עבודה זו נתמכה באופן חלקי על ידי מענק קרן-A-FO של קרן Dystrophy Myotonic (MDF-FF-2014-0013) ומענק פיתוח המדען של איגוד הלב האמריקני (16SDG29320001).

Wildtype ו Nestin-GFP מהונדס עכברים היו שוכנו במתקן החיות באוניברסיטת מינסוטה. כל הניסויים הניסויים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש באוניברסיטת מינסוטה היו בהתאם NIH מדריך לטיפול ושימוש של חיות מעבדה. 1. ניוון שרירים בודד בידוד התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים בוגרים (6-10 שבועות, הן זכר והן נקבה) עם tribromoethanol (250 מ&quot;ג / ק&quot;ג, IP) ו לעקר את עור הבטן שלהם עם אתנול 70%. הערה: Tribromoethanol שימש כאן במקום קטמין עבור הרדמה / המתת חסד, כמו ketamine ידוע אינטראקציה עם קולטני NMDA, אשר עלולה להשפיע על המחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכברים במצב שכיבה להשתמש איזמל לבצע חתך אופקית על עור הבטן. לקלף את העור ביד, מושך בכיוונים מנוגדים לחשוף את השרירים hindlimb. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קולקלא את השרירים משני hindlimbs באמצעות מלקחיים ומספריים. אחסן אותם ב סטרילי פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) בתוספת 1% פניצילין סטרפטומיצין (P / S) על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השרירים hindlimb גזור ב- PBS קר כקרח בתוספת 1% P / S פעמיים ולהעביר אותם צלחת סטרילית 10 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לנתח את העצבים, כלי הדם, ורקמות החיבור מן השרירים באמצעות מלקחיים ומספריים תחת מיקרוסקופ לנתיחה בהגדלה 2X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דק קוצצים את השרירים לחתיכות קטנות (1-2 מ&quot;מ 3 ) באמצעות מספריים סטריליים להבים. אם יש צורך, להוסיף כמות קטנה של Dulbecco השתנה נשר בינוני (DMEM) כדי להבטיח כי השרירים לא יבשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכני לשבור את הרקמה על ידי pipetting למעלה ולמטה דרך פיפטה 10 מ&quot;ל סרולוגי 10 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טריים פתרון העיכול (DMEM בתוספת 0.2% סוג 2 collagenase) לתערובת. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות עם עדיןE-agitation ב 35 סיבובים / דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturate באמצעות מחט 18 G כדי homogenize את התערובת. ואז, צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות. מחק supernatant ולאחר מכן resuspend גלולה 0.25% טריפסין / EDTA. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. חזור על צעד צנטריפוגה פעמיים נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של DMEM בתוספת 20% בסרום שור עוברית (FBS) לפתרון צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות. מחק supernatant ו resuspend גלולה במאגר תמוגה תא דם אדום (155 מ&quot;מ NH 4 Cl, 10 מ&quot;מ KHCO 3 , ו 0.1 מ&quot;מ EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות. מחק supernatant ו resuspend גלולה במיון מיון (20 מ&quot;מ HEPES, pH 7.0, 1 מ&quot;מ EDTA, ו 1% BSA ב Ca / Mg 2 + חינם PBS, pH 7.0). סנן את התערובת באמצעות מסננת תא 40 מיקרומטר להשיג ההשעיה תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות. מחק supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של מיון המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור אתמספר תא עם hemocytometer ו לדלל את ההשעיה תא בודד ל 5 x 10 6 / mL במאגר מיון. </li></ol> 2. תא מכתים ומיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפקדים ואת המדגם כמתואר בטבלה 1 . כתם ההשעיה תא בודד עם נוגדנים בהתאמה על קרח במשך 30 דקות, כמתואר בטבלה 1 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות ולשטוף את הכדורים פעמיים עם מיון המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף DAPI לפתרונות תא בודד, כפי שצוין בטבלה 1. השתמש DAPI 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​DAPI (ריכוז סופי) עבור DAPI צבע אחד שליטה ו 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​DAPI עבור PDGFRβ-PE-FMO שליטה המדגם. שמור את כל הצינורות על הקרח לאורך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את סדרן ואת התוכנה. סרוק והכניס שבב מיון 100 מיקרומטר כאשר תתבקש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ההגדרה האוטומטית ( כלומר, יישור שבב, כיול אגל, כיול זרם צד, ועיכוב מיון calibratiב) על ידי טעינת חרוזי ההתקנה אוטומטית כאשר תתבקש לעשות זאת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ההגדרה האוטומטית הושלמה, עבור לכרטיסייה &quot;ניסוי&quot;, לחץ על &quot;חדש&quot; ובחר את &quot;תבנית ריקה&quot; מתוך &quot;תבניות ציבוריות&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &quot;הגדרות מדידה&quot;, הזן &quot;DAPI&quot; עבור &quot;FL1&quot;, &quot;Nestin-GFP&quot; עבור &quot;FL2&quot; ו &quot;PDGFRβ&quot; עבור &quot;FL3.