Name: the mouse isolated perfused kidney technique
Uploaded: 2016-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
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The authors would like to thank Hans-Joachim Schurek for invaluable scientific advice. The authors would like to thank Monique Carrel and Mich&#232;le Heidemeyer for excellent technical assistance, David Penton Ribas and Nourdine Faresse for a critical reading of the manuscript and Carsten Wagner and J&#252;rg Biber for the NaPi-2a antibody. This work was supported by the Swiss National Centre for Competence in Research "Kidney.CH" and by a project grant (310030_143929/1) from the Swiss National Science Foundation.

Todos los procedimientos con animales descritos en este manuscrito se realizaron de acuerdo con la legislación suiza y aprobados por la administración veterinaria del Cantón de Zurich, Suiza. 1. tampón de preparación de <ol><li> Preparar soluciones de 1 - 4 y la solución de la hormona antidiurética (ADH) (Tabla 1). </li><li> Preparar el tampón de diálisis (Tabla 1). NOTA: Este es el tampón utilizado como el tampón de diálisis durante la perfusión. Más tarde, los eritrocitos se diluyeron en este tampón para formar el líquido de perfusión final. </li><li> preparado de eritrocitos. <ol><li> Diluir 250 ml de concentrado de eritrocitos humanos (material ensayado obtenida del banco de sangre local) a 500 ml con tampón de diálisis. Se centrifuga a 2.000 g durante 8 min. Eliminar el tampón, teniendo cuidado de no eliminar los eritrocitos. Se repite 3 veces. </li></ol></li><li> Preparar el (albúmina de suero bovino; BSA) de albúmina de buffer. <ol><li> En 200 ml de dialysitampón s, se disuelven 44 g de BSA utilizando una barra de agitación. Se filtra la solución con papel de filtro. </li></ol></li><li> Preparar el líquido de perfusión. <ol><li> Filtrar los eritrocitos de la etapa 1.3.1 a través de papel de filtro en el tampón de BSA. Llenar hasta un volumen total de 800 ml con tampón de diálisis. NOTA: Este es el líquido de perfusión final. El hematocrito ahora debe estar entre 8 y 12%. El líquido de perfusión se puede almacenar durante un máximo de 12 horas a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Inicio de la diálisis y Oxigenación <ol><li> Encienda el baño de agua que rodea el depósito más grande de amortiguación, depósito de regulación más pequeña, y la cámara húmeda (una pequeña cámara, de doble pared llevó a 37 ° C y 100% de humedad para sostener más tarde el riñón) a 37 ° C (Figura 2) . </li><li> Llenar el depósito de regulación más grande con el tampón de diálisis y el depósito más pequeña con el perfundido. </li><li> Encienda el 5% de CO 2 O de entrada de gas 2/95% a tampón de diálisis. </li><li> Cambie en diálisis continua del líquido de perfusión frente al tampón de diálisis. Tenga cuidado de usar un tubo de diálisis de bajo flujo. Continúe con el Paso 3. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig2.jpg" /> Figura 2: Dibujo esquemático del circuito de perfusión. Esquema muestra los componentes principales del circuito de perfusión y la dirección del flujo de tampón. Todos los componentes rodeadas de azul oscuro se mantienen a 37 ° C con un baño de agua / termostato. 1: Diálisis tampón de por lo menos 3 veces el volumen del tampón de perfusión se burbujea continuamente con 95% O2 / 5% de CO 2. 2: Diálisis tampón y tampón de perfusión se dializan de forma continua entre sí en un tubo de diálisis por una bomba de rodillos. 3: througho constante Debido a esta diálisis, el tampón de perfusión se enriquece con 9% de O2 / 5% de CO 2 y electrolitos niveles se mantienenperfusión ut. 4: una bomba de rodillos propulsa el tampón de perfusión hacia el riñón. 5: Un receptor de aire elimina ondas peristálticas y actúa como una trampa de burbujas. 6: El transductor de presión (conectado a 4. (bomba de rodillos) para mantener una presión continua al tiempo que permite el flujo libre alterna). 7: A lo largo de la perfusión, el riñón se mantiene en una cámara húmeda para la humedad del aire 100% y 37 ° C de temperatura de riñón. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54712/54712fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 3. Procedimiento quirúrgico Parte 1 (para un diagrama de todas las ligaduras, véase la Figura 3) Nota: Realizar todas las ligaduras utilizando 5-0 hilo quirúrgico. <ol><li> Anestesiar un ratón mediante inyección intraperitoneal (10 l / g de peso corporal, 20 mg / ml de ketamina y 1 mg / ml de xilazina disuelto en 0,9% NaCl). Confirmar suficiente profundidad de anesthEIAS ensayando la ausencia de reflejos del pie trasero. </li><li> Fijar el ratón en una posición supina en la cámara húmeda. Proteger los ojos con ungüento veterinario. Colocar una jeringa de 1 ml por debajo de la columna vertebral para elevar los vasos lumbares. </li><li> Realizar una laparotomía media de la cresta del pubis a la apertura del esternón primero la piel, los músculos abdominales, con unas tijeras. </li><li> Retire el intestino y lo coloca en el lado izquierdo del ratón lateral del abdomen. </li><li> Liberar la vejiga a partir de tejido conjuntivo y