Name: detection of trypanosoma brucei variant surface glycoprotein switching by magnetic activated cell sorting and flow cytometry
Uploaded: 2016-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
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私たちは、トリパノソーマ、生物学上の一般的なアドバイスのためのジョージ・クロスを承認したいと思います。この作品はまた、DS、MRMへのNSF大学院研究フェローシップ（DGE-1325261）及びFNPにNIH / NIAID（助成金＃のAI085973）にビル・アンド・メリンダ・ゲイツ財団GCEの助成金によってサポートされていました。我々は、I-SCEI遺伝子と認識部位を含む菌株の使用をガラドリエルあばら家-マイナーに感謝します。

注：手順を通して、それを氷上で細胞を維持することが必要です。コールドメディアも全体で使用されるべきです。 1.サンプル収穫<ol><li> 100万/ mlの - 0.5の密度にリスター427株血流のトリパノソーマを成長させます。これは、寄生虫数の少ない培養を開始するのが最善の方法です。 1500×gで10分間、50×10 6細胞/サンプルをスピンダウン。正と負の抗体コントロールとして後で使用するために文化の中で1×10 6個の細胞を残すようにしてください。 注：このプロトコルは、（詳細説明を参照）、動物の血液から単離されたトリパノソーマに使用することができます。 </li><li>ピペットまたは上清の大部分を捨てる（約750μLを残します）。 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに細胞を移します。 </li><li>微量で5200×gで4分間、4℃で細胞をスピンし、上清を除去します。 </li></ol> 2.磁気標識<ol><li> 150μlの培養培地中で再懸濁細胞（HMI-9のwi適切な希釈で例えば番目血清）+一次抗VSG抗体。 注：抗VSG抗体は、家の中で作られ、1時50分の希釈で使用されています。フルオロフォアで標識されていない一次抗VSGの抗体を使用することが重要です。 </li><li> 10分間、4℃の低温室に8 - スピード6で渦アダプタ-60を使用して、渦細胞。血清で千μlの冷間HMI-9から800で洗います。 </li><li> 5200×gで4分間、4℃でスピンし、上清を吸引除去します。血清を1ミリリットルHMI-9で洗浄し、上記のようにスピン。上清を吸引除去します。血清とHMI-9の100μlの再懸濁ペレット。 </li><li> （MSC）マイクロビーズをソートする磁気活性化細胞の110μLを加えます。一次抗VSG抗体に応じて抗マウス、抗ウサギ、または抗ビオチンビーズを使用してください。よく混ぜます。 10分間、4℃の低温室での渦細胞。 </li><li>細胞はボルテックスされているが、分離磁石に1磁気活性化分離カラム/サンプルを設定します。再を持っているようにしてくださいフロースルーを収集する列の下ceptacle（私たちは15ミリリットルの遠心分離管を使用します）。低温室で装置を設定します。 </li><li>プライムカラムに血清を使用して、HMI-9の2ミリリットルを追加します。フロースルー各試料から収集する列の下に15ミリリットルの遠心分離管場所をプライミングした後。 </li><li>ステップ2.4で10分間インキュベーションした後、血清をコールドHMI-9 800〜μlを添加します。 5200×gで4分間、4℃でスピンし、上清を除去し、未結合抗体を除去します。血清およびリピートは100μlの上清を残して、HMI-9の1ミリリットルで洗浄します。 </li><li>激しく視覚的に遠心管をフリックペレットを完全に再懸濁されていることを確認するために、チューブを点検します。細胞が十分に再懸濁されていることを確認するには、上下の血清およびピペットでHMI-9の1ミリリットルを追加します。 </li></ol> 3.磁気分離<ol><li>上記のように列がプライミングされていることを確認します。カラムに細胞を適用します。フロースルー非支配VSを発現する細胞とを収集カラムを通って流れるように7分 - G. 1 mlの培地+トリパノソーマは、一般的に6を取ります。 </li><li>ウォッシュ血清とHMI-9の1ミリリットルで2回およびフロースルー同じチューブのステップ3.1のように集めます。 </li><li>除算フロースルー（3ミリリットル）2 1.5ミリリットルのマイクロチューブに。 注：これらは、後に組み合わせることができるか、半分など 、RNAを単離することができます</li><li>磁石から列を削除します。カラムに血清を使用して、HMI-9の3ミリリットルを追加し、開始、支配的なVSGを発現する細胞を得るために15ミリリットルの遠心分離管に列を急落。後の分析のために溶出した物質の300μLを削除します。氷の上でこれらの細胞を保管してください。 </li><li>陽性および陰性対照として使用するために、37℃で増殖対照細胞の出発培養物からの約100万個の細胞を取り1.5ml微量チューブに、それらをピペット（それらは頻繁に切り替えることが予想されていません）。 注：ポジティブコントロール細胞はステップ4.1でフルオロフォア標識抗体で染色されます。ネガティブコントロール細胞REMAプロトコルの残りの部分全体に染色されていないインチ</li><li>スピンフロースルーサンプルおよび抗体陽性対照試料4℃で4分間、5200×gで、上清を除去します。 注：溶出セルの別の300μlのアリコートを、抗VSG染色の陽性対照として使用することができます。 </li></ol> 4.染色は、汚染物質やスイッチャーを識別するために、 <ol><li>再懸濁し、フロースルーサンプルおよび100μlのHMI-9適切な希釈で血清+一次、フルオロフォア標識、抗VSG抗体とにおけるポジティブコントロール細胞。 注：標識抗VSG抗体は家で作られ、1の希釈で使用されている：1,000。フルオロフォア標識、抗VSGはstep.Thereは、ステップ3.5以下の二つのマイクロ遠心チューブ内のフロースルーサンプルの3ミリリットルであるべきMACS分離で非標識抗体と同じソースからすることができます。 </li><li>フローサイトメトリーによってフロースルーのすべてを分析するために、一方の再SUS 2マイクロ遠心チューブ内でペレットを結合血清+抗VSG抗体を使用して、HMI-9の100μl中のサンプルを保留中。よく混ぜます。 </li><li> 10分間、4℃の低温室での渦細胞。千μlの冷間HMI-9血清との - 800を追加します。スピンサンプル5200×gで4分間、4℃で、非結合抗体を除去するために、上清を除去します。 </li><li>血清とHMI-9の1ミリリットルで細胞を洗浄。スピンサンプル5200×gで4分間、4℃で、上清を除去します。この最後のスピンの間に、ステップ3.4および陰性対照試料から溶出し、サンプルをスピンダウン。 </li><li>血清で148.5μlのHMI-9、25μlの絶対計数ビーズと1.5μlのヨウ化プロピジウム染色溶液（175μlの合計）：内のすべてのフロースルーと溶出サンプルを再懸濁します。 175μlの正および負の抗体対照試料を再懸濁HMI-9の血清で。絶対計数ビーズ/使用される特定のロットの25μlの数を記録してください。 </li><li>フローサイトメーターを介してすべてのサンプルを実行し、データを収集します。死細胞は、PIとして染色します<sup&gt; +。 VSGの+ - PIなどの汚染物質の染色。 VSG - -スイッチャーは、PIとして染色8。 </li><li>フローサイトメトリーデータを使用してスイッチング周波数計算します。 注：スイッチング周波数を計算する方法については、補足ファイルを参照してください<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54715/Flow_Cytometry_Calculations.docx" target="_blank">フローサイトメトリーCalculations.docx</a>および表1。 </li></ol>