&quot; בטל את הסימון של תיבות עבור &quot;FL4&quot; - &quot;FL6&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את התיבות כדי להפעיל את הלייזרים 405, 488 ו- 561 ולחץ על &quot;צור ניסוי חדש&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את &quot;התחל פיצוי אשף&quot; ולאחר מכן פעל לפי &quot;אשף פיצוי&quot; התוכנה מבקשת להגדיר את הפיצוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את השליטה unstained ולחץ על &quot;התחל&quot;. לחץ על &quot;גלאי &amp; הגדרות סף&quot; ולהתאים את הרווח חיישן של FSC ו BSC גלאי למקום האוכלוסייה על הסולם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוֹדָעָהרק את רמות הרווח של FL1-FL3 ערוצי הקרינה למקום אוכלוסיות שליליות בצד שמאל של היסטוגרמות. לחץ על כפתור &quot;הקלטה&quot; כדי להקליט את הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען בודדים בצבע אחד אחד כאשר תתבקש. לחץ על &quot;התחל והקלט&quot; כדי להקליט את הנתונים. להתאים את השערים לאוכלוסיות חיוביות על היסטוגרמות. לחץ על &quot;הבא&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אל &quot;חישוב מטריקס&quot; על הכרטיסייה &quot;פיצוי&quot; ולחץ על &quot;חישוב&quot; בלוח &quot;חישוב פיצוי הגדרות&quot; לבצע את הפיצוי. לחץ על &quot;סיום&quot; כדי לצאת מהאשף &quot;פיצוי&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את PDGFRβ-PE-FMO שליטה ולחץ על &quot;התחל&quot;. צייר שער מצולע (שער A) סביב התאים של עניין תחת העלילה &quot;כל האירועים&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ פעמיים בתוך שער A כדי ליצור מגרש ילדים. שנה את ציר Y ל- DAPI וצייר שער מצולע (שער B) סביב תאים חיים (DAPI) נמוכים . לחץ פעמיים על iNside שער B כדי ליצור מגרש הילד. לשנות את ציר ה- X כדי FSC-H ואת ציר Y ל- FSC-W ו לצייר שער מצולע (שער C) סביב singlets לחסל הכפולות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ פעמיים בתוך שער C כדי ליצור מגרש ילדים. שנה את ציר ה- X ל- Nestin-GFP ואת ציר ה- Y ל- PDGFRβ-PE. לחץ על כפתור &quot;הקלטה&quot; כדי להקליט את הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המדגם וחזור על הצעדים 2.11-2.12. לאחר ההקלטה, לחץ על &quot;השהה&quot; כדי לשמור על המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את גבולות gating עבור PDGFRβ + ו Nestin-GFP + תאים המבוססים על PDGFRβ-PE-FMO שליטה. צייר השערים עבור האוכלוסייה PDGFRβ + Nestin-GFP - ו PDGFRβ + Nestin-GFP + אוכלוסיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &quot;שיטת מיון&quot;, בחר &quot;2-way צינורות&quot; ולהקצות &quot;PDGFRβ + Nestin-GFP - &quot; ו &quot;PDGFRβ + Nestin-GFP + &quot; לתאי צינורות שמאל וימין, מחדשבצורה מדהימה. הרכבה מיון המיון מלא 15 מ&quot;ל צינורות איסוף על הבמה אוסף ולחץ על &quot;טען אוסף&quot; כפתור &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הלחצן &quot;המשך&quot; כדי לשמור על הדגימה פועלת. לחץ על &quot;התחל מיון&quot; כדי לאסוף PDGFRβ + Nestin-GFP - (סוג אני pericytes) ו PDGFRβ + Nestin-GFP + (סוג II pericytes) תאים. </li></ol> 3. לאחר מיון המיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים מיון ב 500 xg במשך 5 דקות, resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של מדיום pericyte (ראה טבלה חומרים ), ולספור את צפיפות התא באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוג זרע אני ואת סוג II pericytes על פולי- D- ליזין (PDL) מצופה coverslips ב ~ 1 x 10 4 תאים / ס&quot;מ 2 . לגדול במדיום pericyte במשך 3 ימים על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, לבחון את המורפולוגיה pericyte (תחת בניגוד לעומת) אנדוגני Nestin-GFP ביטוי באמצעות מיקרו פלואורסצנטיהיקף (לייזר עירור: 488 ננומטר, מסנן עירור: 470/40 ננומטר, מסנן פליטה: 515/30 ננומטר). קחו תמונות תחת מטרה 20X (0.45 