explorar ambos uréteres y la uretra. </li><li> Colocar una ligadura alrededor del uréter izquierdo (I ligadura). Cierralo. </li><li> Colocar una ligadura alrededor de la uretra (ligadura II). Cierralo. </li><li> Colocar una ligadura &quot;lazo&quot; alrededor de toda la vejiga (ligadura III). </li><li> Incisión en la vejiga 1 mm. </li><li> Canular la abertura con 2 cm PE 50 tubos. </li><li> Cerrar ligadura III alrededor de la tubería. </li><li> Cortar el uréter izquierdo y la uretra distal de las ligaduras. el bladder está ahora unido al uréter derecho solamente y se mueve libremente. </li><li> Desactive la aorta abdominal de tejido conectivo y grasa. </li><li> Colocar una ligadura mediados de aorta abdominal (IV ligadura). </li><li> Colocar una ligadura alrededor de la aorta por debajo del diafragma entre la arteria mesentérica superior y el tronco celíaco (V ligadura). </li><li> Colocar una ligadura alrededor de la arteria mesentérica superior (VI ligadura). </li><li> Colocar una ligadura aórtica directamente debajo de la derecha y por encima de la arteria renal izquierda (VII ligadura). </li><li> Colocar una ligadura alrededor de la vena caudal del paquete (cava) (VIII ligadura). Vaya al paso 4. </li></ol><img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig3.jpg" /> Figura 3: Representación esquemática de las ligaduras colocadas durante la cirugía. Vista del abdomen abierto después de la laparotomía. El intestino se mueve hacia la izquierda. L y R indican el riñón izquierdo y derecho. lalíneas negras muestran el área de la respectiva ligadura. Las ligaduras se colocan primero y luego cerrados, según el orden indicado en el texto. X marca la ubicación de la incisión para la canulación de la aorta. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54712/54712fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 4. El cebado del circuito de perfusión <ol><li> Arrancar la bomba rotativa y llenar el tubo con líquido de perfusión. Tenga cuidado de vaciar todas las burbujas de aire. </li><li> Complete el dispositivo receptor de aire a aproximadamente a mitad de la altura de líquido de perfusión. </li><li> Calibrar el transductor de presión a 0 mm Hg cuando todos los tubos se llena y el flujo es 0. Mantenga la aguja de perfusión a nivel del riñón durante este tiempo. </li><li> Mantener el caudal a un nivel mínimo constante (0,6 ml / min) y vaya al paso 5. </li></ol> 5. Procedimiento quirúrgico Parte 2 <ol><li> Colocar una pinza de ligadura entre el IV y la ramificación de la izquierda renal arteria. </li><li> Hacer una pequeña incisión en la aorta caudal de ligadura IV, teniendo cuidado de no cortar la pared dorsal. </li><li> Dilatar la abertura en la aorta con un dilatador de vasos. </li><li> Canular la aorta con una aguja (2 cm de largo, tirado PE 50), empujando la punta justo a la abrazadera. </li><li> Abra la pinza. </li><li> Empuje la punta de la aguja cranealmente hasta que llega a la unión de la arteria renal derecha y la aorta. </li><li> Cerrar ligadura VII. </li><li> Cerrar ligadura IV. </li><li> Abre el cofre con las tijeras de disección por el diafragma. Con un solo corte, separar la aorta, vena cava, el corazón y los nervios vegetativos. Con este paso, el animal se sacrificó mediante exanguinación rápida bajo anestesia profunda continua. </li><li> Comience control de la presión de la bomba de perfusión. Mantener la presión media de entre 80 y 100 mmHg. </li><li> Cerrar V. ligadura </li><li> Cerrar ligadura VI. </li><li> Cerrar ligadura VIII. </li><li> Libre el riñón derecho de tissu conjuntivoE y su incorporación en la cápsula adiposa con unas tijeras. </li><li> Cortar la aorta proximal a la ligadura V. </li><li> Cortar la arteria mesentérica superior distal a la ligadura VI. </li><li> Cortar el paquete recipiente de riñón de apoyo a cabo, teniendo cuidado de no cortar en los propios vasos. </li><li> Cortar el hígado en la conexión con el riñón. Tener cuidado para liberar el riñón, pero dejar una pequeña parte de la adherente hígado a ella, de modo que la vena cava se mantiene abierta por el mismo. </li><li> Tome el paquete de riñón de ratón. Retire el ratón desde la cámara húmeda. </li><li> Colocar una ligadura &quot;lazo&quot; alrededor de la conexión del hígado y el riñón (IX ligadura). </li><li> Canular la vena cava con una línea venosa (2 cm PE 50). </li><li> Cerrar ligadura IX. La salida venosa a través de la línea venosa debe comenzar inmediatamente. </li><li> Cierre la cámara húmeda. </li></ol> 6. Los análisis intermedios <ol><li> Durante la siguiente hora, supervisar continuamente el flujo sanguíneo y intravasculla presión ar 15. Recoger el flujo venoso, que se puede utilizar para el análisis de, por ejemplo, la liberación de renina renal 7. Recoger la orina para el análisis de la concentración de electrolitos y el filtrado glomerular 14. Después de 1 hora de perfusión, los riñones pueden ser congeladas instantáneamente por el Western Blot o fijarse para obtener imágenes de los enfoques 16. </li></ol>

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The authors have no competing financial interests and nothing else to disclose.