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	<li>Horn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+variation+in+African+trypanosomes.">Antigenic variation in African trypanosomes.</a> Molecular &amp; Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).</li><li>Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antigen+switching+rates+in+Trypanosoma+brucei.">Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).</li><li>Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+exchange+can+be+an+important+mechanism+of+variant+surface+glycoprotein+gene+switching+in+Trypanosoma+brucei.">Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 80 (1), 65-75 (1996).</li><li>Turner, C. M., Barry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei+rhodesiense+infections.">High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections.</a> Parasitology. 99 (Pt 1), 67-75 (1989).</li><li>Miller, E. N., Turner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antigenic+types+appearing+in+first+relapse+populations+of+clones+of+Trypanosoma+brucei.">Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 82 (1), 63-80 (1981).</li><li>Horn, D., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Trypanosoma+brucei+vsg+expression+site+switching+in+vitro.">Analysis of Trypanosoma brucei vsg expression site switching in vitro.</a> Mol Biochem Parasitol. 84 (2), 189-201 (1997).</li><li>Figueiredo, L. M., Janzen, C. J., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+histone+methyltransferase+modulates+antigenic+variation+in+African+trypanosomes.">A histone methyltransferase modulates antigenic variation in African trypanosomes.</a> PLoS Biol. 6 (7), e161 (2008).</li><li>Boothroyd, C. E., Dreesen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast-endonuclease-generated+DNA+break+induces+antigenic+switching+in+Trypanosoma+brucei.">A yeast-endonuclease-generated DNA break induces antigenic switching in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 459 (7244), 278-281 (2009).</li><li>Engstler, M., Pfohl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+Flow-Mediated+Protein+Sorting+on+the+Cell+Surface+of+Trypanosomes.">Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes.</a> Cell. 131 (3), 505-515 (2007).</li><li>Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vivo+dynamics+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei.">The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei.</a> Science. 347 (6229), 1470-1473 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