NA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום pericyte עם בינוני adipogenic (MSC העכבר הבסיס + בינוני adipogenic תוספת גירוי) ו myogenic (DMEM + 2% בסרום סוס) בינוני ליזום adipogenic ו myogenic בידול, בהתאמה, כפי שתואר לעיל 20 . שנה את המדיום כל 2-3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים ביום 17 (14 ימים לאחר בידול אדיפוגני / myogenic) ב paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: זהירות, PFA הוא מסרטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע immunocytocochemistry נגד perilipin (סמן adipocyte) ו- S- myosin (בוגר myotube / myofiber בוגרת), כפי שתואר בפרסומים קודמים 19 , 20 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים קבוע 3 פעמים PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת חיץ חסימה (PBSבתוספת 5% סרום חמור, 3% BSA, ו 0.3% Triton X-100) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם antilodies perilipin (2 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו / או אנטי- S- מיוזין (2 מיקרוגרם / מ&quot;ל) נוגדנים ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים 3 פעמים PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם Alexa 555 חמור נגד ארנבת (4 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו / או Alexa555 חמור אנטי עכבר (4 ​​מיקרוגרם / מ&quot;ל) נוגדנים בטמפרטורת החדר למשך 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים 3 פעמים PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר תאים immunostained עם המדידה הרכבה המכיל DAPI (ראה את טבלת החומרים). בחן perilipin ו- S- ביטוי myosin באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (עירור לייזר: 543 ננומטר, עירור 540/45 ננומטר ו 600/50 ננומטר פליטת) ולקחת תמונות תחת מטרה 40X (0.60 NA). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+recruitment+after+injury:+lessons+for+regenerative+medicine.">Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine.</a> Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).</li><li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax7-expressing+satellite+cells+are+indispensable+for+adult+skeletal+muscle+regeneration.">Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).</li><li>Relaix, F., Zammit, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+are+essential+for+skeletal+muscle+regeneration:+the+cell+on+the+edge+returns+centre+stage.">Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage.</a> Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).</li><li>von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax7+is+critical+for+the+normal+function+of+satellite+cells+in+adult+skeletal+muscle.">Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).</li><li>Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+absolute+requirement+for+Pax7-positive+satellite+cells+in+acute+injury-induced+skeletal+muscle+regeneration.">An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).</li><li>Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+Pax7+and+Pax3+in+adult+regenerative+myogenesis.">Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis.</a> J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).</li><li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells,+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration.">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).</li><li>Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+persistence+and+migration+of+myogenic+cells+injected+into+pre-irradiated+muscles+of+mdx+mice.">Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice.</a> J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).</li><li>Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+myoblast+transplantation+reveal+a+discrete+minority+of+precursors+with+stem+cell-like+properties+as+the+myogenic+source.">Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source.</a> J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).</li><li>Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+review:+myoblast+transfer:+a+possible+therapy+for+inherited+myopathies.">Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies.