Name: the mouse isolated perfused kidney technique
Uploaded: 2016-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
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The authors would like to thank Hans-Joachim Schurek for invaluable scientific advice. The authors would like to thank Monique Carrel and Mich&#232;le Heidemeyer for excellent technical assistance, David Penton Ribas and Nourdine Faresse for a critical reading of the manuscript and Carsten Wagner and J&#252;rg Biber for the NaPi-2a antibody. This work was supported by the Swiss National Centre for Competence in Research "Kidney.CH" and by a project grant (310030_143929/1) from the Swiss National Science Foundation.

この原稿に記載された動物に関わるすべての手順は、スイスの法律に基づいて行われ、チューリッヒ、スイスのカントンの動物への投与によって承認されました。 1.バッファの準備<ol><li> 4および抗利尿ホルモン（ADH）溶液（ 表1） -ソリューション1を準備します。 </li><li>透析緩衝液（ 表1）を準備します。 注：これは、灌流中に透析緩衝液として使用されるバッファです。その後、赤血球は、最終的な灌流液を形成するために、この緩衝液で希釈されます。 </li><li>赤血球製剤。 <ol><li>透析緩衝液で500ミリリットルにヒト赤血球濃厚液（ローカル血液バンクから得られた試​​験した材料）の250ミリリットルを希釈します。 8分間、2000×gで遠心分離します。任意の赤血球を除去しないように注意して、バッファを削除してください。 3回繰り返します。 </li></ol></li><li>バッファ;アルブミン（BSAウシ血清アルブミン）を準備します。 <ol><li> dialysiの200ミリリットルでバッファ、攪拌棒を用いてBSA 44gのを溶かします。ろ紙を用いて溶液をフィルタリングします。 </li></ol></li><li>灌流液を準備します。 <ol><li> BSA緩衝液に濾紙ステップ1.3.1から赤血球をフィルタリングします。透析緩衝液で800ミリリットルの全容量まで記入してください。 注：これは、最終的な灌流液です。ヘマトクリットは現在8と12％の間であるべきです。灌流液は4℃で最大12時間保存することができます。 </li></ol></li></ol> 2.開始透析と酸素化<ol><li>より大きなバッファ容器、小さいバッファ容器、及び湿室を37℃に（小、二重壁チャンバは後で腎臓を保持するために37℃、湿度100％にした）周囲の水浴をオンにします（ 図2） 。 </li><li>透析緩衝液と灌流液と小さい容器と、より大きなバッファ容器を埋めます。 </li><li>透析緩衝液に5％CO 2/95％O 2ガス流入をオンにします。 </li><li>透析緩衝液に対して灌流液の連続透析に切り替えます。低フラックス透析チューブを使用するように注意してください。ステップ3に進みます。 </li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig2.jpg" /> 図2：灌流回路の模式図。スキームは、灌流回路の主要な構成要素とバッファフローの方向を示しています。濃い青で囲まれたすべてのコンポーネントは、水浴/サーモスタットで37℃に維持されています。 1：灌流バッファーの少なくとも3倍容量の透析バッファーを連続的に95％O 2/5％CO 2でバブリングします。 2：透析緩衝液および灌流緩衝液を連続的にローラーポンプにより透析チューブに互いに対して透析します。 3：これにより透析に、灌流バッファはO 2/5％CO 2および電解質のレベルを一定にthroughoを維持している9％に濃縮されていますutの灌流。 4：ローラーポンプは、腎臓に向かって灌流バッファを推進します。 5：ウインドケッセルは蠕動波を除去し、気泡トラップとして機能します。 6：（自由に交互の流れを可能にしながら、連続的な圧力を維持するために4（ローラーポンプ）に接続された）圧力トランスデューサ。 7：灌流を通して、腎臓は100％の空気湿度および37℃の腎臓温度のために湿ったチャンバ内に残っています。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54712/54712fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 3.外科的手順パート1（すべての合字の図については、図3を参照してください） 注：5-0手術用糸を使用して、すべての合字を実行します。 <ol><li>腹腔内注射によってマウス（0.9％のNaClに溶解した体重の20mg / mlのケタミンおよび1mg / mlのキシラジンの10μL/ g）を麻酔。 anesthの十分な深さを確認リア足の反射の欠如のためにテストすることによりESIA。 </li><li>湿室中仰臥位でマウスを修正しました。獣医軟膏で目を保護します。腰椎血管を上昇させるために背骨の下に1ミリリットル注射器を置きます。 </li><li>はさみで、その後、腹部の筋肉、胸骨開口最初の皮膚に恥骨稜から正中開腹術を行います。 </li><li>腸を削除し、腹部からのマウスの横方向の左側に配置します。 </li><li>結合組織から膀胱を解放し、尿管及び尿道の両方を探ります。 </li><li>左尿管（リガチャーI）の周りの合字を置きます。それを閉じます。 </li><li>尿道（リガチャーII）の周りの合字を置きます。それを閉じます。 </li><li>全膀胱（リガチャーIII）の周りに「投げ縄」リガチャーを置きます。 </li><li>膀胱に1ミリメートルを切開。 </li><li> 2cmのPE 50チューブを開口部にカニューレを挿入。 </li><li>チューブの周りに閉じるリガチャーIII。 </li><li>合字から左尿管及び尿道の先端をカットします。宣伝ちらしデルは、今だけ、自由に移動し、右尿管に取り付けられています。 </li><li>結合組織および脂肪の腹部大動脈をクリアします。 </li><li>腹半ば大動脈結紮（リガチャーIV）を配置します。 </li><li>上腸間膜動脈および腹腔動脈（リガチャーV）との間に横隔膜下の大動脈の周りに結紮糸を配置します。 </li><li>上腸間膜動脈（リガチャーVI）の周りの合字を置きます。 </li><li>直接右下のと左腎動脈（リガチャーVII）上記の大動脈結紮糸を配置します。 </li><li>尾静脈パッケージ（カヴァ）（リガチャーVIII）の周りの合字を置きます。ステップ4に進みます。 </li></ol><img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig3.jpg" /> 図3：手術中に配置された合字の模式図。開腹手術後の開いた腹部のビュー。腸を左に出て移動されます。 L及びRは 、左右の腎臓を示します。ザ黒い線は、それぞれの合字の区域を示します。合字は、最初に配置し、テキストに与えられた順序で、閉じています。 Xは、大動脈カニューレ挿入のための切開の位置をマークします。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54712/54712fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 灌流回路の4プライミング<ol><li>ロータリーポンプを起動し、灌流液でチューブを埋めます。それから、すべての気泡を空にするように注意してください。 </li><li>灌流液とのほぼ中間のレベルにウインドケッセルデバイスを記入してください。 </li><li>すべてのチューブは充填され、フローがこの時間の間に腎臓レベルで灌流針を保管してください0であるときに0ミリメートルHgまで圧力変換器を校正。 </li><li>一定の最低レベル（0.6ミリリットル/分）で流れを維持し、ステップ5に進んでください。 </li></ol> 5.外科的手順パート2 <ol><li>リガチャーIVおよび左レナの分岐の間にクランプを置きリットル動脈。 </li><li>背壁を切らないように注意しながら、リガチャーIVの大動脈尾側に小さな切開を行います。 </li><li>血管拡張器と大動脈の開口部を拡張。 </li><li>針で大動脈にカニューレを挿入（長さ2cm、PE 50を引っ張って）、ちょうどクランプに先端をプッシュ。 </li><li>クランプを開きます。 </li><li>それは右腎動脈と大動脈の接合部に到達するまで頭側針の先端を押してください。 </li><li>閉じる結紮VII。 </li><li>合字IVを閉じます。 </li><li>ダイアフラムを解剖することによりハサミで胸を開きます。シングルカットでは、大動脈、大静脈、心臓や栄養神経を分離します。このステップでは、動物は、連続深麻酔下での急速な失血を経て犠牲になります。 </li><li>灌流ポンプの圧力制御を開始します。 80と100 mmHgの間の平均圧力を維持します。 </li><li>閉じるリガチャーV. </li><li>閉じるリガチャーVI。 </li><li>閉じるリガチャーVIII。 </li><li>結合TISSUから無料右の腎臓eとはさみで脂肪カプセル内への埋め込み。 </li><li>リガチャーVに近位大動脈をカット</li><li> VIを結紮糸遠位に上腸間膜動脈をカット。 </li><li>容器に身を切らないように注意しながら、腎臓支持維管束を切り出します。 </li><li>腎臓への接続時に肝臓をカットします。腎臓を解放するように注意してください、しかし、大静脈は、それによって開いたままにされるように、それに肝付着の小さな部分を残します。 </li><li>マウスのうち、腎臓バンドルしてください。湿ったチャンバーからマウスを外します。 </li><li>肝臓と腎臓（リガチャーIX）の接続の周りに「投げ縄」リガチャーを置きます。 </li><li>静脈ライン（2cmのPE 50）との大静脈にカニューレを挿入。 </li><li>閉じるリガチャーのIX。静脈ラインを通る静脈流出はすぐに開始する必要があります。 </li><li>モイストチャンバーを閉じます。 </li></ol> 6.ダウンストリーム分析<ol><li>以下の時間の間、継続的に血流とintravasculを監視Ar圧力15。分析のために使用することができる静脈流出、例えば、腎臓のレニン放出7を集めます。電解質濃度と糸球体濾過率14の分析のための尿を収集します。灌流の1時間後、腎臓をウェスタンブロッティングのためにスナップ凍結させることができるか、イメージングのために固定することが16に近づきます。 </li></ol>

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The authors have no competing financial interests and nothing else to disclose.