El ratón aislados del riñón perfundido es una herramienta para el estudio de la función renal en un ambiente controlado ex vivo durante 1 hora, reduciendo la brecha entre los experimentos in vivo en animales intactos, lo que puede ser defectuoso por el impacto de numerosos factores sistémicos, y los experimentos in vitro en segmentos de la nefrona aisladas o células cultivadas, lo que necesariamente descuidar el impacto de la estructura de los órganos intactos en la función. Hay, al conocimiento de los autores, no hay una técnica alternativa con la que llevar a cabo esta tarea específica. Los estudios bioquímicos sobre el tejido del riñón, sin embargo, se pueden realizar de una manera mucho más simple utilizando rodajas de riñón 17. Si bien la técnica presentada se utiliza actualmente sobre todo para estudiar la fisiología renal, se están discutiendo muchas nuevas aplicaciones. Por ejemplo, se podría utilizar para la bioingeniería riñón durante descelularización perfusión y recelularización 12. Además, la perfusión normotérmica prolongada de los riñones antes de transplantation, con la administración de altas dosis de anti-rechazo o, se está estudiando el genoma de edición de fármacos en el líquido de perfusión; incluso en entornos clínicos 8, 9, 10, 11. El riñón aislado y perfundido de ratón es una excelente herramienta que podría ser utilizado para estas aplicaciones, especialmente para dilucidar el papel de los genes individuales con los modelos knockout. Tres pasos son críticos para un experimento exitoso. Este documento proporciona los laboratorios interesados ​​con los medios para reproducir el procedimiento. En primer lugar, la memoria intermedia tiene que estar preparado de tal manera que el riñón recibe la mayor parte de los nutrientes necesarios para la viabilidad prolongada en condiciones reproducibles. Un equilibrio que debe buscarse entre las condiciones totalmente controladas (tampón sintética) y una condición de perfusión nativa (sangre completa). Por lo tanto, la albúmina y eritrocitos de mamíferos a un hematocrito de 10% deben ser incluidas. Este hematocrito representa, según la experiencia de los autores, el mejor compromiso entre la suficiente tcuestión oxigenación y baja viscosidad tampón (aumento de hematocrito disminuye el flujo de manera espectacular durante la perfusión a presión constante (comparar los valores presentados en este documento a los valores en los riñones perfundidos sin eritrocitos 18)). La calidad y la frescura de los eritrocitos es crítica. Durante las etapas de lavado, eritrocitos deben ser manejados con cuidado para evitar la hemólisis. El tampón debe estar preparada recientemente en el día del experimento. En segundo lugar, la operación tiene que ser realizada por un cirujano entrenado en el menor tiempo posible. El cirujano tiene que realizar 6 ligaduras alrededor de los vasos principales que conectan el riñón para el resto del cuerpo, mientras se mantiene la pérdida de sangre del animal a un mínimo. Para obtener resultados óptimos, las intervenciones quirúrgicas deben llevarse a cabo dentro de los 30 minutos. Si la presión sanguínea arterial media de los animales gotas, durante la cirugía prolongado o debido a la anestesia, por debajo de 60 mmHg, la perfusión renal ya estará mínimo y el tejido será propensoa necrosis. Para descartar esta posibilidad, el riñón izquierdo se puede tomar después de la cirugía, cuando la perfusión del riñón derecho ya ha comenzado, y se utiliza como un control no tratado. En tercer lugar, durante el tiempo de la perfusión el correcto funcionamiento del aparato de perfusión, que consta de un circuito de animal pequeño perfusión estándar, necesita ser asegurado. Mientras el ordenador lleva a cabo la perfusión por sí mismo, la supervisión humana es necesario, por ejemplo para comprobar si hay burbujas en el circuito de perfusión. Los datos representativos proporcionados permite la evaluación de la viabilidad del riñón después de 1 hr de perfusión ex vivo y la comparación de la éxito técnico de cualquier ejecución de este método para el enfoque descrito en el presente documento. Durante al menos 1 hora, el flujo sanguíneo renal, la resistencia vascular, los gases sanguíneos del flujo venoso y la tasa de filtración glomerular deben permanecer estables. Existen ciertas limitaciones a la técnica, lo que uno tiene que tener en cuenta. Incluso un kidney que sale de la cirugía mayor éxito sólo puede permanecer viable durante un tiempo limitado. Los autores encontraron 1 hr a ser el mejor punto de tiempo en el que para detener la perfusión. Además, mientras que la perfusión del riñón aislado permite el estudio de todo el órgano aislado en profundidad, es difícil diferenciar efectos específicos sobre un tipo de célula. Los riñones fijos después de 1 hora pueden mostrar defectos en los segmentos S3 de los túbulos proximales y células ascendente extremidades gruesas, mientras que los glomérulos, los segmentos S1, DCT, y CDs deben permanecer intactos. El uso obligatorio de los eritrocitos, en especial de los seres humanos, también está vinculado a riesgos potenciales (por ejemplo, infecciones) para el experimentador. En resumen, el riñón aislado y perfundido de ratón es una técnica útil con el que estudiar todo el órgano ex vivo. Como cualquier técnica, tiene ciertas ventajas y limitaciones. Los autores creen que tanto las nuevas aplicaciones múltiples que surgen en la actualidad y este protocolo podrían proporcionar suficient impulso para otros laboratorios para reproducir este esfuerzo.