</a> Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).</li><li>Montarras, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration.">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).</li><li>Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+specification+of+side+population+cells+in+skeletal+muscle.">Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle.</a> J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).</li><li>Tamaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle-derived+CD34+/45-+and+CD34-/45-+stem+cells+are+situated+hierarchically+upstream+of+Pax7++cells.">Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells.</a> Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).</li><li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+resident+in+postnatal+skeletal+muscle+differentiate+into+muscle+fibres+and+generate+satellite+cells.">Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells.</a> Nat Commun. 2, 499 (2011).</li><li>Mitchell, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+non-satellite+cell+muscle+resident+progenitor+during+postnatal+development.">Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development.</a> Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).</li><li>Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+skeletal+muscle+resident+progenitors+and+their+cell+fate+potentials.">Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials.</a> Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).</li><li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+of+human+skeletal+muscle+are+myogenic+precursors+distinct+from+satellite+cells.">Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells.</a> Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).</li><li>Kostallari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+the+myovascular+niche+promote+post-natal+myofiber+growth+and+satellite+cell+quiescence.">Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence.</a> Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).</li><li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+pericytes+in+skeletal+muscle+regeneration+and+fat+accumulation.">Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation.</a> Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).</li><li>Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+regulates+PDGFRbeta(+)+cell+stemness+and+muscle+development.">Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development.</a> Nat Commun. 7, 11415 (2016).</li><li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+developmental,+physiological,+and+pathological+perspectives,+problems,+and+promises.">Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises.</a> Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li><li>Dore-Duffy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+pluripotent+cells+of+the+blood+brain+barrier.">Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier.</a> Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).</li><li>Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS+microvascular+pericytes+exhibit+multipotential+stem+cell+activity.">CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).</li><li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+pericyte+subtypes+differ+in+their+differentiation+potential.">Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential.</a> Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).</li><li>Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+differentially+regulates+the+stemness+of+type+I+and+type+II+pericytes.">Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 28 (2017).</li><li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+multitasking+cells+in+the+regeneration+of+injured,+diseased,+and+aged+skeletal+muscle.">Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle.</a> Front Aging Neurosci. 6, 245 (2014).</li></ol>