実験技術に関しては、プロトコルの最も重要なコンポーネントは、冷たいすべてのサンプルを保っています。トリパノソーマは非常に迅速に、それらの表面9に結合した抗体の内在化が、このプロセスは、運動性に依存し、細胞を4℃に維持される限り、アッセイに影響を及ぼしません。全てのサンプルは、常に氷上で保存されるべきで、ピペッティングを25℃の実験室環境への暴露を最小限にするために迅速に行われるべきです。コールドHMI-9血清では、実験の開始時に利用可能であるべきであり、全体を通して氷上に保持する必要があります。カラムを通って1ミリリットルのサンプルを実行するには、7分 - それは5を取るように、列の上にそれらを実行して、トリパノソーマの単離は、低温室で行わなければなりません。利用可能な磁気分離ユニットよりも多くのサンプルが存在する場合、磁気分離であれば積極的に分離されていない試料を氷上に保持されるように、順序で行うことができます。 試料が非常によく混合AFであることも重要です磁石上のマイクロビーズと、単離前にとのインキュベーション後の最後の洗浄ター。これは、遠心分離管または光ボルテックスを積極的にフリックすることによって達成することができます。細胞のいかなるペレットまたは塊が前に光学顕微鏡レベルで見てチェックすることができます分離カラムへの試料の添加に見えてはいけません。塊が存在する場合、ドミナントVSGを発現する細胞のフロースルーサンプル中の汚染レベルは、通常、望ましいよりもはるかに高いです。プロトコルの終わりに、試料中のスイッチャーの数の計算を行う際には、すべてのフロースルーは、フローサイトメトリー分析のために使用されたかどうかを考慮することが重要である、または半分が使用されたかどうか。半分だけを使用した場合、計算されたスイッチャの総数が2で乗算されるべきです。 洗浄工程の間に上清を除去した場合、最後の一滴をオフにピペットする必要がなく、一般的に15から25μlをしています細胞のペレットを囲む左。非常に少ない切り替えセルがあるので、この時点では、ペレットはほとんどフロースルーサンプルでは見られないので、これは、染色及び洗浄の最終段階において特に重要です。 最終的な抗VSG染色は、典型的には精製された、フルオロフォア標識抗VSGの抗体を用いて行われている間、前の磁気分離の最初の抗VSG染色は、精製された抗体または血清を用いて行うことができます。我々はまた、抗VSGの抗体を発現するハイブリドーマ由来のバイオリアクター上清を使用しています。かかわらず、最初の染色のために使用される材料は、行うまたはドミナント、開始VSGを発現しない細胞の良好な分離を確実にするために滴定する必要があります。 これは、支配的なVSGを発現する細胞で汚染されるように、フロースルー中の細胞の集団に典型的です。この汚染は最小限であるべきであるが、人口が発現する細胞を完全に欠いであるために、私たちの経験では稀です支配的なVSGをる。単離手順を経た細胞の手順ではなかったものとして、抗VSG抗体と同様に明るく染色されないことに留意することも重要です。我々は2つのものが、この違いを説明することができると仮定しました。最初は、トリパノソーマ紡糸するVSGの脱落につながる、そして単離手順に関与する多くのスピンが存在することです。これは、最終抗VSG染色のための信号の強度を減少することが予想されます。第二は、プロトコルの最初のステップは、一次抗VSG抗体を用いて染色を含むことです。この最初の工程で使用した抗体によって認識されるエピトープは、最終染色抗体によって認識されるエピトープと同じかまたは閉塞されている場合、一方が信号の強度が唯一の抗体を使用した場合よりも低いことが予想されます。この理由は、陽性に染色された細胞からの信号は、大きく2であるように、最終段階で使用される抗体を滴定することが重要です負染色された細胞に比べて桁違いに高いです。この方法は、陽性に染色セルからの信号の強度が単離手順を受けた細胞において減少しても、これらの陽性細胞はまだよく、フローサイトメトリープロット上の陰性細胞から分離されます。自動補償が使用されている場合、単一の染色対照試料を調製する必要があります。我々が生成した抗体は、メモリアル・スローンがんセンターするモノクローナル抗体の施設からご購入いただけます。私たちは、非標識モノクローナルIgG抗体を用いた最高の成功を収めています。我々は、ポリクローナルVSG抗体でプロトコルを実行した、ポリクローナル抗体は、時々そのように、モノクローナル抗体が好ましいが、他のVSGを認識することができます。 VSGのアイデンティティは、VSG 3&#39;UTRおよびスプライスさリーダーで保存された配列の増幅から生成されたシーケンシングVSG cDNAによって決定することができます。特定の抗体は、以前に単離された切り替えの特異性について試験することができますVSGのアイデンティティの細胞だけで説明したように決定されています。 ここに提示プロトコルは、多くの利点を有します。後の分析のためにスイッチャーを単離するために、所定の集団におけるスイッチャの数を定量化するための両方に使用することができます。また限り抗体は、その変異体のために利用可能であるように、関心対象の特定の変異体を単離することができます。これは、動物から単離されたトリパノソーマを使用して、この手順を行うことも可能であり、赤血球は、メーカーのプロトコールに従って、抗TER119コーティングされた磁気ビーズを使用して除去されることを条件とします。私たちは、必要なトリパノソーマ数の下限をテストしていないが、我々が正常に2.5使用してプロトコルを実施してきた - 血液250μlのから千万トリパノソーマを。最後に、プロトコルは、所与の集団内のスイッチング周波数を得るために、変動解析と組み合わせて使用​​することができます。 単離手順は非常にfとAST、3取って - このようにサンプル数に応じて、最初から最後まで4時間、およびは、マウスまたは薬剤耐性マーカーを含む特殊な菌株の前に予防接種を必要とし、従来の方法よりも効率的です。この方法は、出発VSGに対する抗体は、しかしながら、必要とされるという事実によって制限されます。このような試薬がなければ、このようなVSG-seqのよう別の方法は、のVSGは、所定の集団10で表現されているかを把握するために、より適切な選択かもしれません。

