Name: application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices
Uploaded: 2017-07-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices at JoVE.com

אנו אסירי תודה על התמיכה הכספית של קרן וייטהול. ברצוננו להודות לסמואל ט &#39;קיסינג&#39;ר על ההערות החשובות.

<ol>
	<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li><li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+liposome+preparation+for+imaging+and+patch-clamp+electrophysiology.">Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo.">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).</li><li>Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MATLAB-based+automated+patch-clamp+system+for+awake+behaving+mice.">MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice.</a> J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+operation+of+the+autopatcher+for+automated+intracellular+neural+recording+in+vivo.">Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo.</a> Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+autopatching+with+automated+pipette+and+cell+detection+in+vitro.">Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro.</a> J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).</li><li>Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computer-assisted+multi-electrode+patch-clamp+system.">A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system.</a> J Vis Exp. (80), e50630 (2013).</li><li>Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+cell+patch+clamp+recording+performed+on+a+planar+glass+chip.">Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip.</a> Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller.">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. (20), (2008).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li><li>Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACQ4:+an+open-source+software+platform+for+data+acquisition+and+analysis+in+neurophysiology+research.">ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research.</a> Front Neuroinform. 8 (3), (2014).</li><li>Kolb, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning+patch-clamp+pipettes+for+immediate+reuse.">Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li></ol>

בקשה לפטנט לא זמני &quot;מערכות ושיטות לאוטומציה ממוחשבת של תיקון אלקטרומגנטי אוטומטי ב- VITRO,&quot; מס &#39;קטלוגי: 15 / 353,719 בארה&quot;ב, הוגש ב -16 בנובמבר 2016, Ref. לא. PRF 67270-02.