לכל המחברים אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

Pericytes הם תאים multivotent perivascular 22 , 23 הממוקם על פני השטח abluminal של נימי 21 , 26 . בשרירי השלד, pericytes מסוגלים להבדיל לאורך נתיבים adipogenic ו / או myogenic 19 , 20 , 24 . מחקרים שנ?...

ניוון שרירים הוא הפרעה ניוונית שרירית כי אין טיפולים יעילים עד כה. פיתוח טיפולים המקדמים התחדשות רקמות תמיד היה עניין רב. התחדשות רקמות ותיקון לאחר נזק תלוי בתאי גזע תושב / תאים אב 1 . תאי לוויין מחויבים תאים מבשר myogenic התורמים התחדשות שרירים 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . השימוש הקליני שלהם, לעומת זאת, הוא הקשו על ידי הגירה מוגבלת שלהם שיעור הישרדות נמוך לאחר ההזרקה, כמו גם על ידי יכולת ירידה שלהם בידול לאחר הגברה במבחנה 8 , 9 , 10 , 11 . בנוסף satelliתאי T, שרירי השלד מכילים גם אוכלוסיות תאים רבים אחרים עם פוטנציאל myogenic 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , כגון טסיות הנגזרות גורם גדילה ביתא (PDGFRβ) תאים interstitial אינטראקטיביים. ישנן ראיות מראה כי שריר הנגזרות PDGFRβ תאים + מסוגלים להבדיל לתאי myogenic ולשפר פתולוגיה שריר לתפקד 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . PDGFRβ בעיקר תוויות pericytes 21 , אשר תאים perivascular עם pluripotency 22 , 23 . בנוסף PDGFRβ, סמנים רבים אחרים, כולל Neuron-Glial 2 (NG2) ו CD146, משמשים גם אניDentify pericytes 21 . עם זאת, יש לציין כי אף אחד מהסימנים הללו אינו ספציפי ל- pericyte 21 . מחקרים שנערכו לאחרונה חשפו שני תת-סוגים של פריסיטים בשרירים, הנקראים סוג I וסוג II, המבטאים סמנים מולקולריים שונים ומבצעים פונקציות שונות 19 , 24 , 25 . ביוכימית, סוג אני pericytes הם NG2 + Nestin - , ואילו סוג II pericytes הם NG2 + Nestin + 19 , 24 . באופן פונקציונלי, סוג אני pericytes יכול לעבור בידול אדיפוגני, תורם הצטברות שומן ו / או פיברוזיס, ואילו סוג II pericytes יכול להבדיל לאורך מסלול myogenic, תורם התחדשות שרירים 19 , 24 , 25 . תוצאות אלה מראות כי: (1) סוג אני pericytes עשוי bE ממוקד לטיפול בהפרעות ניווניות שומן / פיברוזיס, ו (2) סוג II pericytes יש פוטנציאל טיפולי רב עבור ניוון שרירים. חקירה נוספת ואפיון של אוכלוסיות אלה דורשות פרוטוקול בידוד המאפשר הפרדה מסוג I ו percytes סוג II ברמה גבוהה של טוהר. נכון לעכשיו, בידוד subpopulations pericyte מסתמך על NG2-DsRed ו Nestin-GFP עכברים מהונדסים פעמיים 19 , 24 . הזמינות של עכברים NG2-DsRed ואת האיכות של רוב הנוגדנים NG2 להגביל את השימוש הנרחב של שיטה זו. בהתחשב בכך שכל NG2 + pericytes גם להביע PDGFRβ בשרירי השלד 19 , 20 , 24 , אנו משער כי NG2 ניתן להחליף PDGFRβ לבידוד pericytes ו subpopulations שלהם. עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול מבוסס FACSמשתמש מכתים PDGFRβ ואת האות Nestin-GFP. שיטה זו היא פחות תובענית עבור החוקרים כי: (1) זה אינו דורש את הרקע NG2-DsRed ו (2) הוא משתמש נוגדנים PDGFRβ זמינים מסחרית, אשר מאופיינים היטב. בנוסף, הוא מאפשר בידוד סימולטני של סוג I ו- II pericytes בטוהר גבוה, ומאפשר חקירה נוספת של ביולוגיה ופוטנציאל טיפולי של subpopulations אלה pericyte. בעקבות טיהור, תאים אלה יכולים להיות גדלים בתרבות, המורפולוגיות שלהם יכול להיות דמיינו. עבודה זו גם מראה כי סוג I ו percytes סוג II מבודד באמצעות שיטה זו, כמו אלה מטוהרים מן העכברים מהונדס פעמיים, הם אדיפוגניים ו myogenic, בהתאמה.