寄生原虫、 トリパノソーマは 、サハラ以南のアフリカ全域（ トリパノソーマブルセイを介して）や動物（ トリパノソーマガンビアとトリパノソーマローデシア経由）人間に影響を与える疾患の原因物質です。なお、ツェツェバエベクターの唾液を介して哺乳動物宿主に伝達されます。人間と動物、アフリカトリパノソーマ症の両方が流行地域に深刻な経済的負担を引き起こす、といくつかの薬が利用可能であるか、またはいずれかの疾患を治療するために開発中です。免疫回避のメカニズムを理解することは、トリパノソーマ症用薬の開発のために重要です。寄生虫をカバーして密な、バリアント表面糖タンパク質（VSG）コートの抗原性の変化は、主要な手段の一つであることでT.トリパノソーマは、哺乳類の抗体応答を逃れます。 VSG遺伝子の約2,000の変異体は、トリパノソーマのゲノムに存在するが、一つだけは〜15 EXPRESの1から任意の時点で転写されますシオンサイト。表現VSGの「切り替えは、「アクティブ発現部位にVSG遺伝子をコピーすることによって、または（1件）以前にサイレント発現部位の転写活性化のいずれかによって発生する可能性があります。 多くの仕事は、Tにおける抗原変異を理解することに専念してきたがトリパノソーマは 、スイッチング周波数の影響を与える要因は、まだよく理解されていません。これまでの研究では、約10 6セル2 1の順に、スイッチングがインビトロで確率的に発生している間、スイッチング周波数が非常に低いという事実によって妨げられてきました。これは、それが困難なスイッチングが最初の場所で検出が困難であるため、スイッチング周波数を減少させ、所定の係数が大きくなるかどうかを測定することができます。 2009年以前には、所定の集団でスイッチャーを単離するための方法は、長く、労働集約的でした。これらには、が支配的VSGに対して免疫化したマウスを通じてトリパノソーマを継代した後、細胞を回収日後3、または免疫蛍光4,5によって細胞の数百を数えます。別の戦略は、スイッチャー6を単離するために、薬剤耐性の選択に依存しています。 インビトロで増殖アフリカトリパノソーマは、典型的には、1つの主要な変異体、および代替変異体を発現スイッチャのはるかに小さい人口を表現する大集団で構成されているので、我々は支配的な、出発VSGとしてこの論文を通じて、主要なバリアントを参照してください。そうすることで、私たちは決してこの主要な変異体は、集団内の他の変異体よりも大きな適応度を持っていることを暗示したいです。 4時間 - ここでは、確実に3に与えられた集団における非支配的なVSGを発現しているトリパノソーマの数を測定することができる方法について説明します。この方法は、1つの与えられた遺伝子操作または薬物治療が集団に切り替え細胞の数を増加させるかどうかを確認したい場合に特に有用です。代わりにDOを発現する細胞の集団をなくししますminantは、薬を介して、または免疫学的手段によってVSGを開始し、これらの細胞を最初に支配VSGに対する抗体に結合された磁気ビーズでそれらをコーティングした後、磁気カラム上でそれらを分離することによって除去されます。切り替え集団は、フロースルーに回収し、汚染物質を識別するためのフルオロフォア標識した抗VSG抗体で再度染色します。定量化は、細胞に対するビーズの比を決定し、集団7にスイッチャの数を定量するために使用することができるように、各サンプルの絶対計数ビーズの定義された数を加算することによって達成されます。

