この研究は、サウスウエスタン大学のスタートアップ資金（SK）によってサポートされていました。

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著者はいずれも、競合する利益や利害を持っていません。

このプロトコルは、脳切片におけるニューロンの全細胞パッチクランプ実験を行うための基本的な手順を説明します。しかし、この技術の複雑さ、可能性と感度は完全にこの資料に記載することはできません。ここでは、最も基本的な手順を描写し、成功と厳格なホールセル記録を達成するために制御されなければならない重要なパラメータを強調しようとしています。さらに理論的な学習のために、多くの本や記事は、脳スライス3,21-24にし、細胞生存率を高めるために25から27を使用したソリューションを絞り込むことができます方法の両方の全細胞パッチクランプ記録に公開されています。日常的に適切な録音を行うためには、集中的な練習を通じて技術的なスキルの向上が必要です。それにもかかわらず、前述の手順の適切なアプリケーションと、細胞がシナプスの機能および固有excitabiの変更に関する重要な情報を提供し、時間死後パッチを適用することができますリティ。 一般的には、慎重にACSFと内部マイクロピペット・ソリューションの両方を準備することの重要性に加えて、脳の解剖からの各ステップは、成功した全細胞構成を実現し、スライスし、厳格かつ公正なデータを得ることは集中的な練習が必要です。主に、健康な脳スライスを生成することが重要です。簡潔には、脳（理想的には&lt;45秒）、低温のメンテナンスを迅速に解剖 - スライスしながら（0~2℃）で、適切なスライスのソリューションはすべて、細胞の健康を確保する上で重要な役割を果たしています。スライスのソリューションは、研究所と調査された細胞型および/または脳領域に応じ間で異なる可能性があることを言及することは注目すべきです。側坐核または背側線条体をスライスするとき、我々の研究室等は、スクロースベースのソリューション34、高マグネシウム2+ 28-33が 、しかしながら、他の方法も使用することができる興奮毒性プロセスを最小限にするためにスライス液にキヌレン酸を使用します</SUP&gt; /低のCa 2+ソリューション35、 など 。これらはほんの一例であり、（年齢によるものなど、）興奮毒性プロセスに脳や脳の領域の感度に応じて調整することができます。ソリューションおよび細胞生存率の詳細については、25-27を参照してください。それは脳脊髄液を模倣し、スライス中に発生する可能性興奮毒性プロセスな限り最小限に抑えるように最終的には、陰イオン、陽イオン、およびスライスのソリューションを構成する他の薬剤（ 例えば 、アスコルビン酸、グルタミン酸受容体拮抗薬）の濃度が決定されます。この記事で紹介したプロトコルは、側坐核または脳スライスにおける背側線条体におけるMSNsから録音するときに日常著者の以前の研究28-31で使用した標準的な解決策について説明します。また、ACSFと内部マイクロピペットソリューションの両方のための浸透圧を適切に調整するには、全細胞のconfの成功シール形​​成と維持のために重要ですiguration。イントラピペット溶液に細胞外溶液の濃度勾配を作成するには、ACSFの浸透圧は、内部のマイクロピペットのソリューションよりも高くする必要があります。理想的には、差が10から30ミリオスモルの範囲とすることができます。 成功した全細胞構成を達成することは、効率的な記録を行うための別の重要なステップです。ピペットは、浴中に配置されると、まず、ピペットのキャパシタンスを調整することができます。自動設定は、通常、適切に設定されているが、適切に行われていない場合は、これらが細胞に損傷を与えることができるように注意して電池容量の高速と低速の調整を使用することをお勧めします。第二に、膜を破壊することが必要である簡単な膜吸引は、膜の重要な開口部につながり、それによって細胞内および細胞内マイクロピペットの環境との間の良好なコミュニケーションが可能になります。これは、R sが記録を通して比較的安定した状態で維持されるようになります。セシウムベースのマイクロピペットのソリューションを使用している場合は、膜静止電位がすぐに全細胞構成の確立時に評価されるべきである（ステップ5.8を参照してください）​​。実際、細胞内でのCs +の拡散は、膜静止電位の損失を引き起こします。