<table><tbody><tr><td>Cell Sorter</td><td>Sony</td><td>SH800</td><td></td></tr><tr><td>Automatic Setup Beads</td><td>Sony</td><td>LE-B3001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Avertin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Pericyte Growth Medium</td><td>ScienCell</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>MSC Basal Medium (Mouse)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5501</td><td></td></tr><tr><td>Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5503</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Sigma</td><td>H1270</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type 2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&amp;beta;-PE Antibody</td><td>eBioscience</td><td>12-1402</td><td></td></tr><tr><td>Perilipin Antibody</td><td>Sigma</td><td>P1998</td><td></td></tr><tr><td>S-Myosin Antibody</td><td>DSHB</td><td>MF-20</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-anti-rabbit antibody&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-31572</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-anti-mouse antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-31570</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661</td><td></td></tr><tr><td>KHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P184</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>18 G Needles</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Serological Pipette</td><td>BD</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1111</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of type i and type ii pericytes from mouse skeletal muscles

Pericytes הם תאים multipotent perivascular המציגים הטרוגניות באיברים שונים או אפילו בתוך הרקמה זהה. בשרירי השלד, יש לפחות שתי תת-אוכלוסיות (הנקראות סוג I וסוג II), המבטאות סמנים מולקולריים שונים ויש להן יכולות הבחנה שונות. באמצעות NG2-DsRed ו Nestin-GFP עכברים פעמיים מהונדס, סוג אני (NG2-DsRed + Nestin-GFP - ) וסוג II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) פריסיטים היו מבודדים בהצלחה. עם זאת, הזמינות של עכברים אלה פעמיים מהונדס מונע את השימוש הנרחב של שיטה זו טיהור. עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול חלופי המאפשר בידוד קל בו זמנית של סוג I ו pericytes סוג II של שרירי השלד. פרוטוקול זה מנצל את הקרינה המופעל תא מיון (FACS) טכניקה מטרות PDGFRβ, ולא NG2, יחד עם האות Nestin-GFP. לאחר בידוד, הקלד אני ו tyPe II pericytes להראות מורפולוגיות שונות. בנוסף, סוג I ו percytes סוג II מבודדים בשיטה חדשה זו, כמו אלה מבודד מן העכברים מהונדס פעמיים, הם אדיפוגניים ו myogenic, בהתאמה. תוצאות אלו מראות כי פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי לבודד subpopulations pericyte של שרירי השלד ואולי מתוך רקמות אחרות.

הפרמטרים של FACS, כולל עוצמת הלייזר ותגמול הערוץ, מתוקנים על סמך תוצאות הבקרה הבלתי מבוקרת ובקרות בצבע יחיד. PDGFRβ-PE-FMO שליטה משמש לקבוע את gating עבור האוכלוסייה PDGFRβ-PE + ( איור 1 א ). בין PDGFRβ-PE תאים, שתי אוכלוסיות המייצג Nestin-GFP + ו Nest...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles at JoVE.com

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול מבוסס FACS המאפשר בידוד קל בו זמנית של סוג I ו pericytes סוג II של שרירי השלד.

בידוד של סוג אני ו II סוג pericytes של עכבר שרירי השלד

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

isolation-of-type-i-and-type-ii-pericytes-from-mouse-skeletal-muscles

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.1K Views.  University of Minnesota.  עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול מבוסס FACS המאפשר בידוד קל בו זמנית של סוג I ו pericytes סוג II של שרירי השלד. 

Video: Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

בידוד והבידול של מכשולים ראשוניים מתוך שריר השלד של העכבר Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

בידוד של תאי אנדותל Microvascular ראשי שריר השלד מאתר

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Neuroscience

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Biology

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

בידוד של תאי שריר חלקים עורק ריאה מעכברים ילודים

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier integrity. However, their tissue-specific functions in the heart are not well understood. Moreover, there is currently no protocol utilizing readily accessible materials to isolate and purify pericytes of cardiac origin. Our protocol focuses on using the widely used mammalian model, the mouse, as our source of cells. Using the enzymatic digestion and mechanical dissociation of heart tissue, we obtained a crude cell mixture that was further purified by fluorescence activating cell sorting (FACS) by a plethora of markers. Because there is no single unequivocal marker for pericytes, we gated for cells that were CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Following purification, these primary cells were cultured and passaged multiple times without any changes in morphology and marker expression. With the ability to regularly obtain primary murine cardiac pericytes using our protocol, we hope to further understand the role of pericytes in cardiovascular physiology and their therapeutic potential.