<table><tbody><tr><td>unlabeled anti-VSG antibody</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>VSG antibody is made in house</td></tr><tr><td>fluorophore labeled anti-VSG antibody</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>VSG antibody is made in house</td></tr><tr><td>HMI-9 media</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>HMI-9 is made in house</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>BD Pharmingen</td><td>556463</td><td></td></tr><tr><td>CountBright absolute counting beads</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>LD columns</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>MACS magnet</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MACS magnetic separator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>vortex adapter-60</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>AM10014</td><td></td></tr><tr><td>flow cytometer</td><td>Coulter</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>flow cytometer analysis software</td><td>FloJo</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

detection of trypanosoma brucei variant surface glycoprotein switching by magnetic activated cell sorting and flow cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

ここで説明する方法は、VSG発現部位内の二本鎖切断は、人口8にスイッチャーの数を増加させたことを実証しました。ここでは、同様に発現部位で二本鎖切断を生成するように誘導されているトリパノソーマの集団からの代表的結果を示します。私たちは、二本鎖切断を生成するように誘導されていないものにこれらのトリパノソーマを比較する。 図1は、フロースルーの列をソートする磁気活性化細胞からに集め、非誘導し、誘導された細胞からのプロット代表的なフローサイトメトリーを示しています。この特定の実験のために支配的な出発VSGはVSG2ました。 図1Aの左側のパネルは、前方に表示され、ゲートが生細胞の特徴である前方および側方散乱シグネチャを示す絶対計数ビーズと細胞の周りに描かれることを可能にする側方散乱、。ゲートができることに注意してください死細胞はPI染色を用いて除去することができるので、より多くの細胞を含むように描かれます。しかし、ゲートがすべての試料について同じに維持されなければなりません。 図1Aの右側のパネルには、左側のパネルにある「ライブ」のゲートに入る細胞のみを示します。 PI（Q1とQ2）に対して陽性染色細胞は死んだ細胞です。第3四半期にPIのために積極的に支配的なVSGおよび負染色細胞が汚染物質です。第4四半期にPIと支配的なVSGの両方に負染色細胞は、切り替えた生細胞です。一つは、第3四半期中の汚染物質の割合は、二本鎖切断が誘導されたそれらの細胞のために低くなっていることを観察することができます。しかし、第3四半期のパーセンテージは、所定の集団内のより多くのスイッチャーがあるかどうかを推測するために使用することはできません。それは唯一のスイッチング周波数を計算することができることを集めたビーズの数をQ4での細胞数の比を比較することである。 表1は、FLOから得られた数値を示していますワットサイトメトリープロットおよび方法は、これらの集団のパーセントスイッチャーを計算します。これらの計算は、図1Bに表示された観察されたスイッチング周波数を得るために3生物学的サンプルについて行きました。非支配的なVSGに切り替えた6×10 -3細胞- 1でブレーク結果を誘導しながら、9.53×10 -5の平均で、ここで計算されるようなin vitroでの確率論的スイッチングのレベルは、非常に低いです。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54715/54715fig1.jpg" /> 図1. 単離と交換トリパノソーマ集団の定量化。 （A）、磁気活性化細胞選別カラム上の非スイッチャの選択以下のフロースルー画分にトリパノソーマの画分を示すフローサイトメトリー。誘導されたI-SCEI二本鎖切断が誘導BREずに細胞の集団と比較すると細胞の集団AK。（B）I-SCEIの二本鎖切断を用いて誘導されていないか、またはしている細胞の周波数を切り替えて計算されます。プロット上の数は、両側検定、対応のないt検定の結果を表します。エラーバーはSDを表す。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54715/54715fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 補足ファイル1.フローサイトメトリーの計算。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54715/Flow_Cytometry_Calculations.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/54715/54715tbl1.jpg" /> スイッチング周波数の表1計算。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54715/54715tbl1large.jpg" target="_blank">この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