כאן, אנו מתארים שיטה אוטומטית התמונה מונחה תיקון קלימפ הקלטות במבחנה . השלבים העיקריים בתהליך זה מסוכמים כדלקמן. ראשית, ראיית מחשב משמש באופן אוטומטי לזהות את קצה פיפטה באמצעות סדרה של תמונות שנרכשו באמצעות מיקרוסקופ. מידע זה משמש לאחר מכן לחשב את הפונקציה שינוי הקואורדינטות בין המיקרוסקופ לבין מערכות לתאם מניפולטור. ראיית מחשב משמש באופן אוטומטי לזהות תאים שכותרתו fluorescently כדי לזהות את הקואורדינטות שלהם. שלבים אלה משולבים עם מיקוד פיפטה ואלגוריתם תיקון אוטומטי באמצעות שפת קוד פתוח שפת Python, PyQT, וספריות OpenCV. לעומת הקיים במבחנה תיקון שיטות מהדק, מערכת זו עושה שיפורים משמעותיים במספר תחומים. זה מקטין את ההתערבות האנושית. מערכת זו ממכן את רוב הצעדים של הניסוי מהדק תיקון, למזער את reqUirement עבור התערבות אנושית. חלק מהשלבים הידניים הנותרים, כולל מעבר בין עדשות המיקרוסקופ נמוכות / גבוהות, יכולות להיות אוטומטיות תוך שימוש בחומרה ממונעת נוספת. שיטת תיקון המדבקת משפרת את התפוקה. ניסויים של תיקון Clamp באמצעות מערכת זו השיגו שיעורי הצלחה גבוהים יותר וזמנים קצרים יותר עבור כל ניסוי, דבר שתרם לעלייה משמעותית בתפוקה הכוללת. אלגוריתם חזון המחשב עבור זיהוי תא ניאון זיהוי קצה פיפטה הוא חזק מאוד, ושיעור השגיאה היה נמוך מאוד. השגיאה הממוצעת עבור איתור קצה פיפטה היה 1.6 מיקרומטר, ושיעור חיובי שקר עבור זיהוי תא ניאון היה 4.9% ± 2.25%. השוואה מפורטת בין תיקון ידני מסורתי לבין תיקון אוטומטי נעשה 6 . תיעוד מפורט של ניסויים אפשרי. תיקון יומנים של כל משפט ניתן לשמור ולנתח פוסט הוק . כאלה מפורטיםתיעוד לא היה זמין בעבר עבור תיקון ידני. זה מאפשר ניתוח שיטתי של ניסויים תיקון בתנאים ניסויים ייחודיים, סוגי תאים, מינים, ההכנות פרוסה. שיטה זו מראה תאימות עם תקן במבחנה תיקון מתקן מהדק. המערכת שלנו, כפי שהוכח בכתב היד הזה, נועד להגדיל את הקיים במבחנה מהדק קלאס תיקון, נותן להם את היכולת לבצע תיקון אוטומטי. שלא כמו הגישה התיקון מישורי, מערכת זו מתאימה למעבדות כבר ביצוע תיקון הידוק קלמפינג כדי להמיר את הציוד שלהם במחיר מינימלי. יחד עם זאת, עדיין יש אפשרות לתקן באופן ידני או חצי אוטומטי באופן אוטומטי באמצעות אותה מערכת. בגלל יכולת ההסתגלות של המערכת שהוזכרה לעיל, חיבור החומרה והתצורה של התוכנה נדרש על ידי הנסיין כאשר המערכת מוגדרת בפעם הראשונה. בעיות עלולות לגרוםממשימות יציאה שגויות וספריות מנהלי התקנים לא מתאימות עבור בקרת חומרה מסוימת. עיין בצעדים 1.2 - 1.4 בעת פתרון בעיות. לעומת אוטומציה חלקית של מערכות קיימות, מערכת זו משיגה את הרמה המקסימלית של אוטומציה קונבנציונאלי במבחנה תיקון clamping של פרוסות המוח חריפה (ותכשירים אחרים במבחנה ). זה נכון עבור כל השלבים, החל זיהוי התא כדי כיול פיפטה כדי תיקון 7 , 11 . צוואר הבקבוק היחיד הוא תהליך ידני של מילוי ושינוי טפיחות תיקון בין שבילים. ההתפתחויות האחרונות בשימוש חוזר של טפיחות תיקון יכול לפתור את הבעיה הזאת 12 . מלבד איכות הכנה פרוסה, הסיבה הנפוצה ביותר עבור ניסויים מוצלחים נובע מניפולטור שגיאות מכניות התנועה של הפרוסה בחדר. מגבלות אלה הן מעבר לשליטתנוהמערכת הנוכחית. המאמצים נעשים כדי ליישם קרוב לולאה, בזמן אמת איתור ובקרה של תנועת פיפטה כדי להסביר את הבעיה. לפיתוח עתידי, אנו מעוניינים להרחיב את יכולות זיהוי התא הנוכחי ניאון לזיהוי התא הכללית תחת אופטיקה DIC.