We have optimized a protocol to isolate and purify murine cardiac pericytes for basic research and investigation of their biology and therapeutic potential.

בידוד וטיהור של קרום הלב של מורלין

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Medicine

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

בידוד ותרבות בודדים מודל מורנה של קבצי נייל-דרייפוס ניוון שרירים בתחילת לאחר לידה פיתוח

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood brain barrier formation and physiology is now demonstrated but its molecular basis remains largely unknown. As the pathophysiological role of cerebral pericytes in neurological disorders is intriguing and of great importance, the in vitro models are not only sufficiently appropriate but also able to incorporate different techniques for these studies. Several methods have been proposed as in vitro models for the extraction of cerebral pericytes, although an antibiotic-free protocol with high output is desirable. Most importantly, a method that has increased output per extraction reduces the usage of more animals.
Here, we propose a simple and efficient method for extracting cerebral pericytes with sufficiently high output. The mouse brain tissue homogenate is mixed with a BSA-dextran solution for the separation of the tissue debris and microvascular pellet. We propose a three-step separation followed by filtration to obtain a microvessel rich filtrate. With this method, the quantity of microvascular fragments obtained from 10 mice is sufficient to seed 9 wells (9.6 cm2 each) of a 6-well plate. Most interestingly with this protocol, the user can obtain 27 pericyte rich wells (9.6 cm2 each) in passage 2. The purity of the pericyte cultures are confirmed with the expression of classical pericyte markers: NG2, PDGFR-&#946; and CD146. This method demonstrates an efficient and feasible in vitro tool for physiological and pathophysiological studies on pericytes.

We present a protocol for the extraction of murine cerebral pericytes. Based on an antibiotic-free enrichment oriented pericyte extraction, this protocol is a valuable tool for in vitro studies providing high purity and high yield, thus decreasing the number of experimental animals used.

שיטת פלט גבוהה כדי לבודד קרום הלב של מוחין מהעכבר

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles

Skeletal muscle harbors distinct populations of adult stem cells that contribute to the homeostasis and repair of the tissue. Skeletal muscle stem cells (MuSCs) have the ability to make new muscle, whereas fibro-adipogenic progenitors (FAPs) contribute to stromal supporting tissues and have the ability to make fibroblasts and adipocytes. Both MuSCs and FAPs reside in a state of prolonged reversible cell cycle exit, called quiescence. The quiescent state is key to their function. Quiescent stem cells are commonly purified from multiple muscle tissues pooled together in a single sample. However, recent studies have revealed distinct differences in the molecular profiles and quiescence depth of MuSCs isolated from different muscles. The present protocol describes the isolation and study of MuSCs and FAPs from individual skeletal muscles and presents strategies to perform molecular analysis of stem cell activation. It details how to isolate and digest muscles of different developmental origin, thicknesses, and functions, such as the diaphragm, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GA), soleus, extensor digitorum longus (EDL), and the masseter muscles. MuSCs and FAPs are purified by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and analyzed by immunofluorescence staining and 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU) incorporation assay.

This protocol describes the isolation of muscle stem cells and fibro-adipogenic progenitors from individual skeletal muscles in mice. The protocol involves single muscle dissection, stem cell isolation by fluorescence activated cell sorting, purity assessment by immunofluorescence staining, and quantitative measurement of S-phase entry by 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine incorporation assay.

בידוד אוכלוסיות תאי גזע שקטים משרירי שלד בודדים

Skeletal muscle harbors distinct populations of adult stem cells that contribute to the homeostasis and repair of the tissue. Skeletal muscle stem cells ...