の検出<em&gt;トリパノソーマ</em磁気活性化細胞選別し、フローサイトメトリーによって&gt;バリアント表面糖タンパク質の切り替え

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

detection-trypanosoma-brucei-variant-surface-glycoprotein-switching

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

8.7K ビュー.  Rockefeller University. African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

ビデオ: Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

脳から隔離された白血球の単離と解析<em&gt;マラリアベルゲイ</em&gt; ANKA感染マウス

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

免疫・感染学

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in cattle1. The parasite alternates between the bloodstream of the mammalian host and the tsetse fly vector. The composition of many cellular organelles changes in response to these different extracellular conditions2-5.
Glycosomes are highly specialized peroxisomes in which many of the enzymes involved in glycolysis are compartmentalized. Glycosome composition changes in a developmental and environmentally regulated manner4-11. Currently, the most common techniques used to study glycosome dynamics are electron and fluorescence microscopy; techniques that are expensive, time and labor intensive, and not easily adapted to high throughput analyses.
To overcome these limitations, a fluorescent-glycosome reporter system in which enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) is fused to a peroxisome targeting sequence (PTS2), which directs the fusion protein to glycosomes12, has been established. Upon import of the PTS2eYFP fusion protein, glycosomes become fluorescent. Organelle degradation and recycling results in the loss of fluorescence that can be measured by flow cytometry. Large numbers of cells (5,000 cells/sec) can be analyzed in real-time without extensive sample preparation such as fixation and mounting. This method offers a rapid way of detecting changes in organelle composition in response to fluctuating environmental conditions.

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

アフリカトリパノソーマにグライコダイナミクスを監視する蛍光タンパク質を使用した

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an exponential increase in the proportion of malaria infected RBCs, known as parasitemia. We describe a flow cytometry based protocol which utilizes a combination of the DNA dye Hoechst, and the mitochondrial membrane potential dye, JC-1, to identify RBCs which contain parasites and therefore the parasitemia, of in vivo blood samples from Plasmodium chabaudi adami DS infected mice. Using this approach, in combination with fluorescently conjugated antibodies, parasitized RBCs can be distinguished from leukocytes, RBC progenitors, and RBCs containing Howell-Jolly bodies (HJ-RBCs), with a limit of detection of 0.007% parasitemia. Additionally, we outline a method for the comparative assessment of merozoite invasion into two different RBC populations. In this assay RBCs, labeled with two distinct compounds identifiable by flow cytometry, are transfused into infected mice. The relative rate of invasion into the two populations can then be assessed by flow cytometry based on the proportion of parasitized RBCs in each population over time. This combined approach allows the accurate measurement of both parasitemia and merozoite invasion in an in vivo model of malaria infection.

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

The malaria parasite invades and replicates within red blood cells. The accurate assessment of merozoite invasion and parasitemia is therefore crucial in assessing the course of malaria infection. Here we describe a flow cytometry based protocol for the measurement of these parameters in a mouse model of malaria.

フローサイトメトリーによるげっ歯類マラリア原虫のin vivo評価とメロゾイト侵略で

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

磁気変調バイオセンシングシステムを用いた生物学的アッセイの迅速な均質な検出

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

生物学

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.
Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.
Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