הטכניקה מהדק תיקון פותחה לראשונה על ידי Neher ו Sakmann בשנות ה -70 ללמוד את הערוצים היוניים של ממברנות נרגש 1 . מאז, תיקון clamping הוחל על המחקר של נושאים שונים רבים ברמה התאית, הסינפטית והמעגלית - הן במבחנה והן ב- vivo - בסוגי תאים שונים, כולל נוירונים, קרדיומיוציטים, ביציות Xenopus וליפוזומים מלאכותיים 2 . תהליך זה כרוך זיהוי נכון ומיקוד של תא של עניין, שליטה micromanipulator מורכבים להעביר את פיפטה תיקון בקרבה לתא, היישום של לחץ חיובי ושלילי פיפטה בזמן הנכון להקים תיקון gigaseal הדוק, ואת הפריצה להקים תצורה שלמה תיקון התאים. תיקון clamping מתבצעת בדרך כלל ידני דורש הכשרה מקיפה כדי לשלוט. אפילו עבור חוקר מנוסה עם התיקוןמהדק, שיעור ההצלחה נמוך יחסית. לאחרונה, כמה ניסיונות נעשו כדי להפוך את הניסויים תיקון clamp. שתי אסטרטגיות עיקריות התפתחו כדי להשיג אוטומציה: הגדלת תקן מתקן מהדק תיקון לספק בקרה אוטומטית של תהליך התיקון ואת העיצוב של ציוד וטכניקות חדשות מהיסוד. האסטרטגיה לשעבר היא הסתגלות החומרה הקיימת ניתן להשתמש במגוון רחב של יישומים מהדק תיקון, כולל vivo עיוור תיקון מהדק 3 , 4 , 5 , מהדק תיקון במבחנה של פרוסות מוח חריפה, תרבויות פרוסה organotypic, נוירונים מנותקים תרבותית 6 . זה מאפשר חקירה של מעגלים מקומיים מורכבים באמצעות micromanipulators מרובים בו זמנית 7 . שיטת התיקון המישורית היא דוגמה לאסטרטגיית הפיתוח החדשה, אשר יכולה להשיג את התפוקה הגבוהה בו-זמניתאטך מהדק של תאים ההשעיה למטרות הסריקה תרופה 8 . עם זאת, שיטת תיקון מישורי אינו מתאים לכל סוגי התאים, במיוחד נוירונים עם תהליכים ארוכים או מעגלים שלמים המכילים חיבורים נרחבים. זה מגביל את היישום שלה כדי מיפוי מעגלים מורכבים של מערכת העצבים, המהווה יתרון מרכזי של הטכנולוגיה המסורתית תיקון מהדק. פיתחנו מערכת אשר ממכן את תהליך הידוק תיקון הידן במבחנה על- ידי הגדלת חומרה סטנדרטי תיקון מהדק. המערכת שלנו, Autopatcher IG, מספק כיול פיפטה אוטומטי, זיהוי תא פלואורסצנטי זיהוי, שליטה אוטומטית של תנועת פיפטה, תיקון אוטומטי כל התא, ואת נתוני רישום. המערכת יכולה באופן אוטומטי לרכוש תמונות מרובות של פרוסות המוח בעומקים שונים; לנתח אותם באמצעות ראיית מחשב; ו לחלץ מידע, כולל את הקואורדינטות של תאים שכותרתו fluorescently. מידע זה יכול להיותהמשמש לכוון תאים תיקון אוטומטי של עניין. התוכנה נכתבת בפייתון - שפת תכנות חופשית וקוד פתוח - באמצעות מספר ספריות קוד פתוח. זה מבטיח נגישות שלה חוקרים אחרים ומשפר את reproducibility וקשיחות של ניסויים electrophysiology. המערכת יש עיצוב מודולרי, כך חומרה נוספת יכולה בקלות להיות interfaced עם המערכת הנוכחית הפגינו כאן.

<table><tbody><tr><td>CCD Camera</td><td>QImaging</td><td>Rolera Bolt</td><td></td></tr><tr><td>Electrophysiology rig</td><td>Scientifica</td><td>SliceScope Pro 2000</td><td>Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is &amp;ldquo;Linlab2&amp;rdquo;.</td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td>computer-controlled microelectrode amplifier</td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td>Axon Digidata 1550</td><td></td></tr><tr><td>LED light source</td><td>Cool LED</td><td>pE-100</td><td>488 nm wavelength</td></tr><tr><td>Data acquisition board</td><td>Measurement Computing</td><td>USB1208-FS</td><td>Secondary DAQ.&lt;br/&gt; See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf</td></tr><tr><td>Solenoid valves</td><td>The Lee Co.</td><td>LHDA0531115H</td><td></td></tr><tr><td>Air pump</td><td>Virtual industry</td><td>VMP1625MX-12-90-CH</td><td></td></tr><tr><td>Air pressure sensor</td><td>Freescale semiconductor</td><td>MPXV7025G</td><td></td></tr><tr><td>Slice hold-down</td><td>Warner instruments</td><td>64-1415 (SHD-40/2)</td><td>Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm</td></tr><tr><td>Python</td><td>Anaconda</td><td>version 2.7 (32-bit for windows)</td><td>https://www.continuum.io/downloads</td></tr><tr><td>Screw Terminals</td><td>Sparkfun</td><td>PRT - 08084</td><td>Screw Terminals 3.5 mm Pitch (2-Pin)</td></tr><tr><td>(2-Pin)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Channel MOSFET 60 V 30 A</td><td>Sparkfun</td><td>COM - 10213</td><td></td></tr><tr><td>DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-07937</td><td></td></tr><tr><td>LED - Basic Red 5 mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09590</td><td></td></tr><tr><td>LED - Basic Green 5mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09592</td><td></td></tr><tr><td>DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-12748</td><td></td></tr><tr><td>Wall Adapter Power Supply - 12 V DC 600 mA</td><td>Sparkfun</td><td>TOL-09442</td><td></td></tr><tr><td>Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-11367</td><td></td></tr><tr><td>Locking Male x Female x Female Stopcock</td><td>ARK-PLAS</td><td>RCX10-GP0</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings</td><td>Fisher scientific</td><td>14-171-129</td><td>Outer Diameter: 1/8 in.&lt;br/&gt; Inner Diameter: 1/16 in.</td></tr><tr><td>BNC male to BNC male coaxial cable</td><td>Belkin Components</td><td>F3K101-06-E</td><td></td></tr><tr><td>560 Ohm Resistor (5% tolerance)</td><td>Radioshack</td><td>2711116</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>General Valve</td><td>Picospritzer II</td><td></td></tr></tbody></table>