灌流腎臓単離されたマウスは、多数の全身要因の影響により欠陥があることがあり、無傷の動物におけるin vivo実験、の間のギャップを埋める、1時間にわたって制御された環境のex vivoで腎機能を研究するためのツールであり、in vitroの実験で必ずしも機能上の無傷の臓器構造の影響を無視孤立ネフロンセグメントまたは培養細胞、。この特定のタスクを実行するとは別の技術は、筆者の知る限り、ありません。腎組織の生化学的研究は、しかし、腎臓スライス17を用いて、はるかに簡単な方法で行うことができます。提示された技術は、現在、腎臓生理学を研究するために主に使用されているが、多くの新しいアプリケーションが議論されています。例えば、灌流脱細胞化および再細胞化12中の腎臓生体工学のために使用することができます。前のtrに腎臓のほか、長時間の正常体温灌流灌流液に抗拒絶またはゲノム編集薬の高用量の投与とansplantationは、検討されています。臨床8、図9、図10、図11における。灌流腎臓単離されたマウスは、ノックアウトモデルと個々の遺伝子の役割を解明するために、特に、これらの用途に使用することができる優れたツールです。 3つのステップが成功した実験のために重要です。本論文では、手順を再現するための手段と興味を持って研究室を提供します。まず、バッファは、腎臓が再現可能な条件下で長期生存に必要な栄養素のほとんどを受け取るように準備する必要があります。バランスが完全に制御された条件（合成バッファ）とネイティブ灌流条件（全血）との間で発見されなければなりません。したがって、10％のヘマトクリットにアルブミンや哺乳動物の赤血球が含まれることがあります。このヘマトクリットは、著者の経験では、十分なtとの最良の妥協点を表し、問題の酸素化と低バッファ粘度（ヘマトクリットを増加させることは、圧力一定の灌流（赤血球18せずに灌流腎臓の値に本論文で値を比較）の間に劇的に流れを減少させます）。赤血球の品質と鮮度が重要です。洗浄工程の間に、赤血球が溶血を防ぐために注意して処理する必要があります。バッファは、実験の日に新たに調製する必要があります。第二に、手術は、可能な最短時間内に訓練を受けた外科医が行う必要があります。外科医は、最小限に動物の血液損失を維持しながら、身体の残りの部分に腎臓を接続する主血管約6結紮を行う必要があります。最適な結果を得るためには、外科的介入は、30分以内に達成されなければなりません。動物の平均動脈血圧は麻酔への長時間の手術中、または原因で、低下した場合、60 mmHgの下に、腎臓の灌流はすでに最小限になり、組織が発生しやすくなります壊死します。これを除外するために、左の腎臓は右腎の灌流がすでに始まって、未処理の対照として使用した場合には、手術後に撮影することができます。第三に、標準的な小動物灌流回路からなる灌流灌流装置の正しい機能の時間の間に確保する必要があります。コンピュータはそれ自体で灌流を行っている間、人間の監督は、灌流回路内の気泡をチェックするために、例えば、必要です。 提供されている代表的なデータは、ex vivo灌流および本明細書に記載されたアプローチには、この方法の任意の実行の技術的成功を比較した1時間後の腎臓の生存率を評価することができます。少なくとも1時間、腎臓の血流量、血管抵抗の間に、静脈流出および糸球体濾過率の血液ガスは安定したままであるべきです。 一つは心に留めておく必要がある技術、に一定の制限があります。でも気最も成功した手術から発行dneyのみ限られた時間のために生き続けることができます。著者らは、1時間に灌流を停止するに最高の時間点であることが判明しました。分離された腎臓の灌流は、深さで孤立し、臓器全体の研究を可能にしながら、さらに、一つの細胞型に特異的な効果を区別することは困難です。糸球体、S1セグメントのDCT、およびCDは無傷のままであるべきであるしながら1時間後に固定された腎臓は、近位尿細管と太い上行脚細胞のS3セグメントに欠陥が表示される場合があります。特にヒトからの赤血球の義務的使用は、また、実験者のための潜在的なリスク（ 例えば 、感染症）にリンクされています。 要約すると、マウス単離された灌流腎臓は、臓器全体のex vivoで研究すると有用な技術です。任意の技術のように、それは特定の利点と制限があります。著者らは、両方のマニホールドの新しいアプリケーションは、現在発生すると、このプロトコルはsufficienを提供することができると信じていますこの取り組みを再現するために、他の研究室のt勢い。

