physically isolated and are therefore easily studied using the tools of modern pharmacology. Much progress has been made using these techniques, particularly when the target receptor was already known and ectopic expression was easily achieved. Often, however, it is necessary to study nAChRs in their native environment: in neurons within brain slices acutely harvested from laboratory mice or rats. For example, mice expressing "hypersensitive" nAChR subunits such as &alpha;4 L9&prime;A mice 1 and &alpha;6 L9&prime;S mice 2, allow for unambiguous identification of neurons based on their functional expression of a specific nAChR subunit. Although whole-cell patch clamp recordings from neurons in brain slices is routinely done by the skilled electrophysiologist, it is challenging to locally apply drugs such as acetylcholine or nicotine to the recorded cell within a brain slice. Dilution of drugs into the superfusate (bath application) is not rapidly reversible, and U-tube systems are not easily adapted to work with brain slices.
In this paper, we describe a method for rapidly applying nAChR-activating drugs to neurons recorded in adult mouse brain slices. Standard whole-cell recordings are made from neurons in slices, and a second micropipette filled with a drug of interest is maneuvered into position near the recorded cell. An injection of pressurized air or inert nitrogen into the drug-filled pipette causes a small amount of drug solution to be ejected from the pipette onto the recorded cell. Using this method, nAChR-mediated currents are able to be resolved with millisecond accuracy. Drug application times can easily be varied, and the drug-filled pipette can be retracted and replaced with a new pipette, allowing for concentration-response curves to be created for a single neuron. Although described in the context of nAChR neurobiology, this technique should be useful for studying many types of ligand-gated ion channels or receptors in neurons from brain slices.

In this paper, we describe a useful method to study ligand-gated ion channel function in neurons of acutely isolated brain slices. This method involves the use of a drug-filled micropipette for local application of drugs to neurons recorded using standard patch clamp techniques.

マウスの脳スライスにおけるニコチン性アセチルコリン受容体機能を研究するための薬物のローカルアプリケーション

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

神経科学

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

急性脳スライスにおけるニューロンマイクロ回路の電気生理学的および形態学的特徴は、ペアパッチクランプ記録を使用して、

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

最適化されたNを使用して急性脳スライスの準備-メチル-D-glucamine 保護回復法

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze motor-learning induced plasticity, we trained rats using an accelerated rotor rod task. Rats performed the task 10 times at 30-s intervals for 1 or 2 days. Performance was significantly improved on the training days compared to the first trial. We then prepared acute brain slices of the primary motor cortex (M1) in untrained and trained rats. Current-clamp analysis showed dynamic changes in resting membrane potential, spike threshold, afterhyperpolarization, and membrane resistance in layer II/III pyramidal neurons. Current injection induced many more spikes in 2-day trained rats than in untrained controls.
To analyze contextual-learning induced plasticity, we trained rats using an inhibitory avoidance (IA) task. After experiencing foot-shock in the dark side of a box, the rats learned to avoid it, staying in the lighted side. We prepared acute hippocampal slices from untrained, IA-trained, unpaired, and walk-through rats. Voltage-clamp analysis was used to sequentially record miniature excitatory and inhibitory postsynaptic currents (mEPSCs and mIPSCs) from the same CA1 neuron. We found different mean mEPSC and mIPSC amplitudes in each CA1 neuron, suggesting that each neuron had different postsynaptic strengths at its excitatory and inhibitory synapses. Moreover, compared with untrained controls, IA-trained rats had higher mEPSC and mIPSC amplitudes, with broad diversity. These results suggested that contextual learning creates postsynaptic diversity in both excitatory and inhibitory synapses at each CA1 neuron.
AMPA or GABAA receptors seemed to mediate the postsynaptic currents, since bath treatment with CNQX or bicuculline blocked the mEPSC or mIPSC events, respectively. This technique can be used to study different types of learning in other regions, such as the sensory cortex and amygdala.

The slice patch clamp technique is an effective method for analyzing learning-induced changes in the intrinsic properties and plasticity of excitatory or inhibitory synapses.

スライス パッチ ・ クランプの技術学習によって誘発される可塑性を分析するため

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in the anteroventral periventricular nucleus and rostral periventricular nucleus, as well as the arcuate nucleus of the hypothalamus, project to gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) neurons, among other cells. Previous studies have demonstrated that kisspeptin signaling occurs through the Kiss1 receptor (Kiss1r), ultimately exciting GnRH neuron activity. In humans and experimental animal models, kisspeptins are sufficient for inducing GnRH secretion and, consequently, luteinizing hormone (LH) and follicle stimulant hormone (FSH) release. Since kisspeptins play an essential role in reproductive functions, researchers are working to assess how the intrinsic activity of hypothalamic kisspeptin neurons contributes to reproduction-related actions and identify the primary neurotransmitters/neuromodulators capable of changing these properties. The whole-cell patch-clamp technique has become a valuable tool for investigating kisspeptin neuron activity in rodent cells. This experimental technique allows researchers to record and measure spontaneous excitatory and inhibitory ionic currents, resting membrane potential, action potential firing, and other electrophysiological properties of cell membranes. In the present study, crucial aspects of the whole-cell patch-clamp technique, known as electrophysiological measurements that define hypothalamic kisspeptin neurons, and a discussion of relevant issues about the technique, are reviewed.

Here, we present a protocol to perform a whole-cell patch-clamp on brain slices containing kisspeptin neurons, the primary modulator of gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) cells. By adding knowledge about kisspeptin neuron activity, this electrophysiological tool has served as the basis for significant advancements in the neuroendocrinology field over the last 20 years.