application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices

מהדק תיקון של כל התא הוא שיטה סטנדרטית זהב למדוד את המאפיינים החשמליים של תאים בודדים. עם זאת, במבחנה תיקון מהדק נשאר מאתגר נמוך התפוקה הטכניקה בשל המורכבות שלה ואת ההסתמכות הגבוהה על פעולת המשתמש ושליטה. כתב יד זה מדגים תמונה מודרכת אוטומטית תיקון מערכת מהדק עבור במבחנה כולו תא תיקון ניסויים מהדק פרוסות המוח חריפה. המערכת שלנו מיישמת מחשב מבוסס חזון אלגוריתם כדי לזהות תאים שכותרתו fluorescently ו למקד אותם עבור תיקון אוטומטי מלא באמצעות micromanipulator ואת השליטה הפנימית פיפטה הלחץ. התהליך כולו הוא אוטומטי מאוד, עם דרישות מינימליות להתערבות אנושית. מידע ניסיוני בזמן אמת, כולל התנגדות חשמלית ולחץ פיפטה פנימי, מתועדים בצורה אלקטרונית לניתוח עתידי ולאופטימיזציה לסוגים שונים של תאים. למרות שהמערכת שלנו מתוארת בהקשר של בריאה חריפהN הקלטות פרוסה, זה יכול גם להיות מיושם על התמונה אוטומטית מודרך תיקון מהדק של נוירונים מנותקים, תרבויות פרוסות organotypic, וסוגים אחרים של תאים שאינם נוירונים.