La perfusión aislada de órganos ha sido objeto de un esfuerzo continuo entre los fisiólogos durante muchas décadas 1. La técnica permite la función del órgano, sin influencias sistémicas como la hipertensión arterial, las hormonas, o los nervios, para ser estudiado. Carl Eduard Loebell se considera que es el primero que ha descrito la perfusión con éxito de un riñón aislado, en 1849 2. Desde entonces, el aparato de perfusión ha sufrido refinamiento significativo. Frey y Gruber introdujeron un pulmón artificial para las bombas de oxigenación y perfusión continua para pulsátiles 2. Mientras que los primeros investigadores estudiaron principalmente los riñones de los mamíferos grandes, a saber, cerdos y perros 2 3 -el primer informe del uso de riñones de rata, por Weiss et al. , Fue un hito en el estudio de la perfusión de los órganos mamífero pequeño 4. Schurek et al. informaron la necesidad de la adición de eritrocitos de mamíferos al perfundido si tubular renal suficienteoxigenación debía lograrse 5. Crítico para experimentos a largo plazo fue la introducción de la diálisis continua de la memoria intermedia por el mismo grupo de investigación 6. En 2003, Schweda et al. fueron los primeros en informar de un riñón aislado perfundido funcional del ratón (MIPK) 7, posteriormente refinado por Rahgozar et al. 18 y Lindell et al. 14. Aunque técnicamente más difícil que la rata aislado y perfundido de riñón, el uso de la MIPK lleva la ventaja de permitir el uso de una amplia gama de ratones genéticamente alterados. Este artículo presenta los detalles del método de los autores de la perfusión de los riñones de ratones aislados durante 1 hora. El método permite la evaluación continua de la tasa de flujo renal, la resistencia vascular, la liberación de hormonas, el análisis de gases en sangre, análisis de orina, y la aplicación de fármacos. Después del procedimiento, los riñones podrían ser procesados ​​para el análisis molecular y bioquímica, se fijarán para microscopía, otrasplantado en un ratón receptor (Figura 1). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig1.jpg" /> Figura 1: Visión general de la posible entrada / salida para el riñón aislado y perfundido. BGA: análisis de gases en sangre. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54712/54712fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Esta técnica es probable que reciba una atención creciente en los próximos años, ya que muchas aplicaciones innovadoras se están discutiendo con el amanecer de la perfusión renal normothermic prolongado antes del trasplante (con o sin la aplicación de anti-rechazo o drogas genoma de edición) 8, 9, 10 , 11, la bioingeniería de los riñones enteros de andamios descelularizados 12, y la aplicación de altas dosis de tintes fluorescentes para la imagen multifotónica 13 </sup&gt;. También es un modelo ideal con el que estudiar el papel de los genes específicos durante la lesión renal aguda 14. Un protocolo paso a paso se da para permitir que otros laboratorios para realizar la perfusión aislada de riñón de ratón con éxito. En primer lugar, se especifica la composición y preparación de la memoria intermedia. A continuación, la cirugía se describe en detalle y se muestran los pasos críticos. En tercer lugar, se presentan los datos que son representativos de una preparación exitosa: el flujo sanguíneo renal, la resistencia vascular, la tasa de filtración glomerular, y el electrolito fraccionada mediciones funcionales de micrografías de viabilidad y electrónicas de transmisión de la morfología de los diferentes segmentos de la nefrona de los riñones perfundidos todos excreción- fijo después de 1 hora de perfusión.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Perfusion Circuit:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moist chamber 834/8</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2901</td><td></td></tr><tr><td>Cannular with basket and side port</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2947</td><td></td></tr><tr><td>Thermostat TC120-ST5&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-4544</td><td></td></tr><tr><td>ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-0114</td><td></td></tr><tr><td>Reservoir jacketed for buffer solution 1 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3438</td><td></td></tr><tr><td>Reservoir jacketed for buffer solution 0.5 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3436</td><td></td></tr><tr><td>Pressure Transducer APT300&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3862</td><td></td></tr><tr><td>TAM-D Plugsys Transducer</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-1793</td><td></td></tr><tr><td>SCP Plugsys servo controller</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2806</td><td></td></tr><tr><td>Windkessel&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3717</td><td></td></tr><tr><td>HSE-USB data acquisition</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3330</td><td></td></tr><tr><td>Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone</td><td>B.Braun</td><td>7203525</td><td></td></tr><tr><td>PE-Tubing for aorta cannulation 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D.</td><td>Scientific Commodities Inc.</td><td>BB31695-PE/8</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffer reagents:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminoplasmal 10%</td><td>B.Braun</td><td>134518064</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic acid monosodium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-(-)-Malic acid sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1125-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium-L-Lactate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7022-10G</td><td></td></tr><tr><td>alpha-Ketoglutaric acid sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1875-25G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60130-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Creatinine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4255-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Roche</td><td>10835242001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; * 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; * 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Riedel-de-Ha&amp;euml;n</td><td>12074</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr><tr><td>Antidiuretic Hormone dDAVP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2013-1MG</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Inulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter used for erythrocyte filtration</td><td>Macherey-Nagel</td><td>MN 615</td><td></td></tr><tr><td>BGA Analysis:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABL 80 flex</td><td>Radiometer Medical ApS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscope:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Philips CM100 TEM</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the mouse isolated perfused kidney technique