アフリカトリパノソーマ症の後期感染を検出するための生物発光イメージング

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

ハイスループット遺伝子タギングで<em&gt;トリパノソーマ</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is the best method for diagnosis of first stage HAT and furthermore this parasite purification method permits serological and research investigations.
HAT is caused by Tsetse fly transmitted Trypanosoma brucei gambiense and T. b. rhodesiense. Related trypanosomes are the causative agents of animal trypanosomiasis. Trypanosome detection is essential for HAT diagnosis, treatment and follow-up. The technique described here is the most sensitive parasite detection technique, adapted to field conditions for the diagnosis of T. b. gambiense HAT and can be completed within one hour. Blood is layered onto an anion-exchanger column (DEAE cellulose) previously adjusted to pH 8, and elution buffer is added. Highly negatively charged blood cells are adsorbed onto the column whereas the less negatively charged trypanosomes pass through. Collected trypanosomes are pelleted by centrifugation and observed by microscopy. Moreover, parasites are prepared without cellular damage whilst maintaining their infectivity.
Purified trypanosomes are required for immunological testing; they are used in the trypanolysis assay, the gold standard in HAT serology. Stained parasites are utilized in the card agglutination test (CATT) for field serology. Antigens from purified trypanosomes, such as variant surface glycoprotein, exoantigens, are also used in various immunoassays. The procedure described here is designed for African trypanosomes; consequently, chromatography conditions have to be adapted to each trypanosome strain, and more generally, to the blood of each species of host mammal.
These fascinating pathogens are easily purified and available to use in biochemical, molecular and cell biology studies including co-culture with host cells to investigate host-parasite relationships at the level of membrane receptors, signaling, and gene expression; drug testing in vitro; investigation of gene deletion, mutation, or overexpression on metabolic processes, cytoskeletal biogenesis and parasite survival.

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns

This method of trypanosome separation from blood depends on their surface charge being less negative than mammalian blood cells. Infected blood is placed and treated on an anion-exchanger column. This method, the most fitting diagnostic for African trypanosomiasis, provides purified parasites for immunological, biological, biochemical, pharmaceutical and molecular biology investigations.

陰イオン交換器 (ジエチルアミノエチル セルロース列) による血中からのアフリカを含む細胞外の Trypanosomes の精製

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...

Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration

Fine Needle Aspiration (FNA) is a routine diagnostic procedure essential to both medical and veterinary practices. It consists of the percutaneous aspiration of cells and/or microorganisms from palpable masses, organs or effusions (fluid accumulation in a body cavity) using a thin needle similar to the regular needle used for the venous puncture. The material collected by FNA is in general highly cellular, and the retrieved aspirate is then smeared, air dried, wet-fixed, stained and observed under a microscope. In the clinical context, FNA is an important diagnostic tool that serves as a guide to the appropriate therapeutic management. Because it is simple, fast, minimally invasive and requires limited investment in the laboratory and human resources, it is extensively used by veterinary practitioners, mostly in domestic, but also in farm animals. In studies using animal models, FNA has the advantage that it can be performed repeatedly in the same animal, enabling longitudinal studies through the collection of cells from tumors and organs/tissues over the course of the disease. In addition to routine microscopy, retrieved material can also be used for immunocytochemistry, electron microscopy, biochemical analysis, flow cytometry, molecular biology or in vitro assays. FNA has been used to identify the protozoan parasite Trypanosoma brucei in the gonads of infected mice, opening the possibility for a future diagnosis in cattle.

Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration

Fine Needle Aspiration is a technique, whereby cells are obtained from a lesion or organ using a thin needle. Aspirated material is smeared, stained and examined under a microscope for diagnosis or used for molecular biology, cytometry or in vitro analysis. It is cheap, simple, quick and causes minimal trauma.

細針吸引による血管外トリパノノーマ寄生虫の検出

Fine Needle Aspiration (FNA) is a routine diagnostic procedure essential to both medical and veterinary practices. It consists of the percutaneous ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by naturally acquired IgG antibodies specific for VAR2CSA. VAR2CSA is the parasite antigen that mediates the selective sequestration of IEs in the placenta that can cause a severe form of malaria in pregnant women, called placental malaria (PM). Protection from PM is mediated by VAR2CSA-specific antibodies that are believed to function by inhibiting placental sequestration and/or by opsonizing IEs for phagocytosis. The assay employs late-stage-synchronized IEs that have been selected in vitro to express VAR2CSA, plasma/serum-antibodies from women with naturally acquired PM-specific immunity, and the phagocytic cell line THP-1. However, the protocol can easily be modified to assay the functionality of antibodies to any parasite antigen present on the IE surface, whether induced by natural exposure or by vaccination. The assay offers simple and high-throughput evaluation, with good reproducibility, of an important functional aspect of antibody-mediated immunity in malaria. It is, therefore, useful when evaluating clinical immunity to P. falciparum malaria, a major cause of morbidity and mortality in the tropics, particularly in sub-Saharan Africa.

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The overall goal of this protocol is to provide instruction on how to measure the capacity of antibodies present in sera or plasma of individuals, naturally exposed to Plasmodium falciparum infection, to opsonize and induce phagocytosis of the parasite-infected erythrocytes (IEs).

