成体マウスの骨格筋から単一のミオファイバーを単離するためのプロトコルが数多く存在する。私たちのプロトコルは、非常に若いマウスと非常に壊れやすい筋繊維を持つ小さなマウスのために考案されています。この標準化された手順は、出生後の発達中に筋線維支援筋肉幹細胞を研究したり、特に筋繊維を機械的ストレスの影響を受けやすい疾患のマウスモデルで使用することができます。
この手順は、博士課程の学生であるグロリア・ペグリと、博士号を持つフェデリカ・ルチーニが研究室からデモンストレーションを行います。筋肉解剖と収穫のために、安楽死させた、非常に若いまたは非常に小さいマウスから解剖板に1つの後肢を固定するためにピンを使用し、鋭いピンセットを使用して脛取り前部の下腱を足首の高さまで持ち上げます。腱をカットし、膝蓋骨のレベルで腱に筋肉の周りのすべての方法をカットするために細かいはさみを使用しています。
消化液のチューブに筋肉を入れ、伸長体の腱の下腱を持ち上げ、腱を優しく上に引っ張って伸び体長を他の筋肉から分離します。切断し、筋肉を収穫します。脚を回転させて背中の筋肉を見て、アキレス腱を持ち上げます。
胃頭筋は自動的に他の筋肉から分離します。.膝蓋骨の後ろの上腱を切り、消化液に筋肉を入れる。脚の外部腱を持ち上げ、腱の下にピンセットを転がして腱を筋肉からそっと分離します。
次に、切断して筋肉を収穫し、同じ方法で他の脚から同じ筋肉を集めます。すべての筋肉が収集されたら、コレクションチューブを摂氏37度の水浴に45〜50分間入れ、10分ごとに10回激しくチューブを反転させます。筋肉が緩み始め、筋繊維が見えるようになると、10ミリリットルの洗浄溶液を含む100ミリメートルのペトリ皿に消化懸濁液を慎重に移す前に、サンプルを最後に振ります。
単一のミオファイバーを分離するには、皿を解剖顕微鏡の下に置き、馬の血清を200マイクロリットルピペットチップで使用して、個々の筋線維を離れて選びます。生き生きとしたミオファイバーを、5ミリリットルの事前温め洗浄液を含む35ミリメートルペトリ皿をコーティングした馬の血清に移します。すべての生菌性ミオファイバーが採取されたら、培養インキュベーター中のミオファイバーサンプルを5分間平衡化する。
さらにミオファイバーが必要な場合は、大きなボアガラスピペットを使用して、残りの筋肉組織サンプルを、追加の繊維が機械的に放出されるまでトリチュレートします。十分なミオファイバーが採取されたら、さらに平衡期間のために1時間培養インキュベーターに皿を入れます。インキュベーションの終了時に、適切な培養培地を含む新しい、温め込まれた馬の血清被覆皿に個々のミオファイバーを移し、そのプレートを細胞培養インキュベーターに戻す。
筋線維の免疫蛍光分析のために、架橋後、十分な上清以外のすべてを除去し、繊維を除去せず、PBSで0.5%トリトンX-100の1ミリリットルを同じチューブに加え、穏やかな攪拌で5分間インキュベーションする。インキュベーションの終わりに、上清をPBSの1.5ミリリットルに置き換える前に、繊維が5分間沈着するようにします。5分間の緩やかな攪拌の後、繊維がさらに5分間落ち着いてから、上清を1ミリリットルのブロッキング溶液に置き換えます。
穏やかな攪拌の1時間後、穏やかな攪拌で摂氏4度で一晩インキュベーションのための関心のある一次抗体を含む新鮮なブロッキング溶液とブロッキング溶液を交換してください。翌朝、PBSで穏やかな攪拌と洗浄のための室温で5分間の堆積を使用して、新鮮な0.25%Tween 20の1ミリリットルで3つの5分間の洗浄で繊維を洗います。最後の洗浄後、示すように、光から保護されたPBS+0.1%Tweenの3回の洗浄を続け、穏やかな攪拌で室温で1時間ブロッキング溶液で希釈した適切なフルオロクロム共役二次抗体で繊維にラベルを付けます。
最後の洗浄後、上清を1ミリリットルのDAPI溶液に交換し、光から保護された穏やかな攪拌で室温で5分間インキュベーションします。インキュベーションの最後に、繊維を洗浄し、カットチップでピペットをコーティングしたブロッキング溶液を使用して繊維を収集し、慎重にガラススライドに繊維を広げます。スライドを解剖顕微鏡の下に置き、鏡で反射した自然光のみを使用して、新しい200マイクロリットルピペットチップを使用して繊維を穏やかに広げ、余分な溶液を取り除きます。
余分な溶液を取り除いた後、非常に少量の溶液が残るまで、スライドを暗闇の中で10〜15分間乾燥させます。次に、組織の上にカバースリップを慎重に配置する前に、繊維に適切な土量の取り付け媒体を追加します。成長因子が豊富な培地で96時間生存できる十分な数の長い生存可能な繊維を取り出すために、4つの異なる筋肉が典型的に収穫され、消化される。
最も無傷の繊維のみが培養培地に移されるべきである。壊れた繊維やその他の破片は廃棄する必要があります。72時間培養した後、活性化された衛星細胞は、ミオファイバーに結合した細胞凝集体を生成する。
我々は、ラミンデルタ81二重陰性マウスに由来する細胞培養が、より少ない数の細胞によって形成されることを観察する。96時間後、衛星細胞は、MyoGを発現し、細胞クラスタ内に可視になり、新しいミオファイバーに対する分化を開始する。特に、衛星細胞分化の遅れたダイナミクスは、それらの野生型の対応と比較して、ホモ接合変異型ラミンノックアウトマウスで観察される。
迅速かつ正確な筋肉の収穫は、実験の成功に不可欠であるように筋肉解剖ステップを練習するようにしてください。この技術は、活性化および分化中の単一衛星細胞の追跡を可能にし、異なる生理学的および病理学的状態下での筋肉の成長および再生の基礎となる主要なプロセスの研究を促進する。