El aislado de riñón perfundido ratón (MIPK) es una técnica para mantener un riñón de ratón bajo condiciones ex vivo perfundidos y funcionales para 1 hr. Este es un requisito previo para el estudio de la fisiología del órgano aislado y para muchas aplicaciones innovadoras que pueden ser posibles en el futuro, incluyendo descelularización la perfusión de bioingeniería renal o la administración de anti-rechazo o drogas genoma de edición en altas dosis para cebar el riñón para el trasplante. Durante el tiempo de la perfusión, el riñón puede ser manipulado, la función renal puede ser evaluada, y diversos productos farmacéuticos administrado. Después del procedimiento, el riñón puede ser trasplantado o tratados con la biología molecular, análisis bioquímicos, o microscopía. Este artículo describe el líquido de perfusión y la técnica quirúrgica necesaria para la perfusión ex vivo de los riñones de ratones. Los detalles del aparato de perfusión y se dan los datos se presentan mostrando la vESPONSABILIDAD de la preparación del riñón: el flujo sanguíneo renal, la resistencia vascular, y de orina de datos como, micrografías electrónicas de transmisión funcionales de los diferentes segmentos de la nefrona como lecturas morfológicas, y transferencias Western de las proteínas de transporte de los diferentes segmentos de la nefrona como lectura molecular.