<html> המערכת שלנו נבדקה על היכולת שלה תיקון תאים פרוסות מוח חריפה, עכבר המושרה Pluripotent תאי גזע (iPSCs) מובחנת לנוירונים, ו HEK 293 תאים באופן מלאכותי להביע ערוצים של עניין. איור 3 מראה ניסוי באמצעות Thy1-ChR2-YFP עכברים מהונדסים (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J) מיקוד fluorescently שכותרתו שכבת 5 נוירונים פירמידליים בקליפה החזותית. תא המטרה היה אחד זיהו אוטומטית תאים ירוקים חיובי ניאון ( איור 3 ב ). איור 3 א הוא דיפרנציאלי התערבות ניגודיות (DIC) תמונה של נוירון טלאים. תצורת כל התא הושג על ידי פרוטוקול תיקון אוטומטי צעדים 2.5-2.6 ו תוקף על ידי הזרקת הזרם הנוכחי המושרה פוטנציאל פעולה ( איור 3 ג ) 1 &quot;&gt; כדי להדגים את הפונקציה&quot; רצף פקודה &quot;נוספת, סיפקנו 500 מ&quot;מ KCl עבור 200 ms לשלושה מיקומים על פרוסת המוח בזמן תיקון הטלאי ( איור 4 ). ראשית, בחרנו 3 מיקומים על פרוסת המוח: אחד סגור אל גוף התא המצולק ושניים רחוקים מהתא המוקפא.הקואורדינטות מאוחסנות בממשק הגרפי של &quot;Memory Position&quot; GUI. הקואורדינטות הועמסו ל GUI &quot;Command Sequence&quot; תחת &quot;Unit1&quot;, שהיה המניפולטור שה- KCl- המכיל פיפטה המכילה רכוב על.אנו להגדיר את הפקודות בעמודה השמאלית לשלוח אות 5 + V TTL עבור 500 ms, ואחריו 0 V במשך 10 שניות ( איור 4 א ), מן יציאה ערוץ 0 על לוח DAQ משני, אשר היה מחובר קלט &quot;התחל גורם&quot; digitizer איור 4c מראה כי התא תוקנו היה נוירון spiking רגיל.הפיפטה יישום סמים (יחידה 1) חצה את שלושת המיקומים שנבחרו אבאופן אוטומטי ( איור 4 ב ), והקלטנו 10 שניות עבור כל יישום תחת מתח מהדק ( איור 4 ד ). צבע העקבות באיור 4 ד מתאים לצבע הגבול בתרשים 4 ב . כאשר KCl היה נפוח על התא, זרם פנימי גדול שנצפתה, אשר הלך ופחת לאט כמו KCl מתפזרת. צבע פלואורסצנטי אדום נוסף לפתרון KCl כדי לציין את ההתפלגות המרחבית של מסירת התרופה, והוא צילם באמצעות הדמיה משולבת DIC ו- epifluorescent. ניסוי זה אייר את הקלות והגמישות של המערכת שלנו כדי לשלוט בתנועה מניפולטור / מיקרוסקופ וחומרה חיצונית באמצעות אותות TTL. <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig1.jpg" /> איור 1. יחידת בקרת לחץ. A: מעגל מודפס Board (PCB) לחיבור שסתומים, לחץחיישן, משאבת אוויר. משמאל מראה פרטים על PCB, תיוג מיקומים של פלטי המוזכרים בפרוטוקול. הימין מראה את החיבור בין PCB לבין משאבת אוויר, יציאת USB, ואת הצינור. B: מפת מעגל עבור PCB. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56010/56010fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig2.jpg" /> איור 2. Autopatcher GUI. הלחצנים שהוזכרו בפרוטוקול מוצגים בריבועים אדומים וממוספרים. 1: כיול כיול, 2: כיול כיול, 3: כיול עומס, 4: כיול משני, 5: זיהוי תא, 6: בקרת תיקון, 7: עבור אל (יעד תא תיאום), ו 8: תיקון. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56010/56010fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו</a>. <img alt="איור 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig3.jpg" /> איור 3. דוגמה של תא CHR2-YFP חיובי טלאים. A: הגדלה 40X תחת אופטיקה DIC. B: תמונה Epifluorescence של אותו תא בלוח A (תאורת LED ב 488 ננומטר). C: ההקלטה הנוכחית הקלטות מן התא טלאים במהלך סדרה של hyperpolarizing ו depolarizing צעד זריקות הנוכחי. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56010/56010fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56010/56010fig4.jpg" /> איור 4. ביצוע ניסוי אוטומטי משלוח סמים. ת: מיקומים נבחרים נטענים ל &quot;רצף פקודות&quot; GUI. העמודה השמאלית מראה<html> את רשימת הקואורדינטות, ואת העמודה הימנית מציגה את רשימת פקודות בצורה של אותות TTL עבור כל מיקום. ב &#39;: צילומי מסך במהלך הניסוי ליישומי סמים המתאימים לשלושת המיקומים שנבחרו. יחידה 1 היה פיפטה המכיל KCl ו יחידה 2 היה פיפטה תיקון. הפתרון KCl היה מעורבב עם צבע פלואורסצנטי אדום לצורך הדמיה. התמונות הושגו על ידי שילוב של DIC ו הדמיה פלואורסצנטי. C: הזרקת הזרם הנוכחי מראה נוירון קבוע spiking. D: מתח הקלטה מהדק עקבות מיישום מקומי של 500 מ&quot;מ פתרון KCl ב שלושה מקומות. עקבות אדום עם הזרם פנימה נרשם מן הניסוי כאשר יישום KCl היה קרוב לתא טלאים. החץ האדום מציין את התזמון של יישום KCl. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56010/56010fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" </html style=";text-align:right;direction:rtl">Fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot; עבור: keep-with-next.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <tbody><tr><td> מוצא על PCB </td><td> שם היציאה בלוח ה- DAQ </td><td> יציאה # על לוח DAQ </td><td> הֶעָרָה </td></tr><tr><td> DOUT V1 </td><td> ערוץ ערוץ 1 </td><td> 22 </td><td> שסתום בקרה 1 </td></tr><tr><td> DOUT V2 </td><td> ערוץ ערוץ 2 </td><td> 23 </td><td> שסתום בקרה 2 </td></tr><tr><td> ד </td><td> ערוץ ערוץ 3 </td><td> 24 </td><td> בקרת משאבת אוויר </td></tr><tr><td> Gr </td><td> קרקע, אדמה </td><td> 29 </td><td> קרקע, אדמה </td></tr></tbody></table> טבלה 1. מודפס מועצת המעגלים (PCB) כדי רכישת נתונים משנית (DAQ) תצורת חיבור הלוח. השתמש בטבלה זו לחיבור יציאות PCB (העמודה הראשונה משמאל) ליציאות בלוח ה- DAQ (העמודה השנייה משמאל)). שם היציאה ומספר ה- DAQ המשני מתייחסים למצב חד-פעמי. <img alt="שולחן 2" src="/files/ftp_upload/56010/56010table2.jpg" /> טבלה 2. חיבורי חיבורים מיחידת בקרת לחץ למחזיקי פיפטה. עבור כל חיבור, חבר את היציאות המתאימות, מסומן בקופסה אפורה, תוך שימוש בצינור רך (ראה טבלת החומרים ).