適切な静止電位を決定するために、液体接合部電位は、20を評価しなければなりません。しかし、実験者は（ステップ5.8の後）は、膜を破壊した後に観察された静止電位を報告し、液間電位を調整しないこともできます。すべての場合において、それは記事の方法の項に記載しなければなりません。全細胞構成の確立時に、C pを得ることができ、細胞の健康および/ ​​または細胞のタイプを評価するための間接的なパラメータとして使用することができます。第三に、レコーディングが始まったとき、他のパラメータが厳密に監視する必要があります。神経細胞の興奮性を評価する際に制御しなければならない重要な要素は、温度、R SおよびR、Iです。 として上述したように、R iおよびC pは 、細胞の健康および/ ​​または細胞型を示すことができます。例えば、原形質膜は、絶縁体として作用し、一緒に膜キャパシタンスを構成する、（細胞内および細胞外液の別の組成物から得られた）電荷を分離します。キャパシタンスが高いほど、膜表面（ニューロン特異的）より大きい。これは、特定のニューロンタイプの展示C pのことは驚くべきことではないと R iは （数学的にC pに関連する）同じ範囲内にあります。 R Sは 、ピペットチップの大きさに直接関係するので、通常質または膜の開口部の大きさを示します。簡単に言えば、全細胞構成を確立する際に、細胞質は、マイクロピペット内の溶液と電気的に連続し、外部メディアから完全に分離さになります。 R S（又はR a）はカレン用の抵抗に由来しますtは細胞質にピペットから流れます。いくつかの記録条件（ 例えば 、電流クランプモードまたは電位依存性イオン電流の電圧クランプ記録）については、R sは適切に補償する必要があります（参考文献を参照してください。3,21-24または適切なR の補償のためのアンプのマニュアルガイド） 。 図4で説明したように、劇的に電気信号波形、 例えば 、EPSC振幅に影響を与えることができるように、R sが特に重要です。それにもかかわらず、R sが慎重に任意の観察された効果のオフライン解釈のために監視する必要があります。ケースでは、膜が、その場合のR の増加とバイアス研究中の電気信号の波形（ 図4B-D）マイクロピペットチップの目詰まりや膜の再閉鎖発生する可能性があり、適切に破裂されていません。記録しながら要約すると、多くの問題が発生することができ、それらは通常、三つのカテゴリーに分類さは、i）組織関連例えば 、不良による解剖、ACSFの浸透圧の調整不良、および低酸素に対する細胞の死亡率を増加させました。 ⅱ）機器関連、 例えば 、ノイズや接地の問題、温度制御、スライスおよびマイクロピペットの位置など 。そしてiii）データの解釈、 例えば 、観察された変化ではなく、実験の結果より、図3＆4）を参照して 、R I、R、S、温度（電気波形を変化させるパラメータの変化などのデータをバイアス望ましくない実験的なアーティファクトの結果であり得ます操作。 脳スライスにおける全細胞記録を経験依存可塑性を評価するための強力な技術であるが、このアプローチは、データの解釈を制限します。具体的には、全細胞記録技術の三つの重要な制限があることは、（i）特定のタンパク質（ 例えば 、イオンチャンネル）が区別できないの機能と発現レベルの変化; （ⅱ）このため、技術は膜全体（または大部分）を流れる電流を評価し、それが観察されるイオン電流や変更の正確な細胞内局在を提供していません。および（iii）全細胞構成の侵襲性を開発するために、または発現する細胞コンテンツの透析に、それによっていくつかの現象のために必要な細胞内分子機構の破壊をもたらします。透析を回避する1つの方法は、鋭い電極の録音または穿孔パッチ技術3,21,23を使用することです。後者に関しては、例えば、ナイスタチン等の造孔抗生物質分子は、ピペット溶液に添加することができます。これらの孔の形成は、細胞内のセカンドメッセンジャーメカニズムを中断することなく、電流の記録を可能にします。それにもかかわらず、ナノテクノロジーとナノ電極36の開発における最近の進歩は、ニューロンの録音を改善するための強力なツールを提供しています。神経科学におけるこのような技術の進歩はdevelopmenの下にまだありますトンとなりました、 すなわち 、私たちのリーチに低侵襲でパッチクランプおよび細胞内記録を実行する可能性を入れてそのまま細胞内環境を保ち、そして古典でアクセスこれまでにはなかったサブ細胞区画内のイオンチャネルの機能を調査していますパッチクランプ電極37。

