この研究は、筋緊張性ジストロフィー基金（MDF-FF-2014-0013）の基金とアメリカ心臓協会（16SDG29320001）の科学者開発助成金によって部分的に支えられました。

野生型およびネスチン-GFPトランスジェニックマウスを、ミネソタ大学の動物施設に収容した。すべての実験手順は、ミネソタ大学の施設動物実験および使用委員会によって承認され、実験動物のケアおよび使用のためのNIHガイドに従っていた。 1.筋肉解離と単細胞分離<ol><li>トリブロモエタノール（250mg / kg、腹腔内）で成体マウス（男性および女性の両方）を安楽死させ、腹部皮膚を70％エタノールで滅菌する。 注：ケタミンはNMDA受容体と相互作用することが知られているので、試験に影響を与える可能性があるため、ここではトリブロモエタノールを麻酔/安楽死のためにケタミンの代わりに使用した。 </li><li>マウスを仰臥位に置き、メスを使用して腹部の皮膚を水平に切開する。後ろの筋肉を露出させるために反対方向に引っ張って手で皮膚を剥がします。 </li><li>コレク鉗子とハサミを使用して両方の後肢から筋肉を取り除く。氷上で1％ペニシリン - ストレプトマイシン（P / S）を補充した滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）にそれらを保存する。 </li><li> 1％P / Sを補充した氷冷PBSで解剖した後肢筋肉を2回洗浄し、滅菌10cmプレートに移す。 </li><li>慎重に2倍の倍率で解剖顕微鏡下で鉗子とハサミを使用して、筋肉から神経、血管、および結合組織を切開する。 </li><li>滅菌はさみと刃を使用して細かく切って筋肉を小さな片（1〜2mm 3 ）に切ります。必要に応じて、少量のダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を加えて、筋肉が乾燥しないようにします。 </li><li>機械的に10mLの血清学的ピペットを10回上下にピペッティングすることにより組織を破壊する。 </li><li>新鮮な消化溶液（0.2％タイプ2コラゲナーゼを補充したDMEM）を混合物に加える。 gentlと37℃で2時間インキュベートする35回転/分で攪拌する。 </li><li>混合物を均質化するために18G針を用いて粉砕する。次に、500 xgで5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを0.25％トリプシン/ EDTAに再懸濁する。 37℃で10分間インキュベートする。遠心分離を2回以上繰り返します。 </li><li> 20％ウシ胎児血清（FBS）を添加したDMEM 10mLを加え、500xgで5分間遠心する。上清を捨て、ペレットを赤血球溶解緩衝液（155mM NH 4 Cl、10mM KHCO 3および0.1mM EDTA）に再懸濁する。 </li><li> 500xgで5分間遠心分離する。上清を捨て、ペレットを選別バッファー（20mM HEPES、pH7.0; 1mM EDTA;およびCa / Mg 2+フリーPBS、pH7.0中の1％BSA）に再懸濁する。混合物を40μmセルストレーナに通して濾過して、単一細胞懸濁液を得る。 </li><li> 500xgで5分間遠心分離する。上清を捨て、ペレットを1 mLの分取バッファーに再懸濁する。 </li><li>カウント血球計数器で細胞数を測定し、単一細胞懸濁液を選別緩衝液中で5×10 6 / mLに希釈する。 </li></ol> 2.細胞染色および選別<ol><li> 表1に記載されているようにコントロールとサンプルを準備する。 表1に記載されているように、氷上でそれぞれの抗体を含む単一細胞懸濁液を30分間染色する。 </li><li> 500xgで5分間遠心分離し、ペレットを選別バッファーで2回洗浄する。 </li><li>表1に示すように、DAPIを単一細胞溶液に添加する.DAPI単色対照については5μg/ mLのDAPI（最終濃度）を使用し、PDGFRβ-PE-FMO対照および試料については1μg/ mLのDAPIを使用する。実験を通して、すべてのチューブを氷上に保つ。 </li><li>ソーターとソフトウェアをオンにします。プロンプトが表示されたら、100μmのソーティングチップをスキャンして挿入します。 </li><li>自動セットアップ（ すなわち、チップアライメント、液滴較正、サイドストリーム較正、およびソート遅延較正自動セットアップビーズをロードすることにより、オンにすることができます。 </li><li>自動設定が完了したら、[テスト]タブの[新規作成]をクリックし、[パブリックテンプレート]から[空のテンプレート]を選択します。 </li><li> 「測定設定」で、「FL1」に「DAPI」、「FL2」に「Nestin-GFP」、「FL3」に「PDGFRβ」を入力します。「FL4」 - 「FL6」のチェックボックスをオフにします。 </li><li> 405、488、および561レーザーを有効にして[新しい実験を作成]をクリックすると、そのボックスにチェックマークが付いています。 </li><li> 「補正ウィザードの開始」オプションを選択し、補正ウィザードを実行して補正を設定するプロンプトに従います。 <ol><li>染色されていないコントロールを読み込み、「開始」をクリックします。 &quot;Detector＆Threshold Settings&quot;をクリックし、FSCおよびBSC検出器のセンサーゲインを調整して、人口をスケールに配置します。 </li><li>広告FL1-FL3蛍光チャネルのゲインレベルのみで、ヒストグラムの左側に陰性集団を配置する。 「記録」ボタンをクリックしてデータを記録します。 </li><li>プロンプトが表示されたら、単色のコントロールを1つずつ読み込みます。 &quot;Start and Record&quot;をクリックしてデータを記録します。ヒストグラム上の陽性集団のゲートを調整する。 [次へ]をクリックします。 </li><li> [補正]タブの[計算マトリックス]に移動し、[補正設定の計算]パネルで[計算]をクリックして補正を実行します。 「終了」をクリックして、「補償ウィザード」を終了します。 </li></ol></li><li> PDGFRβ-PE-FMOコントロールをロードし、 &quot;Start&quot;をクリックします。 「すべてのイベント」プロットの下で、関心のあるセルの周囲にポリゴンゲート（ゲートA）を描画します。 </li><li> Gate Aの内側をダブルクリックして、子プロットを作成します。 Y軸をDAPIに変更し、ライブ（DAPI 低 ）セルの周囲にポリゴンゲート（ゲートB）を描画します。 iをダブルクリック子のプロットを作成するにはGate Bの横にある。 X軸をFSC-Hに変更し、Y軸をFSC-Wに変更し、ダブルレットを除去するためにシングレットの周りにポリゴンゲート（ゲートC）を描画します。 </li><li>ゲートC内をダブルクリックして子プロットを作成します。 X軸をNestin-GFPに、Y軸をPDGFRβ-PEに変更する。 「記録」ボタンをクリックしてデータを記録します。 </li><li>サンプルをロードし、ステップ2.11-2.12を繰り返します。記録後、 &quot;Pause&quot;をクリックしてサンプルを保存します。 </li><li> PDGFRβ-PE-FMOコントロールに基づいて、PDGFRβ +およびNestin-GFP +細胞のゲーティング境界を定義する。 PDGFRβ +ネスチン-GFP -およびPDGFRβ +ネスチン-GFP +集団のためのゲートを描く。 </li><li> 「選別方法」で「2-way Tubes」を選択し、「PDGFRβ + Nestin-GFP - 」および「PDGFRβ + Nestin-GFP + 」細胞を左右の採取管に割り当て、明らかに。収集バッファーに充填した15 mLの収集チューブをコレクションステージにマウントし、 &quot;Load Collection&quot;ボタンをクリックします。 </li><li>サンプルを実行し続けるには、「Resume」ボタンをクリックしてください。 PDGFRβ +ネスチン-GFP - （タイプI周皮細胞）およびPDGFRβ +ネスチン-GFP + （タイプII周皮細胞）を収集するために、「ソート開始」をクリックしてください。 </li></ol> 3.ソート後の分析<ol><li>選別した細胞を500 xgで5分間遠心分離し、ペリサイトをペリサイト培地（ 材料表を参照）1 mLに再懸濁し、血球計数器を使用して細胞密度を数えます。 </li><li>約1×10 4細胞/ cm 2で、ポリ-D-リジン（PDL）被覆したカバースリップ上の種I型およびII型周皮細胞を接種する。 5％CO 2を含む37℃で3日間、周皮細胞で増殖させる。 </li><li> 3日目に、ペリサイト形態（位相差下）および内在性Nestin-GFP発現を蛍光マイクロ（励起レーザー：488nm、励起フィルター：470 / 40nm、発光フィルター：515 / 30nm）。 20倍の対物レンズ（0.45 NA）で画像を撮影します。 </li><li>以前に記載されているように、脂肪細胞培地を脂肪生成（マウスMSC基礎培地+脂肪生成刺激補助）および筋原性（DMEM + 2％ウマ血清）培地で置換して脂肪生成および筋原分化を開始する。 2〜3日ごとに培地を交換する。 </li><li>室温で20分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）中の17日目（脂肪生成/筋原性分化の14日後）に細胞を固定する。 注：注意、PFAは発癌物質です。 </li><li> 以前の刊行物19,20に記載されているように、ペリリピン（脂肪細胞マーカー）およびS-ミオシン（成熟筋管/筋線維マーカー）に対する免疫細胞化学を行う。 <ol><li>室温で10分間、固定した細胞をPBSで3回洗浄する。 </li><li>ブロッキング緩衝液（PBS5％ロバ血清、3％BSA、および0.3％Triton X-100を補充したもの）を添加し、室温で1時間インキュベートする。 </li><li>細胞を抗ペリリピン（2μg/ mL）および/または抗S-ミオシン（2μg/ mL）抗体と共に4℃で一晩インキュベートする。 </li><li>室温で10分間、PBS中で細胞を3回洗浄する。 </li><li>室温で1時間、Alexa 555ロバ抗ウサギ（4μg/ mL）および/またはAlexa555ロバ抗マウス（4μg/ mL）抗体と細胞をインキュベートする。 </li><li>室温で10分間、PBS中で細胞を3回洗浄する。 </li><li>免疫染色された細胞をDAPIを含むマウント培地でマウントします（材料の表を参照）。蛍光顕微鏡（励起レーザー：543nm; 540 / 45nm励起および600 / 50nm発光）を用いてペリリピンおよびS-ミオシン発現を調べ、40倍対物レンズ（0.60NA）下で画像を撮る。 </li></ol></li></ol>