臓器の孤立した灌流は、何十年もの間1のための生理学者の間で継続的な努力の対象となっています。技術は、血圧、ホルモン、又は神経のような全身的影響を受けず、臓器の機能を可能にし、検討することができます。カール・エドゥアルドLoebellは、1849年2に、孤立した腎臓の正常灌流を記載した最初であると考えられています。それ以来、灌流装置は、かなりの洗練を受けました。フレイとグルーバーは、連続灌流2のために酸素や拍動ポンプの人工肺を導入しました。初期の研究者は、主に大型哺乳動物、すなわち、豚2と犬3ワイスらによるラット腎臓の使用の-the最初の報告、の腎臓を研究している間。小哺乳類臓器灌流4の研究において画期的な出来事でした。 Schurek ら。十分な尿細管場合は灌流液に、哺乳動物の赤血球を追加することの必要性を報告酸素は5を達成されることになっていました。長期的な実験のためのクリティカルは、同じ研究グループ6によるバッファの連続透析を導入しました。 2003年には、Schweda ら。後でRahgozar らによって洗練機能マウス単離された灌流腎臓（MIPK）7を 、初めて報告しました。 18とリンデルら。 14。 ラット単離された灌流腎臓よりも技術的にはより困難ながら、MIPKの使用は、遺伝的に改変したマウスの広い配列の使用を可能にするという利点を有します。本論文では、1時間単離したマウスの腎臓を灌流するための本手法の詳細を提示しています。この方法は、腎臓の流量、血管抵抗、ホルモン放出、血液ガス分析、尿分析、および薬物の適用の継続的な評価を可能にします。手順の後、腎臓は、分子および生化学的解析のために処理することができる顕微鏡用に固定され、またはレシピエントマウスに移植した （ 図1）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig1.jpg" /> 図1：単離された灌流腎臓に対する可能な入力/出力の概要。 BGA：血液ガス分析。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54712/54712fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> この技術は、おそらく多くの革新的なアプリケーションは、移植前に長期の正常体温腎臓灌流の夜明けで議論されているように10、9、8（抗拒絶またはゲノム編集薬の適用の有無にかかわらず）、今後数年間で関心が高まっ受け取ります、11、脱細胞化スカフォールド12から全体腎臓の生体工学、および多光子イメージング13のための蛍光色素の高用量の適用</sup&gt;。また、急性腎障害14中に特定の遺伝子の役割を研究するための理想的なモデルです。 ステップバイステップのプロトコルは、他の研究室が正常に単離したマウス腎臓灌流を行うことができるように与えられています。まず、緩衝液の組成および調製は、指定されています。そして、手術は、詳細に記載されており、重要なステップが示されています。第三に、データが成功した準備を代表するものであり、その提示されている：腎臓の血流量、血管抵抗、糸球体濾過率、およびフラクショナル電解質排泄-すべて灌流腎臓の異なるネフロンセグメントの形態の生存能および透過型電子顕微鏡写真のような官能測定灌流の1時間後に固定。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Perfusion Circuit:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moist chamber 834/8</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2901</td><td></td></tr><tr><td>Cannular with basket and side port</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2947</td><td></td></tr><tr><td>Thermostat TC120-ST5&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-4544</td><td></td></tr><tr><td>ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-0114</td><td></td></tr><tr><td>Reservoir jacketed for buffer solution 1 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3438</td><td></td></tr><tr><td>Reservoir jacketed for buffer solution 0.5 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3436</td><td></td></tr><tr><td>Pressure Transducer APT300&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3862</td><td></td></tr><tr><td>TAM-D Plugsys Transducer</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-1793</td><td></td></tr><tr><td>SCP Plugsys servo controller</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2806</td><td></td></tr><tr><td>Windkessel&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3717</td><td></td></tr><tr><td>HSE-USB data acquisition</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3330</td><td></td></tr><tr><td>Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone</td><td>B.Braun</td><td>7203525</td><td></td></tr><tr><td>PE-Tubing for aorta cannulation 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D.</td><td>Scientific Commodities Inc.</td><td>BB31695-PE/8</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffer reagents:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminoplasmal 10%</td><td>B.Braun</td><td>134518064</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic acid monosodium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-(-)-Malic acid sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1125-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium-L-Lactate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7022-10G</td><td></td></tr><tr><td>alpha-Ketoglutaric acid sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1875-25G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60130-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Creatinine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4255-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Roche</td><td>10835242001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; * 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; * 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Riedel-de-Ha&amp;euml;n</td><td>12074</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr><tr><td>Antidiuretic Hormone dDAVP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2013-1MG</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Inulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter used for erythrocyte filtration</td><td>Macherey-Nagel</td><td>MN 615</td><td></td></tr><tr><td>BGA Analysis:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABL 80 flex</td><td>Radiometer Medical ApS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscope:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Philips CM100 TEM</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the mouse isolated perfused kidney technique