パッチクランプ法、1970年代後半1,2に開発された電気生理学的技術は、生きている組織では、単一または複数のイオンチャネルの機能を研究するための主要なツールです。達成することができる別のパッチ構成の中で、全細胞パッチクランプ記録は、ニューロンの要部の電気的​​挙動の研究を可能にします。古典的には、この技術は、脳スライス、新たに解離ニューロンの、または細胞培養モデル3のいずれかでインビトロで行われます。脳スライス中のニューロン上で実行するとき、この手法にはいくつかの利点を提供します。具体的には、（i）ニューロンは、ある程度相対的に保存脳回路に記録され、そして細胞培養調製物と比較して、3生理学的に関連する環境を提供します。これは、急性pharmacologのいずれかのタイプによってトリガされた細胞および分子事象を早期に取り込む、あるいはリアルタイムでモニタリングすることができますiCalの操作- 生体内条件の古典用いて達成することができない時間分解能。視覚的に脳スライスに脳領域を識別するために、（ii）の機能は、両方の彼らは、蛍光マーカーを発現時に脳領域が研究のために、特定のニューロンのための高い地域の特異性3を可能にします。 （ⅲ）（細胞内記録のための鋭いマイクロピペットで膜に穴を開けるとは対照的に）形質膜4のかなりの部分を開放することにより、細胞の細胞内空間へのアクセスを。今度は、これは、内部​​液を構成する特定のイオンの含有量または濃度が非常に分子標的を変更するか、細胞のメカニズムが異なる条件下で研究することができることができます。例えば、全細胞構成、任意の特定の薬理学的薬剤（ 例えば 、アンタゴニスト）を確立時に1が記録マイクロピペット（パッチピペット）溶液は、直接細胞質内に拡散し、そのputatに作用しに追加できます隣接するセル内のターゲット関数を変更することなく、細胞内標的をアイブ。さらに、シャープなマイクロピペットの記録と比較して、パッチクランプ電極の先端の大きな開口部は低抵抗、あまり競合ノイズ、ひいてはセル4の内側へのより良い電気的アクセスを提供します。しかし、ピペットチップでの大きな開口部はセル透析、および研究5,6の下にある生物学的現象の発現に重要であり得る細胞内分子機構のそれによって損失につながる可能性があることに注意してください。この場合には、シャープ電極記録は、より適切であり得ます。録音のこのタイプは、それによって細胞内空間と内部ピペット溶液との間のイオン交換を最大限に防止する、全細胞記録のために使用されるものよりもはるかに小さい孔を有するマイクロピペットを必要とします。 7月10日の学習を含む（急性または慢性）経験のいずれかの形、乱用11,1の薬物への曝露2 等ストレス13,14は 、特定の脳領域における神経機能の様々な態様を変化させることができます。これらの変化は、多くの場合、（数時間から数日）を開発するために時間が必要であるため、具体的な経験を受けた動物からの脳スライスにおける全細胞記録は、研究者は、これらの変更を識別することができます。基本的に、（すべてではない）、ニューロンの機能に関与する成分（ 例えば 、リガンド活性化イオンチャネル、電位依存性イオンチャンネル、神経伝達物質トランスポーター）、それによって脳回路の活動および行動の多くは、経験によって変化させることができる（経験に依存可塑性）10,15-17。神経細胞レベルでは、脳の回路の活動は、シナプスの間に一定の相互作用（ 例えば 、グルタミン酸伝達）および固有細胞の興奮因子（ 例えば 、axosomato樹状イオンチャネルから出：;カリウム、K +、ナトリウム、Na +およびカルシウム、 の Ca 2+ ）。 wholを使用して、特定の条件の下で電子細胞は、パッチクランプ電気生理学的手法、シナプス対固有興奮性の変化から、具体的発信信号の変化を単離することができます。 ほとんどの場合、シナプスの興奮は、全細胞電圧クランプ技術を用いて評価され 、この記録モードは、αアミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4- isoxazolepropionic酸受容体（によって媒介される、 例えば [イオン電流の測定を可能にしますAMPA受容体）および神経原形質膜を介してN-メチル-D-アスパラギン酸受容体（NMDA受容体）]のセット電圧で膜電位を保持しています。ここでは、実験者は、セシウム（Cs +）を含有する内部マイクロピペットソリューション、K +チャネル（キー固有興奮要因）の幅広いブロッカーを使用します。全細胞構成の確立時に、細胞内空間内のCs +の拡散は、K +チャンネルを遮断し、それによって、比較的効率的なスペースでクランプと事前の両方を許可します他の測定上の本質的な興奮の要因の影響をベント。不規則な形の細胞（ 例えば 、ニューロン）、および18,19アーバ広大で複雑 ​​な樹状で、特にニューロンを記録するときにスペースクランプの問題は、 すなわち 、電圧クランプに難易全細胞は、発生します。体細胞電圧クランプ不十分コントロールニューロンの樹状突起における電圧ので、研究対象の樹状電気信号の様々な態様は、樹状距離依存的に歪んでいます。 （人工脳脊髄液、ACSF）細胞外溶液に溶解し、このようなピクロトキシン（ガンマ-アミノ酪酸、GABA受容体拮抗薬）またはキヌレン酸（グルタミン酸受容体の広いブロッカー）などの薬理学的なツールと組み合わせることで、この技術は、グルタミン酸の測定を可能にしますそれぞれ受容体とGABA A R媒介電流。 対照的に、本質的な興奮性は、通常、電流 - クランプ記録モードで評価されます。電圧クランプ記録とは対照的に、この記録モードは、神経細胞膜を通って流れるイオン電流により誘導される膜電位の変化を測定することができます。典型的には、内因性の興奮性の変化は、両方のNa +及びK +チャネルを必要とする活動電位を生成するニューロンのための能力の変化を介して評価されます。電流クランプ記録を行う際したがって、マイクロピペットは、K +の代わりのCs +を含有する内部溶液で満たされています。グルタミン酸やGABA ACSFに溶解し、受容体媒介電流を遮断する薬理学的薬剤と組み合わせることで、この実験デザインは、シナプスの興奮の潜在的な変化によって汚染されることなく、ニューロンの発火に固有の要因（ 例えば 、K +チャネル）の寄与を測定することができます要因。 この記事では、トンの基本的な必要な手続きの手順を説明しますO（ⅰ）健康な脳スライスを準備します。 （ii）の全細胞構成を達成し、および（iii）シナプスおよび固有興奮性を評価するための基本的なパラメータを監視します。