Watch this Scientific Journal Video about Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices at JoVE.com

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע אוטומטית תמונה מודרך תיקון ניסויים מהדק באמצעות מערכת שפותחה לאחרונה עבור תקן במבחנה electrophysiology ציוד.

יישום אוטומטי של תמונה מודרך תיקון מהדק לחקר נוירונים של פרוסות המוח

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

application-automated-image-guided-patch-clamp-for-study-neurons

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K Views.  Purdue University.  פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע אוטומטית תמונה מודרך תיקון ניסויים מהדק באמצעות מערכת שפותחה לאחרונה עבור תקן במבחנה electrophysiology ציוד. 

Video: Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent neuropsychiatric disorder that stems from the biophysical and cellular actions of nicotine on nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) throughout the central nervous system. Understanding the various nAChR subtypes that exist in brain areas relevant to nicotine addiction is a major priority.
Experiments that employ electrophysiology techniques such as whole-cell patch clamp or two-electrode voltage clamp recordings are useful for pharmacological characterization of nAChRs of interest. Cells expressing nAChRs, such as mammalian tissue culture cells or Xenopus laevis oocytes, are physically isolated and are therefore easily studied using the tools of modern pharmacology. Much progress has been made using these techniques, particularly when the target receptor was already known and ectopic expression was easily achieved. Often, however, it is necessary to study nAChRs in their native environment: in neurons within brain slices acutely harvested from laboratory mice or rats. For example, mice expressing "hypersensitive" nAChR subunits such as &alpha;4 L9&prime;A mice 1 and &alpha;6 L9&prime;S mice 2, allow for unambiguous identification of neurons based on their functional expression of a specific nAChR subunit. Although whole-cell patch clamp recordings from neurons in brain slices is routinely done by the skilled electrophysiologist, it is challenging to locally apply drugs such as acetylcholine or nicotine to the recorded cell within a brain slice. Dilution of drugs into the superfusate (bath application) is not rapidly reversible, and U-tube systems are not easily adapted to work with brain slices.
In this paper, we describe a method for rapidly applying nAChR-activating drugs to neurons recorded in adult mouse brain slices. Standard whole-cell recordings are made from neurons in slices, and a second micropipette filled with a drug of interest is maneuvered into position near the recorded cell. An injection of pressurized air or inert nitrogen into the drug-filled pipette causes a small amount of drug solution to be ejected from the pipette onto the recorded cell. Using this method, nAChR-mediated currents are able to be resolved with millisecond accuracy. Drug application times can easily be varied, and the drug-filled pipette can be retracted and replaced with a new pipette, allowing for concentration-response curves to be created for a single neuron. Although described in the context of nAChR neurobiology, this technique should be useful for studying many types of ligand-gated ion channels or receptors in neurons from brain slices.