Con el método descrito, aislados riñones de ratón pueden permanecer viables durante al menos 1 hr. Hemos probado la viabilidad del tejido después de 1 hora de perfusión continua con el funcional (flujo sanguíneo renal y la resistencia vascular, el análisis de gases en sangre del flujo venoso, la tasa de filtración glomerular, urinaria fraccional de Na + y K + excreción, y la osmolaridad urinaria) y morfológica (electrónica de transmisión microscopía, TEM) métodos en cuatro riñones de tipo salvaje C57BL / 6 ratones. Adicionalmente, se realizaron transferencias Western de proteínas marcadoras apicales de los diferentes segmentos del túbulo, comparando los riñones perfundidos aislados a los riñones no perfundido de los mismos animales. En todos los experimentos, se utilizó la perfusión a presión constante, manteniendo la presión de perfusión en ~ 100 mmHg (Figura 4). En aquellos riñones, el flujo de líquido de perfusión y la resistencia vascular se mantuvieron estables durante un tiempo de 55 min a 15,6 ± 0,4 ml / min * g de peso del riñón y 35 ± 1,0 mmHg * min / ml, respectivamente (Figura 4 A). Una disminución del flujo de perfundido o un aumento de la resistencia vascular es un parámetro sensible con respecto a la disminución de la viabilidad del tejido y debe controlarse en toda la perfusión con cuidado. Gas de la sangre y análisis de electrolitos en muestras de 100 l tomadas 60 min después del inicio de la perfusión renal reveló la producción de CO 2 y el consumo de O 2, cuando el flujo de entrada arterial se comparó con el flujo de salida venoso (Tabla 2). Los otros parámetros se mantuvieron sin cambios entre la arteria y la vena (Tabla 2). Especial énfasis debe colocarse sobre la liberación de potasio venosa inalterada, como un aumento puede ocurrir durante el daño tisular. Tasa de filtración glomerular, evaluado a través de aclaramiento FITC-inulina 14, tendía a aumentar con el tiempo (Figura 4 B), pero esta tendencia no alcanzó significación. La excreción fraccional de sodio y de potasio evaluó después de 55 minutos de perfusiónse incrementa en comparación con la situación in vivo (Figura 4 C). Osmolalidad de la orina no se eleva por encima de la osmolalidad de la salida venosa después de 55 min de perfusión (Figura 4 D). Para los estudios morfológicos, los riñones se fijaron después de la perfusión en 3% de paraformaldehído y 0,1% de glutaraldehído en tampón de diálisis como se describió anteriormente 17. ultraestructura renal se evaluó con TEM. Segmentos glomérulos y S1 de los túbulos proximales aparecieron en gran medida sin modificaciones después de perfusión (Figuras 5 A y B). Algunos, pero no todos los segmentos S2 / S3 de los túbulos proximales y las gruesas ramas ascendentes que no estaban cerca de los haces vasculares estaban mostrando signos de daño orgánico, tal como se describe anteriormente en los riñones perfundidos aislados de rata 5 (Figuras 5 C y D). Incluso tras la inspección cercana, túbulos contorneados distales y conductos colectores no mostraron signos evidentes de necrosis (Las figuras 5 E, F, y G). En conclusión, los hallazgos morfológicos en los riñones de ratones reflejan la situación que se encuentra en el riñón de rata aislado y perfundido 5. transferencias Western de proteínas marcadoras apicales de los diferentes segmentos de la nefrona en los riñones perfundidos aislados (snap-congelados después de 1 hora de perfusión) en comparación con los riñones contralaterales no perfundido del mismo animal (se congelaron antes del inicio de la perfusión) no reveló alteraciones significativas. Estudiamos NaPi-IIa (que se encuentra en los túbulos proximales), NKCC2 (gruesas ascendente extremidades), NCC (túbulos contorneados distales), y ENaC (conexión túbulos / conductos colectores) (figuras 6 A y B). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig4.jpg" /> Figura 4: Evaluación de la viabilidad funcional de los riñones perfundidos durante 55 min. A) &lt;/ Strong&gt; Durante la perfusión de presión constante, la resistencia vascular y el flujo de líquido de perfusión se mantuvo estable durante 55 minutos. Los primeros 15 min se excluyen debido a la alta variabilidad siempre visto durante este tiempo. B) la tasa de filtración glomerular (FITC-inulina) de cuatro riñones evaluados después de 25 y 55 min representada ligero aumento significativo pero no en el tiempo. C) La excreción fraccional de sodio y potasio evaluó después de 55 minutos de perfusión. D) en plasma venoso y orina osmolaridad después de 55 minutos de perfusión. n = 4 en todos los experimentos. Los datos se presentan como medias ± SEM. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54712/54712fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig5.jpg" /> Figura 5: Microscopía Electrónica de Transmisión. Representante Morfología de D<html> Segmentos ifferent Nephron de perfundido riñones en un punto final de 1 hora. A) Los glomérulos están intactas. Detalle de una de podocitos en un glomérulo. Segmento B) S1 de un túbulo proximal. segmentos S1 están intactas. Segmento C) S2 / S3 de un túbulo proximal. Algunos, pero no todos los segmentos S2 / S3 de los túbulos proximales son altamente necróticos. Las células tienen aspecto hinchado y muestran gran daño intracelular. El contorno tubular se mantiene sólo por la membrana basal. D) rama ascendente gruesa (TAL). Esos TALs que están lejos de los haces vasculares muestran los primeros signos de degeneración hidrópica. membranas luminales aparecen adelgazados y frágil. E) túbulo contorneado distal (DCT). DCT están intactas. F) Detalle de los repliegues basolateral de una célula DCT. Fenestrado endotelio, membrana basal, repliegues basolateral, y las mitocondrias están intactas. G) del conducto colector (CD). CDs están intactas.e.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig5large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig6.jpg" /> Figura 6: Western Blot de proteínas marcadoras apicales en los riñones aislados y perfundidos En comparación con los no perfundido Los riñones de los mismos animales. A) Las transferencias Western de los riñones perfundidos durante 1 hora y los riñones no perfundido. NaPi-IIa es representativo para el túbulo proximal. NKCC2 es representativa de la rama gruesa ascendente. NCC NCC y fosforilados en treonina 53 (pT53 NCC) se encuentra exclusivamente en el túbulo contorneado distal. Alfa y gamma subunidades de ENaC en toda su longitud y sus respectivos productos escindidos proteolíticamente se muestran representativo para el túbulo / conducto colector de conexión. B) Cuantificación de A) no reveló diferencias significativas entre f riñones perfundidoso 1 hora y los riñones no perfundido. n = 3 en todos los experimentos. Los datos se presentan como medias ± SEM y los valores individuales se muestran. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54712/54712fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="tabla 1" src="/files/ftp_upload/54712/54712tbl1.jpg" /> Tabla 1: Composición de las soluciones de diálisis y de búfer. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54712/54712tbl1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.</a> <img alt="Tabla 2" src="/files/ftp_upload/54712/54712tbl2.jpg" /> Tabla 2: Blood Gas y análisis de electrolitos de entrada y salida arterial venosa de perfundido ratón Riñones 60 minutos después del comienzo de la perfusión (n = 4). Los datos se presentan como media ±SEM.

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The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

El aislado de riñón perfundido ratón (MIPK) es una técnica para mantener un riñón de ratón bajo condiciones ex vivo perfundidos y funcionales para 1 hr. Los tampones y técnica quirúrgica se describen en detalle.

La Técnica del riñón perfundido aislado del ratón

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

21.6K vistas.  University of Zürich.  El aislado de riñón perfundido ratón (MIPK) es una técnica para mantener un riñón de ratón bajo condiciones ex vivo perfundidos y funcionales para 1 hr. Los tampones y técnica quirúrgica se describen en detalle. 