<table><tbody><tr><td>Isolated pulse stimulus generator</td><td>A.M.P.I</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>Isolation unit (ISO-Flex)</td><td>A.M.P.I</td><td>ISO-Flex</td><td></td></tr><tr><td>Computer controlled Amplifier&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Digital Acquisition system</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1500</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX-51</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>Chamber and in-line Heater</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome Slicer</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Imaging Camera</td><td>Q Imaging</td><td>QIClick-F-M-12</td><td></td></tr><tr><td>Narishige pipette puller PC-10</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillaries</td><td>WPI</td><td>TW150F-3</td><td></td></tr><tr><td>Slice hold-down (harp)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0255</td><td></td></tr><tr><td>Slice Chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Nonmetallic syringe needle</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G67-5</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filters</td><td>Nalgene</td><td>176-0045</td><td></td></tr><tr><td>Glue Gun</td><td>Home Depot</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>Gas dispersion tube</td><td>Ace Glass Inc.</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>Decapitation scissors</td><td>Home Depot</td><td>100649198</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle #3</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Small straight sharp tips scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>14218</td><td></td></tr><tr><td>Vessel canulation forceps&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>500453</td><td></td></tr><tr><td>Curved hemostatic forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501288</td><td></td></tr><tr><td>Economy Tweezers #3</td><td>World Precision Instruments</td><td>501976-6</td><td></td></tr><tr><td>Spatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14357Q</td><td></td></tr><tr><td>Scooping spatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747B</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Lab Depot</td><td>CFP1-110</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Solutions&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2&amp;ndash;7.3, 280&amp;ndash;290 mOsm)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>D-gluconic acid 50%&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>Cesium-OH (CsOH) 50%&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>NaCl, 2.8 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 20 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA, 0.4 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>tetraethylammonium-Cl, 5 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>T2265</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;GTP, 0.3 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>MgATP, 2 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;K-Gluconate internal solution (pH 7.2&amp;ndash;7.3, 280&amp;ndash;290 mOsm)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>K D-gluconate, 120 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>KCl, 20 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 10 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA, 0.2 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;GTP, 0.3 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>MgATP, 2 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity &amp;asymp; 300-310 mOsm)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>KCl, 2.5 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaCl, 119 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 1 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3,&lt;/sub&gt; 26.2 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>Glucose, 11 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 1.3 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 2.5 mM</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Additional compounds used for solutions preparation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>KOH</td><td>various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kynurenic acid</td><td>Sigma Aldrich/various</td><td>K3375</td><td></td></tr></tbody></table>