In this paper, we describe a useful method to study ligand-gated ion channel function in neurons of acutely isolated brain slices. This method involves the use of a drug-filled micropipette for local application of drugs to neurons recorded using standard patch clamp techniques.

יישום מקומי של תרופות לללמוד לתפקד קולטן אצטילכולין ניקוטינית בפרוסות מוח עכבר

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

אלקטרו ומורפולוגי אפיון של שבבים עצביים במוח חריף Slices שימוש מותאם Patch-קלאמפ הקלטות

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

הכנת פרוסות המוח חריפה באמצעות אופטימיזציה N-מתיל-D-שיטת שחזור מגן glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze motor-learning induced plasticity, we trained rats using an accelerated rotor rod task. Rats performed the task 10 times at 30-s intervals for 1 or 2 days. Performance was significantly improved on the training days compared to the first trial. We then prepared acute brain slices of the primary motor cortex (M1) in untrained and trained rats. Current-clamp analysis showed dynamic changes in resting membrane potential, spike threshold, afterhyperpolarization, and membrane resistance in layer II/III pyramidal neurons. Current injection induced many more spikes in 2-day trained rats than in untrained controls.
To analyze contextual-learning induced plasticity, we trained rats using an inhibitory avoidance (IA) task. After experiencing foot-shock in the dark side of a box, the rats learned to avoid it, staying in the lighted side. We prepared acute hippocampal slices from untrained, IA-trained, unpaired, and walk-through rats. Voltage-clamp analysis was used to sequentially record miniature excitatory and inhibitory postsynaptic currents (mEPSCs and mIPSCs) from the same CA1 neuron. We found different mean mEPSC and mIPSC amplitudes in each CA1 neuron, suggesting that each neuron had different postsynaptic strengths at its excitatory and inhibitory synapses. Moreover, compared with untrained controls, IA-trained rats had higher mEPSC and mIPSC amplitudes, with broad diversity. These results suggested that contextual learning creates postsynaptic diversity in both excitatory and inhibitory synapses at each CA1 neuron.
AMPA or GABAA receptors seemed to mediate the postsynaptic currents, since bath treatment with CNQX or bicuculline blocked the mEPSC or mIPSC events, respectively. This technique can be used to study different types of learning in other regions, such as the sensory cortex and amygdala.

The slice patch clamp technique is an effective method for analyzing learning-induced changes in the intrinsic properties and plasticity of excitatory or inhibitory synapses.

פרוסה תיקון קלאמפ טכניקת ניתוח הנוצרות על-ידי למידה פלסטיות

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in the anteroventral periventricular nucleus and rostral periventricular nucleus, as well as the arcuate nucleus of the hypothalamus, project to gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) neurons, among other cells. Previous studies have demonstrated that kisspeptin signaling occurs through the Kiss1 receptor (Kiss1r), ultimately exciting GnRH neuron activity. In humans and experimental animal models, kisspeptins are sufficient for inducing GnRH secretion and, consequently, luteinizing hormone (LH) and follicle stimulant hormone (FSH) release. Since kisspeptins play an essential role in reproductive functions, researchers are working to assess how the intrinsic activity of hypothalamic kisspeptin neurons contributes to reproduction-related actions and identify the primary neurotransmitters/neuromodulators capable of changing these properties. The whole-cell patch-clamp technique has become a valuable tool for investigating kisspeptin neuron activity in rodent cells. This experimental technique allows researchers to record and measure spontaneous excitatory and inhibitory ionic currents, resting membrane potential, action potential firing, and other electrophysiological properties of cell membranes. In the present study, crucial aspects of the whole-cell patch-clamp technique, known as electrophysiological measurements that define hypothalamic kisspeptin neurons, and a discussion of relevant issues about the technique, are reviewed.