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すべての著者は、開示する利害の衝突はありません。

角質細胞は、毛細血管21,26の管腔外表面上に位置する多分化能血管周囲細胞22,23 である。骨格筋において、周皮細胞は、脂肪生成経路および/または筋形成経路19,20,24に沿って分化することができる。最近の研究により、異なるマーカー発現および明確な分化能を有する周皮細胞の2つの亜集団が明らかになった（19,24,25）。タイプI（NG2 +ネスチン- ）周...

筋ジストロフィーは、これまでのところ有効な治療法を持たない筋変性疾患である。組織の再生を促進する治療法の開発は、常に大きな関心を集めています。損傷後の組織の再生と修復は、幹細胞/前駆細胞に依存する1 。衛星細胞は、筋肉再生に寄与する筋原性前駆細胞である2,3,4,5,6,7。しかしながら、それらの臨床的使用は、制限された移動および注射後の低い生存率、ならびにインビトロ増幅後のそれらの減少した分化能力によって妨げられる8,9,10,11。サテリに加えて骨格筋はまた、血小板由来成長因子受容体 - ベータ（PDGFRβ） - 陽性間質細胞などの筋原性ポテンシャル12,13,14,15,16を有する多くの他の細胞集団を含む。筋肉由来のPDGFRβ +細胞が筋原性細胞に分化し、筋病変および機能を改善することが示された証拠がある14,17,18,19,20。 PDGFRβは、主に多能性を有する血管周囲細胞である周皮細胞21を標識する22,23。 PDGFRβに加えて、Neuron-Glial 2（NG2）およびCD146を含む多くの他のマーカーもiに使用される周皮細胞を鑑定する21 。しかしながら、これらのマーカーのいずれも周細胞特異的21ではないことに留意すべきである。最近の研究では、異なる分子マーカーを発現し、異なる機能を果たすタイプIおよびタイプIIと呼ばれる筋肉周皮細胞の2つのサブタイプが明らかになった19,24,25。生化学的には、タイプIの周細胞はNG2 +ネスチンであり、タイプIIの周細胞はNG2 +ネスチン+19,24である。機能的には、I型周皮細胞は脂肪蓄積および/または線維化に寄与する脂肪生成分化を受けることができるが、II型周皮細胞は筋再生経路に沿って分化し、筋再生に寄与する19,24,25。これらの結果は、（1）I型の周皮細胞は、b（2）II型周皮細胞は、筋ジストロフィーに対して大きな治療可能性を有する。これらの集団のさらなる調査および特徴付けは、高レベルの純度でI型およびII型周皮細胞の分離を可能にする単離プロトコルを必要とする。 現在、周皮細胞亜集団の単離は、NG2-DsRedおよびNestin-GFP二重トランスジェニックマウスに依存している19,24。 NG2-DsRedマウスの利用可能性およびほとんどのNG2抗体の品質は、この方法の広範な使用を制限する。すべてのNG2 +周皮細胞もまた骨格筋19,20,24においてPDGFRβを発現することを考慮すると、我々は、NG2が、周皮細胞およびそれらの亜集団の単離のためにPDGFRβによって置換され得ると仮定する。この作業では、FACSベースのプロトコルについて説明します。PDGFRβ染色およびネスチン-GFPシグナルを使用する。この方法は、（1）NG2-DsRedバックグラウンドを必要とせず、（2）よく特徴付けられた市販のPDGFRβ抗体を使用するため、研究者の要求が少ない。さらに、これは、I型およびII型の周皮細胞を高純度で同時に単離することを可能にし、これらの周皮細胞亜集団の生物学および治療可能性をさらに調査することを可能にする。精製後、これらの細胞を培養で増殖させることができ、その形態を可視化することができる。この研究はまた、二重トランスジェニックマウスから精製されたものと同様に、この方法を用いて単離されたI型およびII型の周皮細胞が脂肪生成性および筋原性であることも示している。