whole-cell patch-clamp recordings in brain slices

全細胞パッチクランプ記録は、ニューロンの要部の電気的​​特性の研究を可能にする電気生理学的手法です。この構成では、マイクロピペットは、リーク電流を防止し、それによって以前に使用され、細胞内シャープ電極記録方法よりも正確なイオン電流の測定値を提供する細胞膜と密着しています。古典的には、全細胞記録は、細胞培養モデル、解離ニューロン、脳切片におけるニューロンを含む製剤の各種におけるニューロン上で実行し、完全な麻酔または覚醒動物であることができます。要約すると、この技術は非常に興奮性細胞のパッシブとアクティブの生物物理学的特性の理解に貢献してきました。この手法の主な利点は、特定のニューロンの機能またはCを変化させることができる方法の特定の操作（ 例えば 、薬理学的、実験誘起塑性）に関する情報を提供することですリアルタイムでhannels。また、原形質膜の重要な開口部は、特定の細胞内タンパク質の薬物、 例えば 、アゴニストまたはアンタゴニストを導入し、そして隣接セルにおけるそれらの機能を変更することなく、これらのターゲットを操作するための手段を提供し、自由に細胞質中に拡散するための内部ピペット溶液を可能にします。この記事では、脳切片におけるニューロンの生理学的に関連する文脈で、 すなわち 、比較的よく保存され、脳の回路内のニューロンを記録するという利点があるの準備を行って全細胞記録に焦点を当てます。具体的には、適切な薬理学と組み合わせたときに、この技術は、このような学習、乱用薬物への曝露、ストレスなどの経験、任意のタイプ以下の発生した特定の神経適応の同定を可能にする強力なツールです。要約すると、脳切片における全細胞パッチクランプ記録は、ex vivoで調製長期的な変化を測定する手段を提供します無傷の覚醒した動物で開発した神経細胞の機能インチ