Here, we present a protocol to perform a whole-cell patch-clamp on brain slices containing kisspeptin neurons, the primary modulator of gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) cells. By adding knowledge about kisspeptin neuron activity, this electrophysiological tool has served as the basis for significant advancements in the neuroendocrinology field over the last 20 years.

נוירוני קיספפטין היפותלמיים כיעד להקלטות מהדק טלאי של תאים שלמים

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...

Establishing a Whole-Cell Voltage-Clamp Configuration for Electrophysiological Recordings in Brain Slices

Source: Sunstrum, J. K., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/59461">Evaluation of synaptic multiplicity using whole-cell patch-clamp electrophysiology.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates positioning a fine-pointed pipette near brain slices, forming a seal with a neuronal cell. Suction breaks the cell membrane, thereby creating a whole-cell patch clamp that enables current measurements for electrophysiology experiments.

קביעת תצורת מהדק-מתח של תא שלם לרישומים אלקטרופיזיולוגיים בפרוסות מוח

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Automated Image-Guided Patch Clamp Technique for Studying Neurons in Brain Slices

Source: Wu, Q., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/56010">Application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices.</a> J. Vis. Exp. (2017).
In this video, brain slices are immobilized in a recording chamber, and cells of interest are located and focused on using a computer-controlled microscope. The automated image processing system then precisely positions a patch pipette to seal the cell membrane and monitor electrical signals.

טכניקת מהדק טלאי מונחה תמונה אוטומטית לחקר תאי עצב בפרוסות מוח

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. System Setup

	Construct ...

Paired Patch Clamp Recording of the Neuronal Connections in Acute Brain Slices

Source: Qi, G., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/52358">Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the procedure to map synaptic connections by securing a brain slice, positioning pipettes to achieve whole-cell configurations, and stimulating presynaptic neurons to record postsynaptic responses, thereby elucidating neuronal connectivity.

רישום מהדק טלאי זוגי של הקשרים העצביים בפרוסות מוח חריפות

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Paired Patch-Clamp ...

Simultaneous Optical and Electrophysiological Monitoring of Neuronal Cells in Brain Slices

To place the multi-channel probe in the ex vivo brain tissue slide, perfuse bubbled experimental ACSF at three to six milliliters per minute, and transfer the brain slice containing the area of interest onto the mesh grid in the microscope perfusion chamber. Anchor the brain slice with a platinum harp. Rotate the mesh grid so that the line of electrode contacts on the distal end of the multichannel probe is approximately perpendicular to the PL surface.
Under broad-field illumination and fine control of the micromanipulator, lower the multichannel probe toward the surface of the slice. Engage the appropriate filter cube for visualization of the fluorescent reporter protein expressed in axon terminals of cortical afferents.
If necessary, rotate the slice to more precisely align the probe with the PL surface. Position the probe just above the plane of the slice, 200 micrometers short of the final target position along the x-axis, leaving at least one channel outside of the area of tissue being recorded. Slowly, insert the probe into the slice along its longitudinal axis.
To minimize damage to the tissue, only advance the probe to the extent that the sharp tips are just visible below the tissue surface. Switch experimental ACSF source to bagged control solution, and identify the fluorescently labeled cell for targeted patch-clamp recording. Restrict the aperture to the smallest diameter, and engage the high-power water-immersion objective, taking care to avoid contact between the multichannel probe and objective lens. Bring the tissue into focus.
Center the light over an area of tissue adjacent to, but not overlapping the multi-channel probe. Engage the appropriate filter set to allow imaging of cells expressing the Cre-dependent fluorescent marker. Raise the objective lens to create ample space for lowering a patch pipette.
Load a patch pipette with internal solution and mounted on the electrode holder. Use a one-milliliter syringe to apply positive pressure corresponding to approximately 0.1 milliliter air. Lower the patch pipette into the solution, bringing the tip into focus under visual guidance, and obtain whole-cell recording from the targeted cell.