<table><tbody><tr><td>Cell Sorter</td><td>Sony</td><td>SH800</td><td></td></tr><tr><td>Automatic Setup Beads</td><td>Sony</td><td>LE-B3001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Avertin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Pericyte Growth Medium</td><td>ScienCell</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>MSC Basal Medium (Mouse)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5501</td><td></td></tr><tr><td>Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5503</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Sigma</td><td>H1270</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type 2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&amp;beta;-PE Antibody</td><td>eBioscience</td><td>12-1402</td><td></td></tr><tr><td>Perilipin Antibody</td><td>Sigma</td><td>P1998</td><td></td></tr><tr><td>S-Myosin Antibody</td><td>DSHB</td><td>MF-20</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-anti-rabbit antibody&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-31572</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-anti-mouse antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-31570</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661</td><td></td></tr><tr><td>KHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P184</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>18 G Needles</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Serological Pipette</td><td>BD</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1111</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of type i and type ii pericytes from mouse skeletal muscles

角質細胞は血管周囲多分化能細胞であり、異なる器官または同じ組織内でさえも異質性を示す。骨格筋には、異なる分子マーカーを発現し、明確な分化能力を有する、少なくとも2つの周皮細胞亜集団（I型およびII型と呼ばれる）が存在する。 NG2-DsRedおよびNestin-GFP二重トランスジェニックマウスを用いて、I型（NG2-DsRed + Nestin-GFP-）およびII型（NG2-DsRed + Nestin-GFP + ）の周皮細胞が正常に単離された。しかしながら、これらの二重トランスジェニックマウスの利用可能性は、この精製方法の広範な使用を妨げる。この研究は、骨格筋からのI型およびII型の周皮細胞の容易かつ同時の単離を可能にする代替プロトコールを記載する。このプロトコルは、蛍光活性化細胞選別（FACS）技術を利用し、Nestin-GFPシグナルと共にNG2ではなくPDGFRβを標的とする。分離後、I型とTy型pe II周皮細胞は異なる形態を示す。さらに、この新しい方法で単離されたI型およびII型の周皮細胞は、二重トランスジェニックマウスから単離されたものと同様に、脂肪生成性および筋原性である。これらの結果は、このプロトコルを用いて、周皮細胞亜集団を骨格筋から、場合によっては他の組織から単離することができることを示唆している。

レーザ強度およびチャネル補償を含むFACSパラメータは、無染色対照および単色対照の結果に基づいて補正される。 PDGFRβ-PE-FMOコントロールを用いてPDGFRβ-PE +集団のゲーティングを設定する（ 図1A ）。 PDGFRβ-PE-細胞の中で、Nestin-GFP +およびNestin-GFP-細胞を表す2つの集団が明確に分離されている（ 図1A ）。 PD...

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Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

この研究は、骨格筋からのI型およびII型周皮細胞の容易かつ同時の単離を可能にするFACSベースのプロトコールを記載する。

マウス骨格筋からのI型およびII型ペリクルの単離

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

isolation-of-type-i-and-type-ii-pericytes-from-mouse-skeletal-muscles

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.1K ビュー.  University of Minnesota. この研究は、骨格筋からのI型およびII型周皮細胞の容易かつ同時の単離を可能にするFACSベースのプロトコールを記載する。 

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Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

発生生物学

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

マウス骨格筋移植からの原発性筋芽生の単離と分化

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

プライマリ マウス骨格筋の微小血管内皮細胞の分離

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

神経科学

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

生物学

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

筋衛星細胞の単離、培養、および移植

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

新生児マウスから肺動脈平滑筋細胞の単離

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier integrity. However, their tissue-specific functions in the heart are not well understood. Moreover, there is currently no protocol utilizing readily accessible materials to isolate and purify pericytes of cardiac origin. Our protocol focuses on using the widely used mammalian model, the mouse, as our source of cells. Using the enzymatic digestion and mechanical dissociation of heart tissue, we obtained a crude cell mixture that was further purified by fluorescence activating cell sorting (FACS) by a plethora of markers. Because there is no single unequivocal marker for pericytes, we gated for cells that were CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Following purification, these primary cells were cultured and passaged multiple times without any changes in morphology and marker expression. With the ability to regularly obtain primary murine cardiac pericytes using our protocol, we hope to further understand the role of pericytes in cardiovascular physiology and their therapeutic potential.