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Use of a Hanging-weight System for Isolated Renal Artery Occlusion

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients revealed that only a mild increase in serum creatinine levels (0.3 to 0.4 mg/dl) is associated with a 70% greater risk of death than in persons without any increase 1. Along these lines, surgical procedures requiring cross-clamping of the aorta and renal vessels are associated with a renal failure rates of up to 30% 4. Similarly, AKI after cardiac surgery occurs in over 10% of patients under normal circumstances and is associated with dramatic increases in mortality. AKI are also common complications after liver transplantation. At least 8-17% of patients end up requiring renal replacement therapy 5. Moreover, delayed graft function due to tubule cell injury during kidney transplantation is frequently related to ischemia-associated AKI 6. Moreover, AKI occurs in approximately 20% of patients suffering from sepsis 6.The occurrence of AKI is associated with dramatic increases of morbidity and mortality 1. Therapeutic approaches are very limited and the majority of interventional trials in AKI have failed in humans. Therefore, additional therapeutic modalities to prevent renal injury from ischemia are urgently needed 3, 7-9. 
To elucidate mechanisms of renal injury due to ischemia and possible therapeutic strategies murine models are intensively required 7-13. Mouse models provide the possibility of utilizing different genetic models including gene-targeted mice and tissue specific gene-targeted mice (cre-flox system). However, murine renal ischemia is technically challenging and experimental details significantly influence results. We performed a systematic evaluation of a novel model for isolated renal artery occlusion in mice, which specifically avoids the use of clamping or suturing the renal pedicle 14. This model requires a nephrectomy of the right kidney since ischemia can be only performed in one kidney due to the experimental setting. In fact, by using a hanging-weight system, the renal artery is only instrumented once throughout the surgical procedure. In addition, no venous or urethral obstruction occurs with this technique. We could demonstrate time-dose-dependent and highly reproducible renal injury with ischemia by measuring serum creatinine. Moreover, when comparing this new model with conventional clamping of the whole pedicle, renal protection by ischemic preconditioning is more profound and more reliable. Therefore his new technique might be useful for other researchers who are working in the field of acute kidney injury.

A precise murine model for acute kidney injury (AKI) due to ischemia is an important tool to investigate acute kidney injury and possibly find therapeutic tools to treat renal injury. The hanging weight system offers a tool for immediate and reliable renal artery occlusion and reperfusion without causing renal congestion.

El uso de un sistema de suspensión de peso para la oclusión de la arteria renal aislada

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients ...

Investigación

Medicina

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and podocytes with their slit diaphragms. The delicate structure of the glomerular filter, especially the slit diaphragm, relies on the interplay of diverse cell surface proteins. Studying these cell surface proteins has so far been limited to in vitro studies or histologic analysis. Here, we present a murine in vivo biotinylation labeling method, which enables the study of glomerular cell surface proteins under physiologic and pathophysiologic conditions. This protocol contains information on how to perfuse mouse kidneys, isolate glomeruli, and perform endogenous immunoprecipitation of a protein of interest. Semi-quantitation of glomerular cell surface abundance is readily available with this novel method, and all proteins accessible to biotin perfusion and immunoprecipitation can be studied. In addition, isolation of glomeruli with or without biotinylation enables further analysis of glomerular RNA and protein as well as primary glomerular cell culture (i.e., primary podocyte cell culture).

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Here we present a protocol for murine in vivo labeling of glomerular cell surface proteins with biotin. This protocol contains information on how to perfuse mouse kidneys, isolate glomeruli, and perform endogenous immunoprecipitation of the protein of interest.

Aislamiento de glomérulos y en Vivo de etiquetado de proteínas de la superficie celular Glomerular

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Bioquímica

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

Ratón Trasplante de Riñón: Modelos de rechazo del aloinjerto

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.

Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

Fiable y de alta eficiencia de extracción de riñón de células inmunes

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

Inmunología e Infección

Comparative Proteomic Analysis of Whole Kidney, Medulla, and Cortical Tubules in Diabetic Pathogenesis of Kidney Injury in Mice

Defining the sequence of events in renal disease is the cornerstone of clinical practice in the nephrologist toolkit. Tissue proteomic analyses are a significant approach to understanding the fundamental physiological and molecular processes of renal pathophysiology. The methods and protocols we present here will allow for the molecular dissection of the kidney in each specific region of interest related to disease sequelae. To determine the effects of disease on specific kidney regions and structures with unique functions, the goals of this protocol are to demonstrate simplified mouse kidney compartmentalization and renal cortical tubule isolation techniques in tandem with streamlined label-free quantitative proteomic workflows. Combining these methods will assist in the identification of perturbed molecular patterns in the whole kidney, medullary compartments, and cortical tubule structures of kidneys, with the ultimate and eventual goal of single-cell proteomics in pathological contexts. Applying these methods in virtually any disease model will be helpful in delineating mechanisms of pathology related to kidney dysfunction.

Here, we present a detailed protocol for proteomic analysis of the whole kidney, isolated cortical tubule, and medullary proteomes. The study also compares regional proteomes in a diabetic mouse model and non-diabetic mice.