温度、容易に実験者によって制御される因子は、イオンチャネル及び受容体の生物物理学的特性に影響を及ぼし、それによってシナプス後電流（のPSC）（EPSCと性IPSC）のスパイクを誘発するニューロンの能力の波形は図3 図4は、ニューロン発火とそれぞれ誘発EPSCs（eEPSCs）の傾きに対する温度の効果を示します。発火パターン（ 図3）（1 回目のスパイクに、すなわち 、待ち時間、数、周波数、および活動電位波形をスパイク）は、特定の電位依存性イオンチャネルのタイミングと協調開閉し（Na +、のCa 2によって形作られています+、およびK +）、温度に敏感なプロセス。平均スパイク数は温度に依存して増加する方法を図3に示す図 。実験条件でここに記載ことに注意してください（MSNs録音）スパイクfrequeもののNCYはsubphysiological温度（28℃）で変更されているように見える温度が生理学的に関連するレベル（32°C）に達すると、それが大幅に増加しません。 図4Aは eEPSCsの方法傾斜、一般的に使用されているパラメータの一例を示していますシナプスの強さを評価し、温度と共に増加します。 全細胞構成をシール状態から遷移するとき、R sはやや効率的な膜の開口部を通って実験、 すなわち 、によって制御することができるが、Rが徐々に通常だ記録中に増加します。これは、記録時にピペットチップを詰まら様々な制御不可能な事象、 例えば 、膜の再閉鎖または破片の結果であり得ます。それはパッチを危険にさらすかもしれませんが、わずかな吸引を適用することにより、膜を再度開こうとすると、時々 、安定したR Sを維持するのに役立ちます。全ての場合において、R sの変化は、Alができるため研究中の電気信号の波形terを、それは注意深く監視し、PSCのを（電圧クランプモード）を記録する場合。 図4を特に示していなければならない場合には、R の増加（ 図4B）、グルタミン酸受容体媒介電流の振幅（eEPSCs ）（ 図4C、D）が減少します。 R s内の変化（ 例えば 、この研究室）15％を超えたとき、通常、実験者は、しかし、いくつかの研究室が20％変化から行う、データを破棄する。この基準は、記事の方法のセクションに示されなければなりません。 定義されたニューロンのために、R iは 、温度、細胞の健康、およびパッチの品質など、いくつかの要因によって影響を受けることができます。具体的には、R iがスパイクを生成するために、PSCの振幅または神経細胞の能力を低下さも減少します。例えば、 図4Eは、目、R iは著しく変化しないときことを示していますスパイクの電子の数が（ニューロン1）比較的安定した状態を保ちます。とき、R Iが増加するだけでなくスパイクの数が増加する（ニューロン2）。 10％の変化がバイアスデータに十分であるとしてそのため、同様にR sの、R iは注意深く監視する必要があります。 上述したように、温度を制御または監視することが重要R S、及び録音中R Iです。例えば、研究（のPSCまたは焼成）の下にある信号の変化を観察による変化（またはコントロールの欠如）これらの要因のではなく、実験操作の効果に、 例えば 、事前対のポストエフェクトでもよいです薬浴アプリケーション。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54024/54024fig1.jpg" /> 図1.カスタムメイド回復商工会議所（AD）と健康とデッドニューロン（E）を表示400Xで脳スライスの写真。広告）カスタム回収室を作るための手順は、ステップ2.1で説明されている。側坐核内側シェル対 400Xは、健康（赤い矢印の例を示す時、脳スライスにおけるMSNs）死んだニューロン（青矢印）のE）の写真。いくつかの細胞は、健康と示されているが、その球状の局面は、それらが所望の（アスタリスク付きの赤い矢印）ほど健康ではないかもしれないことを示していることに注意してください。最終的な健康状態は、iが全細胞構成を達成した後のV 休息とRに基づいて評価されている。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54024/54024fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54024/54024fig2.jpg" /> ギガシールを入手し、全細胞構成を確立するための基本的な手続きステップを示す 図2. 図。マイクロピペットは、目に十分に近い場合E細胞は、形質膜にディンプルを作成する（ステップ1、アプローチ）、マイクロピペットと原形質膜との間の緊密な連絡先を作成するための簡単​​な、穏やかな吸引を適用します。適切に実行した場合、接触が強化されると抵抗が増加し、1GΩ（ギガシール）以上（ステップ2、シールの形成）に到達します。シールは安定しており、1GΩより上になると、原形質膜（ステップ3、全細胞構成を）破裂する簡潔かつ強力な吸引を適用します。細胞全体の構成を達成することは、細胞質およびマイクロピペットの内部との間の継続性を可能にします。詳細については、プロトコルのステップ5.1から5.8を参照してください。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54024/54024fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54024/54024fig3.jpg" /> 図3.神経発火（内因性興奮）は現在、アサリに評価されます<html> Pモード。ここで、現在のステップの事前定義され、増分シリーズは、膜電位の変化を誘発し、これにより活動電位を誘発するために与えられる。A）平均スパイク数が温度と共に増加する。B）サンプルトレース280 Paに側坐核から三つの異なる温度設定における内側シェルMSNs（; 28°C、N = 5; 24°C、N = 9と32°C、N = 6）。記録チャンバー内の温度を直接スパイクの周波数に影響を与えます。しかし、スパイク周波数はsubphysiological温度で変更することはしていないようですが、温度が32℃、生理学的に関連する温度に達したときに、それが大幅に増加することに注意してください。ニューロンは、-80 mVので開催されています。双方向ANOVA：相互作用、P &lt;0.0001;温度効果はp = 0.0041;事後テスト：24°Cと28°Cは、32°C、**はp &lt;0.01と有意に異なっています。データは、平均±SEMとして表されます。校正：200ミリ秒、50 mVの。jove.com/files/ftp_upload/54024/54024fig3large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54024/54024fig4.jpg" /> 図4.温度の影響、R sおよび単一のNACシェルMSNからeEPSC振幅の電気信号の下で研究。A） は実施例の波形にR I。 24から28°Cおよび32°Cの温度を増加させることeEPSCsの傾きを増加させます。 eEPSCsスロープの温度による変化が急速に起こることに注意してください。ここで、eEPSCs勾配は、電圧クランプモードで評価されます。キャリブレーション：5ミリ秒、100 pAのBD）単一のNACシェルMSNからeEPSCsスロープの例。。 R Sが増加する（B）、eEPSCsの傾きは、Rの関数としてeEPSC勾配の（C）D）相関分析を減少します秒。ピアソンのR = -0.5717、P &lt;0.0001。ニューロンは、電圧クランプ-80 mVのである。スパイクを生成するニューロンの能力にR、iの効果を示す2つのニューロンからのトレースのE）の例。ニューロンは、電流クランプ、および-80 mVので開催されています。校正：200ミリ秒、50 mVの<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54024/54024fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

このプロトコルは、全細胞パッチクランプ記録を実行するための基本的な処理手順を説明します。この技術は、神経細胞の電気的挙動の研究を可能にし、脳スライスに行ったときに、まだ比較的よく保存脳の回路に集積されているニューロンからの様々な神経機能の評価を可能にします。

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

whole-cell-patch-clamp-recordings-in-brain-slices

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

59.4K ビュー.  University of Texas Southwestern Medical Center. このプロトコルは、全細胞パッチクランプ記録を実行するための基本的な処理手順を説明します。この技術は、神経細胞の電気的挙動の研究を可能にし、脳スライスに行ったときに、まだ比較的よく保存脳の回路に集積されているニューロンからの様々な神経機能の評価を可能にします。 

ビデオ: Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments that largely determines the quality of results. It has been shown that omitting the cooling step during cutting procedure is beneficial in obtaining healthy slices and cells, especially when dealing with highly myelinated brain structures from mature animals. Even though the precise mechanism whereby elevated temperature supports neural health can only be speculated upon, it stands to reason that, whenever possible, the temperature in which the slicing is performed should be close to physiological conditions to prevent temperature related artifacts. Another important advantage of this method is the simplicity of the procedure and therefore the short preparation time. In the demonstrated method adult mice are used but the same procedure can be applied with younger mice as well as rats. Also, the following patch clamp experiment is performed on horizontal cerebellar slices, but the same procedure can also be used in other planes as well as other posterior areas of the brain.