フローサイトメトリーベースアッセイによる熱帯 熱マラリア原 虫に対する自然獲得食細胞症誘導抗体の測定

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

Trypanosoma bruceiにおけるグリコソームpHのためのpHluorin2を用いたセンサの開発

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. Little is known about the cellular responses generated when environmental glucose levels change. In both bloodstream and procyclic form (insect stage) parasites, glycosomes house most of glycolysis. These organelles are rapidly acidified in response to glucose deprivation, which likely results in the allosteric regulation of glycolytic enzymes such as hexokinase. In previous work, localizing the chemical probe used to make pH measurements was challenging, limiting its utility in other applications.
This paper describes the development and use of parasites that express glycosomally localized pHluorin2, a heritable protein pH biosensor. pHluorin2 is a ratiometric pHluorin variant that displays a pH (acid)-dependent decrease in excitation at 395 nm while simultaneously yielding an increase in excitation at 475 nm. Transgenic parasites were generated by cloning the pHluorin2 open reading frame into the trypanosome expression vector pLEW100v5, enabling inducible protein expression in either lifecycle stage. Immunofluorescence was used to confirm the glycosomal localization of the pHluorin2 biosensor, comparing the localization of the biosensor to the glycosomal resident protein aldolase. The sensor responsiveness was calibrated at differing pH levels by incubating cells in a series of buffers that ranged in pH from 4 to 8, an approach we have previously used to calibrate a fluorescein-based pH sensor. We then measured pHluorin2 fluorescence at 405 nm and 488 nm using flow cytometry to determine glycosomal pH. We validated the performance of the live transgenic pHluorin2-expressing parasites, monitoring pH over time in response to glucose deprivation, a known trigger of glycosomal acidification in PF parasites. This tool has a range of potential applications, including potentially being used in high-throughput drug screening. Beyond glycosomal pH, the sensor could be adapted to other organelles or used in other trypanosomatids to understand pH dynamics&#160;in the live cell setting.

著者スポットライト:pHluorin2バイオセンサーを使用した Trypanosoma brucei のグリコソームpHモニタリングの進歩

We describe a method to study how pH responds to environmental cues in the glycosomes of the bloodstream form of African trypanosomes. This approach involves a pH-sensitive heritable protein sensor in combination with flow cytometry to measure pH dynamics, both as a time-course assay and in a high-throughput screen format.

生きているTrypanosoma bruceiの動的グリコソームpH変化の測定

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

の検出

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脳から隔離された白血球の単離と解析

アフリカトリパノソーマにグライコダイナミクスを監視する蛍光タンパク質を使用した

フローサイトメトリーによるげっ歯類マラリア原虫のin vivo評価とメロゾイト侵略で

磁気変調バイオセンシングシステムを用いた生物学的アッセイの迅速な均質な検出

アフリカトリパノソーマ症の後期感染を検出するための生物発光イメージング

ハイスループット遺伝子タギングで

陰イオン交換器 (ジエチルアミノエチルセルロース列) による血中からのアフリカを含む細胞外の Trypanosomes の精製

細針吸引による血管外トリパノノーマ寄生虫の検出

フローサイトメトリーベースアッセイによる熱帯熱マラリア原虫に対する自然獲得食細胞症誘導抗体の測定

生きているTrypanosoma bruceiの動的グリコソームpH変化の測定

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アフリカトリパノソーマにグライコダイナミクスを監視する蛍光タンパク質を使用した

フローサイトメトリーによるげっ歯類マラリア原虫のin vivo評価とメロゾイト侵略で

磁気変調バイオセンシングシステムを用いた生物学的アッセイの迅速な均質な検出

アフリカトリパノソーマ症の後期感染を検出するための生物発光イメージング

ハイスループット遺伝子タギングで

陰イオン交換器 (ジエチルアミノエチル セルロース列) による血中からのアフリカを含む細胞外の Trypanosomes の精製

細針吸引による血管外トリパノノーマ寄生虫の検出

フローサイトメトリーベースアッセイによる熱帯 熱マラリア原 虫に対する自然獲得食細胞症誘導抗体の測定

生きているTrypanosoma bruceiの動的グリコソームpH変化の測定

陰イオン交換器 (ジエチルアミノエチルセルロース列) による血中からのアフリカを含む細胞外の Trypanosomes の精製

フローサイトメトリーベースアッセイによる熱帯熱マラリア原虫に対する自然獲得食細胞症誘導抗体の測定