We have optimized a protocol to isolate and purify murine cardiac pericytes for basic research and investigation of their biology and therapeutic potential.

マウス心ペリサイトの単離と精製

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

医学

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood brain barrier formation and physiology is now demonstrated but its molecular basis remains largely unknown. As the pathophysiological role of cerebral pericytes in neurological disorders is intriguing and of great importance, the in vitro models are not only sufficiently appropriate but also able to incorporate different techniques for these studies. Several methods have been proposed as in vitro models for the extraction of cerebral pericytes, although an antibiotic-free protocol with high output is desirable. Most importantly, a method that has increased output per extraction reduces the usage of more animals.
Here, we propose a simple and efficient method for extracting cerebral pericytes with sufficiently high output. The mouse brain tissue homogenate is mixed with a BSA-dextran solution for the separation of the tissue debris and microvascular pellet. We propose a three-step separation followed by filtration to obtain a microvessel rich filtrate. With this method, the quantity of microvascular fragments obtained from 10 mice is sufficient to seed 9 wells (9.6 cm2 each) of a 6-well plate. Most interestingly with this protocol, the user can obtain 27 pericyte rich wells (9.6 cm2 each) in passage 2. The purity of the pericyte cultures are confirmed with the expression of classical pericyte markers: NG2, PDGFR-&#946; and CD146. This method demonstrates an efficient and feasible in vitro tool for physiological and pathophysiological studies on pericytes.

We present a protocol for the extraction of murine cerebral pericytes. Based on an antibiotic-free enrichment oriented pericyte extraction, this protocol is a valuable tool for in vitro studies providing high purity and high yield, thus decreasing the number of experimental animals used.

マウスから脳ペリサイトを分離する高出力法

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles

Skeletal muscle harbors distinct populations of adult stem cells that contribute to the homeostasis and repair of the tissue. Skeletal muscle stem cells (MuSCs) have the ability to make new muscle, whereas fibro-adipogenic progenitors (FAPs) contribute to stromal supporting tissues and have the ability to make fibroblasts and adipocytes. Both MuSCs and FAPs reside in a state of prolonged reversible cell cycle exit, called quiescence. The quiescent state is key to their function. Quiescent stem cells are commonly purified from multiple muscle tissues pooled together in a single sample. However, recent studies have revealed distinct differences in the molecular profiles and quiescence depth of MuSCs isolated from different muscles. The present protocol describes the isolation and study of MuSCs and FAPs from individual skeletal muscles and presents strategies to perform molecular analysis of stem cell activation. It details how to isolate and digest muscles of different developmental origin, thicknesses, and functions, such as the diaphragm, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GA), soleus, extensor digitorum longus (EDL), and the masseter muscles. MuSCs and FAPs are purified by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and analyzed by immunofluorescence staining and 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU) incorporation assay.

This protocol describes the isolation of muscle stem cells and fibro-adipogenic progenitors from individual skeletal muscles in mice. The protocol involves single muscle dissection, stem cell isolation by fluorescence activated cell sorting, purity assessment by immunofluorescence staining, and quantitative measurement of S-phase entry by 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine incorporation assay.

個々の骨格筋からの静止幹細胞集団の分離

Skeletal muscle harbors distinct populations of adult stem cells that contribute to the homeostasis and repair of the tissue. Skeletal muscle stem cells ...

マウス骨格筋からのI型およびII型ペリクルの単離

要約

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ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

マウス骨格筋移植からの原発性筋芽生の単離と分化

プライマリマウス骨格筋の微小血管内皮細胞の分離

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

筋衛星細胞の単離、培養、および移植

新生児マウスから肺動脈平滑筋細胞の単離

マウス心ペリサイトの単離と精製

出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養

マウスから脳ペリサイトを分離する高出力法

個々の骨格筋からの静止幹細胞集団の分離

マウス骨格筋からのI型およびII型ペリクルの単離

要約

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ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

マウス骨格筋移植からの原発性筋芽生の単離と分化

プライマリ マウス骨格筋の微小血管内皮細胞の分離

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

筋衛星細胞の単離、培養、および移植

新生児マウスから肺動脈平滑筋細胞の単離

マウス心ペリサイトの単離と精製

出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養

マウスから脳ペリサイトを分離する高出力法

個々の骨格筋からの静止幹細胞集団の分離

プライマリマウス骨格筋の微小血管内皮細胞の分離