マウス単離された灌流腎臓（MIPK）が1時間灌流し、機能的なex vivoでの条件の下でのマウスの腎臓を維持するための技術です。これは、摘出された臓器の灌流腎生物工学のための脱細胞化または抗拒絶またはプライム腎臓に高用量におけるゲノム編集する薬剤の投与を含む、将来的には可能かもしれない多くの革新的なアプリケーションのための生理学を研究するための前提条件であります移植のため。灌流の時間の間、腎臓の腎機能を評価することができる、操作、および種々の医薬品を投与することができます。処置後、腎臓を移植することができ、または分子生物学、生化学分析、または顕微鏡検査のために処理しました。 本論文では、灌流液およびマウスの腎臓のex vivo灌流のために必要な外科的技術が記載されています。灌流装置の詳細が与えられ、データは、Vを示して提示されています形態学的読み出しとして異なるネフロンセグメントの機能、透過型電子顕微鏡写真、及び分子の読み出しなどの異なるネフロンセグメントの輸送タンパク質のウェスタンブロットのような腎臓の血流、血管抵抗、及び尿データ：腎臓の調製のiability。

方法について説明すると、単離したマウスの腎臓は、少なくとも1時間生存したまますることができます。我々は、機能（腎血流及び血管抵抗、静脈流出の血液ガス分析、糸球体濾過率、尿中分別のNa +及びK +排泄、および尿浸透圧）で連続灌流の1時間後の組織の生存率をテストし、形態学（透過電子野生型C57BL / 6マウスの4腎臓における顕微鏡、TEM）の方法。さらに、異なる細管セグメントの頂端マーカータンパク質のウェスタンブロットは、同じ動物のunperfused腎臓への単離された灌流腎臓を比較を行いました。全ての実験において、定圧潅流は、約100 mmHgで（ 図4）で灌流圧を維持しながら、使用されました。これらの腎臓では、灌流液の流れや血管抵抗は、腎臓重量および3の15.6±0.4ミリリットル/分* gで55分間の時間をかけて安定的に推移しました5±1.0 mmHgの*分/ mlで、それぞれ（ 図4 A）。灌流液の流れや血管抵抗の増加の減少は、組織の生存率を減少させることに関してで敏感なパラメータであり、注意して灌流を通して監視する必要があります。灌流の開始後60分を採取し、100μlの試料中の血液ガス及び電解質の分析は、動脈流入を静脈流出（ 表2）と比較した腎臓のCO 2産生およびO 2消費を明らかにしました。他のパラメータは、動脈と静脈（ 表2）との間で変化しないままでした。増加は組織損傷中に発生する可能性があるとして特別重点は、不変の静脈カリウムリリースに配置する必要があります。 FITC-イヌリンクリアランス14を介して評価され、糸球体濾過速度は、時間の経過とともに（ 図4 B）を大きくする傾向があったが、この傾向は有意性に達しありませんでした。ナトリウムとカリウムの分別排出は、灌流の55分後に評価しますインビボでの状況（ 図4 C）と比較して増加します。尿浸透圧は、灌流の55分（ 図4 D）後に静脈流出の浸透圧より高く上昇されていません。 以前17に記載のような形態学的研究のために、腎臓を、透析緩衝液中の3％パラホルムアルデヒドおよび0.1％グルタルアルデヒドで灌流した後、固定しました。腎臓の超微細構造をTEMで評価しました。近位尿細管の糸球体とS1セグメントは、灌流（ 図5 AおよびB）の後に大幅に変更されていないと思われました。いくつかの、すべてではないが、S2 / S3の近位尿細管のセグメントおよびラット単離された灌流腎臓5（ 図5 CおよびD）で前述したように維管束に近くなかった厚い昇順手足は、臓器損傷の兆候を示していました。でも厳重な検査の際に、遠位尿細管と集合管は、壊死の明らかな兆候を示しませんでした（図5 E、F、およびG）。結論として、マウスの腎臓における形態学的所見は、ラットの単離された灌流腎臓5に見られるような状況を反映しています。 同じ動物のunperfused反対側の腎臓に比べて単離された灌流腎臓（スナップ凍結を灌流の1時間後）（スナップ凍結を灌流の開始前）で異なるネフロンセグメントの頂端マーカータンパク質のウェスタンブロットは、有意な変化は認められませんでした。我々は（ 図6のA及びB）、（近位尿細管にあります）のNaPi-IIa族を研究しNKCC2（厚い昇順手足）、NCC（遠位尿細管）、およびのENaC（接続細管/集合管）。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig4.jpg" /> 図4：55 分間の灌流腎臓の機能生存率の評価。 A）&lt;/定圧灌流中&gt;強い、血管抵抗および灌流液の流れは、55分間安定していました。最初の15分が原因で、常にこの時間の間に見られる高い変動に除外されています。 B）糸球体濾過率25及び55分後に評価4腎臓の（FITC-イヌリンは）時間をかけて、わずかではなく、有意な増加を示しました。 C）のナトリウムとカリウムの分別排出は、灌流の55分後に評価しました。 