全細胞パッチクランプ記録の標的としての視床下部キスペプチンニューロン

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...

Establishing a Whole-Cell Voltage-Clamp Configuration for Electrophysiological Recordings in Brain Slices

Source: Sunstrum, J. K., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/59461">Evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates positioning a fine-pointed pipette near brain slices, forming a seal with a neuronal cell. Suction breaks the cell membrane, thereby creating a whole-cell patch clamp that enables current measurements for electrophysiology experiments.

脳スライスにおける電気生理学的記録のための全細胞電圧クランプ構成の確立

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Automated Image-Guided Patch Clamp Technique for Studying Neurons in Brain Slices

Source: Wu, Q., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/56010">Application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices.</a> J. Vis. Exp. (2017).
In this video, brain slices are immobilized in a recording chamber, and cells of interest are located and focused on using a computer-controlled microscope. The automated image processing system then precisely positions a patch pipette to seal the cell membrane and monitor electrical signals.

脳スライス中のニューロンを研究するための自動画像誘導パッチクランプ技術

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. System Setup

	Construct ...

Paired Patch Clamp Recording of the Neuronal Connections in Acute Brain Slices

Source: Qi, G., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/52358">Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the procedure to map synaptic connections by securing a brain slice, positioning pipettes to achieve whole-cell configurations, and stimulating presynaptic neurons to record postsynaptic responses, thereby elucidating neuronal connectivity.

急性脳切片におけるニューロン接続のペアパッチクランプ記録

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Paired Patch-Clamp ...

Simultaneous Optical and Electrophysiological Monitoring of Neuronal Cells in Brain Slices

To place the multi-channel probe in the ex vivo brain tissue slide, perfuse bubbled experimental ACSF at three to six milliliters per minute, and transfer the brain slice containing the area of interest onto the mesh grid in the microscope perfusion chamber. Anchor the brain slice with a platinum harp. Rotate the mesh grid so that the line of electrode contacts on the distal end of the multichannel probe is approximately perpendicular to the PL surface.
Under broad-field illumination and fine control of the micromanipulator, lower the multichannel probe toward the surface of the slice. Engage the appropriate filter cube for visualization of the fluorescent reporter protein expressed in axon terminals of cortical afferents.
If necessary, rotate the slice to more precisely align the probe with the PL surface. Position the probe just above the plane of the slice, 200 micrometers short of the final target position along the x-axis, leaving at least one channel outside of the area of tissue being recorded. Slowly, insert the probe into the slice along its longitudinal axis.
To minimize damage to the tissue, only advance the probe to the extent that the sharp tips are just visible below the tissue surface. Switch experimental ACSF source to bagged control solution, and identify the fluorescently labeled cell for targeted patch-clamp recording. Restrict the aperture to the smallest diameter, and engage the high-power water-immersion objective, taking care to avoid contact between the multichannel probe and objective lens. Bring the tissue into focus.
Center the light over an area of tissue adjacent to, but not overlapping the multi-channel probe. Engage the appropriate filter set to allow imaging of cells expressing the Cre-dependent fluorescent marker. Raise the objective lens to create ample space for lowering a patch pipette.
Load a patch pipette with internal solution and mounted on the electrode holder. Use a one-milliliter syringe to apply positive pressure corresponding to approximately 0.1 milliliter air. Lower the patch pipette into the solution, bringing the tip into focus under visual guidance, and obtain whole-cell recording from the targeted cell.

脳スライスにおけるニューロン研究のための自動画像誘導パッチクランプの応用

要約

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この動画の章

マウスの脳スライスにおけるニコチン性アセチルコリン受容体機能を研究するための薬物のローカルアプリケーション

急性脳スライスにおけるニューロンマイクロ回路の電気生理学的および形態学的特徴は、ペアパッチクランプ記録を使用して、

最適化されたNを使用して急性脳スライスの準備-メチル-D-glucamine 保護回復法

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

スライスパッチ・クランプの技術学習によって誘発される可塑性を分析するため

全細胞パッチクランプ記録の標的としての視床下部キスペプチンニューロン

脳スライスにおける電気生理学的記録のための全細胞電圧クランプ構成の確立

脳スライス中のニューロンを研究するための自動画像誘導パッチクランプ技術

急性脳切片におけるニューロン接続のペアパッチクランプ記録

脳切片中の神経細胞の光学的および電気生理学的同時モニタリング

脳スライスにおけるニューロン研究のための自動画像誘導パッチクランプの応用

要約

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マウスの脳スライスにおけるニコチン性アセチルコリン受容体機能を研究するための薬物のローカルアプリケーション

急性脳スライスにおけるニューロンマイクロ回路の電気生理学的および形態学的特徴は、ペアパッチクランプ記録を使用して、

最適化されたNを使用して急性脳スライスの準備-メチル-D-glucamine 保護回復法

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

スライス パッチ ・ クランプの技術学習によって誘発される可塑性を分析するため

全細胞パッチクランプ記録の標的としての視床下部キスペプチンニューロン

脳スライスにおける電気生理学的記録のための全細胞電圧クランプ構成の確立

脳スライス中のニューロンを研究するための自動画像誘導パッチクランプ技術

急性脳切片におけるニューロン接続のペアパッチクランプ記録

脳切片中の神経細胞の光学的および電気生理学的同時モニタリング

スライスパッチ・クランプの技術学習によって誘発される可塑性を分析するため