Análisis proteómico comparativo del riñón entero, la médula y los túbulos corticales en la patogénesis diabética de la lesión renal en ratones

Defining the sequence of events in renal disease is the cornerstone of clinical practice in the nephrologist toolkit. Tissue proteomic analyses are a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

Aislamiento de células CD8 + T residentes en el riñón delratón para el análisis de citometría de flujo

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) imaging. They have received great attention in all research areas for the potential to analyze microscopic multicellular structures that extend over macroscopic distances. Given that kidney tubules, vasculature, nerves, and glomeruli extend in many directions, which have been only partially captured by traditional two-dimensional techniques so far, tissue clearing also opened up many new areas of kidney research. The list of optical clearing methods is rapidly growing, but it remains difficult for beginners in this field to choose the best method for a given research question. Provided here is a simple method that combines antibody labeling of thick mouse kidney slices; optical clearing with cheap, non-toxic and ready-to-use chemical ethyl cinnamate; and confocal imaging. This protocol describes how to perfuse kidneys and use an antigen-retrieval step to increase antibody- binding without requiring specialized equipment. Its application is presented in imaging different multicellular structures within the kidney, and how to troubleshoot poor antibody penetration into tissue is addressed. We also discuss the potential difficulties of imaging endogenous fluorophores and acquiring very large samples and how to overcome them. This simple protocol provides an easy-to-setup and comprehensive tool to study tissue in three dimensions.

The combination of antibody labeling, optical clearing, and advanced light microscopy allows three-dimensional analysis of complete structures or organs. Described here is a simple method to combine immunolabeling of thick kidney slices, optical clearing with ethyl cinnamate, and confocal imaging that enables visualization and quantification of three-dimensional kidney structures.

Limpieza óptica e imágenes del tejido renal inmunoetiquetado

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

An Effective Mouse Model of Unilateral Renal Ischemia-Reperfusion Injury

Ischemia-reperfusion injury (IRI) is the leading cause of acute renal failure and is a significant contributor to delayed graft function. Animal models are the only available resources that mimic the complexities of the IRI-associated damage encountered in vivo. This paper describes an effective mouse model of unilateral renal IRI that delivers highly reproducible data. Ischemia is induced by occluding the right renal pedicle for 30 min followed by reperfusion. In addition to the surgical procedure, a sequential overview of the expected physiological and histopathological changes following renal IRI will be provided by comparing data from seven different reperfusion times (4 h, 8 h, 16 h, 1 day, 2 days, 4 days, and 7 days). Critical data for planning experiments ahead, such as mean surgical time, average anesthetic consumption, and body weight changes over time, will be shared. This work will help researchers implement a reliable renal IRI model and select the appropriate reperfusion time that aligns with their intended investigative goals.

Renal ischemia-reperfusion injury is associated with high morbidity and mortality in hospitalized patients. Here, we present a simple and effective mouse model of unilateral renal ischemia-reperfusion injury and provide a sequential overview of representative pathological changes observed in the kidney.

Un modelo de ratón eficaz de lesión unilateral por isquemia-reperfusión renal

Ischemia-reperfusion injury (IRI) is the leading cause of acute renal failure and is a significant contributor to delayed graft function. Animal models ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). Therefore, assessing mitochondrial function in primary TECs may provide valuable insight into the bioenergetic status of the cells, providing insight into the pathophysiology of CKD. While there are a number of complex protocols available for the isolation and purification of proximal tubules in different species, the field lacks a cost-effective method optimized for&#160;tubular cell isolation without the need for purification. Here, we provide an isolation protocol that allows for studies focusing on both primary mouse proximal and distal renal TECs. In addition to cost-effective reagents and minimal animal procedures required in this protocol, the isolated cells maintain high energy levels after isolation and can be sub-cultured up to four&#160;passages, allowing for continuous studies. Furthermore, using a high throughput extracellular flux analyzer, we assess the mitochondrial respiration directly in the isolated TECs in a 96-well plate for which we provide recommendations for the optimization of cell density and compound concentration. These observations suggest that this protocol can be used for renal tubular ex vivo studies with a consistent, well-standardized production of renal TECs. This protocol may have broader future applications to study mitochondrial dysfunction associated with renal disorders for drug discovery or drug characterization purposes.

This protocol provides a cost-effective approach to isolate and characterize mouse primary renal tubular cells that can subsequently be sub-cultured to assess renal biological functions ex vivo, including mitochondrial bioenergetics.

Aislamiento, caracterización y alto rendimiento análisis de flujo extracelular de ratón células epiteliales tubulares renales primarias

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Biología

Glomeruli Isolation: A Technique to Obtain Intact Glomeruli from Murine Kidney

Source: Eymael, J. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/60324" target="_blank">Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video describes the method to isolate intact glomeruli from mouse kidneys. The encapsulated and decapsulated glomeruli thus obtained can further be used for culturing parietal epithelial cell outgrowths from the murine kidney.

Source: Eymael, J. et al. Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation. J. Vis. Exp. ...