D）灌流の55分後に静脈血漿および尿浸透圧。 n = 4の全ての実験インチデータは、平均±SEMとして提示されています。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54712/54712fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig5.jpg" /> 図5： 透過型電子顕微鏡。 Dの代表的な形態<html> 1時間のエンドポイントで灌流腎臓のifferentネフロンセグメント。 A）糸球体はそのままです。糸球体で足細胞の詳細。近位尿細管のB）S1セグメント。 S1セグメントは無傷です。近位尿細管のC）S2 / S3セグメント。いくつかはではなく、近位尿細管のすべてのS2 / S3セグメントは非常に壊死しています。細胞が腫れ表示され、大規模な細胞内の損傷を示します。管状の輪郭のみ基底膜によって保持されます。 D）太い上行脚（TAL）。維管束から遠く離れているこれらのTALは水腫性変性の最初の兆候を示しています。管腔膜が薄くて脆い表示されます。 E）遠位尿細管（DCT）。 DCTはそのままです。 F）DCT細胞の基底外側infoldingsの詳細。有窓内皮、基底膜、基底外側infoldings、およびミトコンドリアはそのままです。 G）ダクト（CD）を収集します。 CDはそのままです。e.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig5large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig6.jpg" /> 図6： 同じ動物からUnperfused腎臓に比べて単離された灌流腎におけるアピカルマーカータンパク質のウエスタンブロット。 A）腎臓のウェスタンブロットは1時間とunperfused腎臓灌流。 NaPi-IIAは、近位尿細管のための代表的なものです。 NKCC2は太い上行脚のための代表的なものです。スレオニン53（PT53 NCC）でリン酸化NCCとNCCは、排他的に遠位尿細管で発見されています。その全長のENaCとそれぞれのタンパク質分解的に切断された製品のアルファおよびガンマサブユニットが接続細管/集合管のための代表を示しています。 B）Aの定量）は、f灌流腎臓の間に有意差は認められませんでした1時間およびunperfused腎臓または。 n = 3のすべての実験インチデータは、平均±SEMを意味し、個々の値が示されているように提示されています。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54712/54712fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/54712/54712tbl1.jpg" /> 表1：ソリューションおよび透析緩衝液の組成。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54712/54712tbl1large.jpg" target="_blank">この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="表2" src="/files/ftp_upload/54712/54712tbl2.jpg" /> 表2： 血液ガスおよび動脈流入の電解質分析と灌流の発症後に灌流マウス腎臓60分の静脈流出（N = 4）。 ±手段としてデータが提示されていますSEM。

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The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

マウス単離された灌流腎臓（MIPK）が1時間灌流し、機能的なex vivoでの条件の下でのマウスの腎臓を維持するための技術です。緩衝液および外科技術を詳細に説明します。

マウス単離された灌流腎臓テクニック

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

the-mouse-isolated-perfused-kidney-technique

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

21.6K ビュー.  University of Zürich. マウス単離された灌流腎臓（MIPK）が1時間灌流し、機能的なex vivoでの条件の下でのマウスの腎臓を維持するための技術です。緩衝液および外科技術を詳細に説明します。 

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Use of a Hanging-weight System for Isolated Renal Artery Occlusion