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

スライスこれホット：生理的温度における急性成人の脳スライス

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...

神経科学

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

急性脳スライスにおけるニューロンマイクロ回路の電気生理学的および形態学的特徴は、ペアパッチクランプ記録を使用して、

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

最適化されたNを使用して急性脳スライスの準備-メチル-D-glucamine 保護回復法

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze motor-learning induced plasticity, we trained rats using an accelerated rotor rod task. Rats performed the task 10 times at 30-s intervals for 1 or 2 days. Performance was significantly improved on the training days compared to the first trial. We then prepared acute brain slices of the primary motor cortex (M1) in untrained and trained rats. Current-clamp analysis showed dynamic changes in resting membrane potential, spike threshold, afterhyperpolarization, and membrane resistance in layer II/III pyramidal neurons. Current injection induced many more spikes in 2-day trained rats than in untrained controls.
To analyze contextual-learning induced plasticity, we trained rats using an inhibitory avoidance (IA) task. After experiencing foot-shock in the dark side of a box, the rats learned to avoid it, staying in the lighted side. We prepared acute hippocampal slices from untrained, IA-trained, unpaired, and walk-through rats. Voltage-clamp analysis was used to sequentially record miniature excitatory and inhibitory postsynaptic currents (mEPSCs and mIPSCs) from the same CA1 neuron. We found different mean mEPSC and mIPSC amplitudes in each CA1 neuron, suggesting that each neuron had different postsynaptic strengths at its excitatory and inhibitory synapses. Moreover, compared with untrained controls, IA-trained rats had higher mEPSC and mIPSC amplitudes, with broad diversity. These results suggested that contextual learning creates postsynaptic diversity in both excitatory and inhibitory synapses at each CA1 neuron.
AMPA or GABAA receptors seemed to mediate the postsynaptic currents, since bath treatment with CNQX or bicuculline blocked the mEPSC or mIPSC events, respectively. This technique can be used to study different types of learning in other regions, such as the sensory cortex and amygdala.

The slice patch clamp technique is an effective method for analyzing learning-induced changes in the intrinsic properties and plasticity of excitatory or inhibitory synapses.

スライス パッチ ・ クランプの技術学習によって誘発される可塑性を分析するため

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic multiplicity). Synaptic multiplicity is plastic and changes throughout development and in different physiological conditions, being an important determinant for the efficacy of synaptic transmission. Here, we outline experiments for estimating the degree of multiplicity of synapses terminating onto a given postsynaptic neuron using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices. Specifically, voltage-clamp recording is used to compare the difference between the amplitude of spontaneous excitatory postsynaptic currents (sEPSCs) and miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs). The theory behind this method is that afferent inputs that exhibit multiplicity will show large, action potential-dependent sEPSCs due to the synchronous release that occurs at each synaptic contact. In contrast, action potential-independent release (which is asynchronous) will generate smaller amplitude mEPSCs. This article outlines a set of experiments and analyses to characterize the existence of synaptic multiplicity and discusses the requirements and limitations of the technique. This technique can be applied to investigate how different behavioral, pharmacological or environmental interventions in vivo affect the organization of synaptic contacts in different brain areas.

Here, we present a protocol for evaluating the functional synaptic multiplicity using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices.