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients revealed that only a mild increase in serum creatinine levels (0.3 to 0.4 mg/dl) is associated with a 70% greater risk of death than in persons without any increase 1. Along these lines, surgical procedures requiring cross-clamping of the aorta and renal vessels are associated with a renal failure rates of up to 30% 4. Similarly, AKI after cardiac surgery occurs in over 10% of patients under normal circumstances and is associated with dramatic increases in mortality. AKI are also common complications after liver transplantation. At least 8-17% of patients end up requiring renal replacement therapy 5. Moreover, delayed graft function due to tubule cell injury during kidney transplantation is frequently related to ischemia-associated AKI 6. Moreover, AKI occurs in approximately 20% of patients suffering from sepsis 6.The occurrence of AKI is associated with dramatic increases of morbidity and mortality 1. Therapeutic approaches are very limited and the majority of interventional trials in AKI have failed in humans. Therefore, additional therapeutic modalities to prevent renal injury from ischemia are urgently needed 3, 7-9. 
To elucidate mechanisms of renal injury due to ischemia and possible therapeutic strategies murine models are intensively required 7-13. Mouse models provide the possibility of utilizing different genetic models including gene-targeted mice and tissue specific gene-targeted mice (cre-flox system). However, murine renal ischemia is technically challenging and experimental details significantly influence results. We performed a systematic evaluation of a novel model for isolated renal artery occlusion in mice, which specifically avoids the use of clamping or suturing the renal pedicle 14. This model requires a nephrectomy of the right kidney since ischemia can be only performed in one kidney due to the experimental setting. In fact, by using a hanging-weight system, the renal artery is only instrumented once throughout the surgical procedure. In addition, no venous or urethral obstruction occurs with this technique. We could demonstrate time-dose-dependent and highly reproducible renal injury with ischemia by measuring serum creatinine. Moreover, when comparing this new model with conventional clamping of the whole pedicle, renal protection by ischemic preconditioning is more profound and more reliable. Therefore his new technique might be useful for other researchers who are working in the field of acute kidney injury.

A precise murine model for acute kidney injury (AKI) due to ischemia is an important tool to investigate acute kidney injury and possibly find therapeutic tools to treat renal injury. The hanging weight system offers a tool for immediate and reliable renal artery occlusion and reperfusion without causing renal congestion.

隔離された腎動脈閉塞のためのハンギングウェイトシステムの利用

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients ...

医学

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and podocytes with their slit diaphragms. The delicate structure of the glomerular filter, especially the slit diaphragm, relies on the interplay of diverse cell surface proteins. Studying these cell surface proteins has so far been limited to in vitro studies or histologic analysis. Here, we present a murine in vivo biotinylation labeling method, which enables the study of glomerular cell surface proteins under physiologic and pathophysiologic conditions. This protocol contains information on how to perfuse mouse kidneys, isolate glomeruli, and perform endogenous immunoprecipitation of a protein of interest. Semi-quantitation of glomerular cell surface abundance is readily available with this novel method, and all proteins accessible to biotin perfusion and immunoprecipitation can be studied. In addition, isolation of glomeruli with or without biotinylation enables further analysis of glomerular RNA and protein as well as primary glomerular cell culture (i.e., primary podocyte cell culture).

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Here we present a protocol for murine in vivo labeling of glomerular cell surface proteins with biotin. This protocol contains information on how to perfuse mouse kidneys, isolate glomeruli, and perform endogenous immunoprecipitation of the protein of interest.

腎糸球体と腎糸球体細胞表面タンパク質の標識体内の分離

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

生化学

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

マウス腎臓移植：同種移植片拒絶のモデル

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.

Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

腎、免疫細胞の信頼性と高効率抽出

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

免疫・感染学

Comparative Proteomic Analysis of Whole Kidney, Medulla, and Cortical Tubules in Diabetic Pathogenesis of Kidney Injury in Mice

Defining the sequence of events in renal disease is the cornerstone of clinical practice in the nephrologist toolkit. Tissue proteomic analyses are a significant approach to understanding the fundamental physiological and molecular processes of renal pathophysiology. The methods and protocols we present here will allow for the molecular dissection of the kidney in each specific region of interest related to disease sequelae. To determine the effects of disease on specific kidney regions and structures with unique functions, the goals of this protocol are to demonstrate simplified mouse kidney compartmentalization and renal cortical tubule isolation techniques in tandem with streamlined label-free quantitative proteomic workflows. Combining these methods will assist in the identification of perturbed molecular patterns in the whole kidney, medullary compartments, and cortical tubule structures of kidneys, with the ultimate and eventual goal of single-cell proteomics in pathological contexts. Applying these methods in virtually any disease model will be helpful in delineating mechanisms of pathology related to kidney dysfunction.

Here, we present a detailed protocol for proteomic analysis of the whole kidney, isolated cortical tubule, and medullary proteomes. The study also compares regional proteomes in a diabetic mouse model and non-diabetic mice.