全細胞パッチク電気生理学を用いたシナプスの多様性の評価

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in the anteroventral periventricular nucleus and rostral periventricular nucleus, as well as the arcuate nucleus of the hypothalamus, project to gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) neurons, among other cells. Previous studies have demonstrated that kisspeptin signaling occurs through the Kiss1 receptor (Kiss1r), ultimately exciting GnRH neuron activity. In humans and experimental animal models, kisspeptins are sufficient for inducing GnRH secretion and, consequently, luteinizing hormone (LH) and follicle stimulant hormone (FSH) release. Since kisspeptins play an essential role in reproductive functions, researchers are working to assess how the intrinsic activity of hypothalamic kisspeptin neurons contributes to reproduction-related actions and identify the primary neurotransmitters/neuromodulators capable of changing these properties. The whole-cell patch-clamp technique has become a valuable tool for investigating kisspeptin neuron activity in rodent cells. This experimental technique allows researchers to record and measure spontaneous excitatory and inhibitory ionic currents, resting membrane potential, action potential firing, and other electrophysiological properties of cell membranes. In the present study, crucial aspects of the whole-cell patch-clamp technique, known as electrophysiological measurements that define hypothalamic kisspeptin neurons, and a discussion of relevant issues about the technique, are reviewed.

Here, we present a protocol to perform a whole-cell patch-clamp on brain slices containing kisspeptin neurons, the primary modulator of gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) cells. By adding knowledge about kisspeptin neuron activity, this electrophysiological tool has served as the basis for significant advancements in the neuroendocrinology field over the last 20 years.

全細胞パッチクランプ記録の標的としての視床下部キスペプチンニューロン

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...

Establishing a Whole-Cell Configuration through the Patch Clamp Method

Source: Segev, A. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54024">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the whole-cell patch clamp technique in a mouse brain slice. This technique establishes a stable connection between micropipette and neuron membrane, which is further disrupted to establish a whole-cell configuration to study the neuron&#39;s health and physiological responses.

パッチクランプ法による全細胞構成の確立

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. Slice ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Patch-Clamp Recordings from the Dendrite of a Dopaminergic Neuron in a Brain Slice

Source: Engel, D. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54601">Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a technique for patch-clamp recording from the dendritic membrane surface. This helps to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels in dopaminergic neurons.

脳スライスにおけるドーパミン作動性ニューロンの樹状突起からのパッチクランプ記録

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Establishing a Whole-Cell Voltage-Clamp Configuration for Electrophysiological Recordings in Brain Slices

Source: Sunstrum, J. K., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/59461">Evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates positioning a fine-pointed pipette near brain slices, forming a seal with a neuronal cell. Suction breaks the cell membrane, thereby creating a whole-cell patch clamp that enables current measurements for electrophysiology experiments.

脳スライスにおける電気生理学的記録のための全細胞電圧クランプ構成の確立

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review ...

Automated Image-Guided Patch Clamp Technique for Studying Neurons in Brain Slices

Source: Wu, Q., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/56010">Application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices.</a> J. Vis. Exp. (2017).
In this video, brain slices are immobilized in a recording chamber, and cells of interest are located and focused on using a computer-controlled microscope. The automated image processing system then precisely positions a patch pipette to seal the cell membrane and monitor electrical signals.

脳スライス中のニューロンを研究するための自動画像誘導パッチクランプ技術

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. System Setup

	Construct ...

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

要約

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スライスこれホット：生理的温度における急性成人の脳スライス

急性脳スライスにおけるニューロンマイクロ回路の電気生理学的および形態学的特徴は、ペアパッチクランプ記録を使用して、

最適化されたNを使用して急性脳スライスの準備-メチル-D-glucamine 保護回復法

スライスパッチ・クランプの技術学習によって誘発される可塑性を分析するため

全細胞パッチク電気生理学を用いたシナプスの多様性の評価

全細胞パッチクランプ記録の標的としての視床下部キスペプチンニューロン

パッチクランプ法による全細胞構成の確立

脳スライスにおけるドーパミン作動性ニューロンの樹状突起からのパッチクランプ記録

脳スライスにおける電気生理学的記録のための全細胞電圧クランプ構成の確立

脳スライス中のニューロンを研究するための自動画像誘導パッチクランプ技術

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

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急性脳スライスにおけるニューロンマイクロ回路の電気生理学的および形態学的特徴は、ペアパッチクランプ記録を使用して、

最適化されたNを使用して急性脳スライスの準備-メチル-D-glucamine 保護回復法

スライス パッチ ・ クランプの技術学習によって誘発される可塑性を分析するため

全細胞パッチク電気生理学を用いたシナプスの多様性の評価

全細胞パッチクランプ記録の標的としての視床下部キスペプチンニューロン

パッチクランプ法による全細胞構成の確立

脳スライスにおけるドーパミン作動性ニューロンの樹状突起からのパッチクランプ記録

脳スライスにおける電気生理学的記録のための全細胞電圧クランプ構成の確立

脳スライス中のニューロンを研究するための自動画像誘導パッチクランプ技術

スライスパッチ・クランプの技術学習によって誘発される可塑性を分析するため