マウスにおける腎障害の糖尿病発症機序における全腎臓・髄質・皮質尿細管の比較プロテオミクス解析

Defining the sequence of events in renal disease is the cornerstone of clinical practice in the nephrologist toolkit. Tissue proteomic analyses are a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

フローサイトメトリー解析のためのマウス腎臓レジデントCD8+T 細胞の分離

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) imaging. They have received great attention in all research areas for the potential to analyze microscopic multicellular structures that extend over macroscopic distances. Given that kidney tubules, vasculature, nerves, and glomeruli extend in many directions, which have been only partially captured by traditional two-dimensional techniques so far, tissue clearing also opened up many new areas of kidney research. The list of optical clearing methods is rapidly growing, but it remains difficult for beginners in this field to choose the best method for a given research question. Provided here is a simple method that combines antibody labeling of thick mouse kidney slices; optical clearing with cheap, non-toxic and ready-to-use chemical ethyl cinnamate; and confocal imaging. This protocol describes how to perfuse kidneys and use an antigen-retrieval step to increase antibody- binding without requiring specialized equipment. Its application is presented in imaging different multicellular structures within the kidney, and how to troubleshoot poor antibody penetration into tissue is addressed. We also discuss the potential difficulties of imaging endogenous fluorophores and acquiring very large samples and how to overcome them. This simple protocol provides an easy-to-setup and comprehensive tool to study tissue in three dimensions.

The combination of antibody labeling, optical clearing, and advanced light microscopy allows three-dimensional analysis of complete structures or organs. Described here is a simple method to combine immunolabeling of thick kidney slices, optical clearing with ethyl cinnamate, and confocal imaging that enables visualization and quantification of three-dimensional kidney structures.

免疫標識腎組織の光学クリアリングとイメージング

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

An Effective Mouse Model of Unilateral Renal Ischemia-Reperfusion Injury

Ischemia-reperfusion injury (IRI) is the leading cause of acute renal failure and is a significant contributor to delayed graft function. Animal models are the only available resources that mimic the complexities of the IRI-associated damage encountered in vivo. This paper describes an effective mouse model of unilateral renal IRI that delivers highly reproducible data. Ischemia is induced by occluding the right renal pedicle for 30 min followed by reperfusion. In addition to the surgical procedure, a sequential overview of the expected physiological and histopathological changes following renal IRI will be provided by comparing data from seven different reperfusion times (4 h, 8 h, 16 h, 1 day, 2 days, 4 days, and 7 days). Critical data for planning experiments ahead, such as mean surgical time, average anesthetic consumption, and body weight changes over time, will be shared. This work will help researchers implement a reliable renal IRI model and select the appropriate reperfusion time that aligns with their intended investigative goals.

Renal ischemia-reperfusion injury is associated with high morbidity and mortality in hospitalized patients. Here, we present a simple and effective mouse model of unilateral renal ischemia-reperfusion injury and provide a sequential overview of representative pathological changes observed in the kidney.

片側性腎虚血再灌流傷害の有効マウスモデル

Ischemia-reperfusion injury (IRI) is the leading cause of acute renal failure and is a significant contributor to delayed graft function. Animal models ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). Therefore, assessing mitochondrial function in primary TECs may provide valuable insight into the bioenergetic status of the cells, providing insight into the pathophysiology of CKD. While there are a number of complex protocols available for the isolation and purification of proximal tubules in different species, the field lacks a cost-effective method optimized for&#160;tubular cell isolation without the need for purification. Here, we provide an isolation protocol that allows for studies focusing on both primary mouse proximal and distal renal TECs. In addition to cost-effective reagents and minimal animal procedures required in this protocol, the isolated cells maintain high energy levels after isolation and can be sub-cultured up to four&#160;passages, allowing for continuous studies. Furthermore, using a high throughput extracellular flux analyzer, we assess the mitochondrial respiration directly in the isolated TECs in a 96-well plate for which we provide recommendations for the optimization of cell density and compound concentration. These observations suggest that this protocol can be used for renal tubular ex vivo studies with a consistent, well-standardized production of renal TECs. This protocol may have broader future applications to study mitochondrial dysfunction associated with renal disorders for drug discovery or drug characterization purposes.

This protocol provides a cost-effective approach to isolate and characterize mouse primary renal tubular cells that can subsequently be sub-cultured to assess renal biological functions ex vivo, including mitochondrial bioenergetics.

マウスの主な腎尿細管上皮細胞の分離と性質、高スループットの細胞フラックスの解析

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

生物学

Glomeruli Isolation: A Technique to Obtain Intact Glomeruli from Murine Kidney

Source: Eymael, J. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/60324" target="_blank">Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video describes the method to isolate intact glomeruli from mouse kidneys. The encapsulated and decapsulated glomeruli thus obtained can further be used for culturing parietal epithelial cell outgrowths from the murine kidney.

糸球体単離:マウス腎臓から無傷の糸球体を得る技術

Source: Eymael, J. et al. Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation. J. Vis. Exp. ...