Name: the mouse isolated perfused kidney technique
Uploaded: 2016-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique at JoVE.com

The authors would like to thank Hans-Joachim Schurek for invaluable scientific advice. The authors would like to thank Monique Carrel and Mich&#232;le Heidemeyer for excellent technical assistance, David Penton Ribas and Nourdine Faresse for a critical reading of the manuscript and Carsten Wagner and J&#252;rg Biber for the NaPi-2a antibody. This work was supported by the Swiss National Centre for Competence in Research "Kidney.CH" and by a project grant (310030_143929/1) from the Swiss National Science Foundation.

כל הנהלים הקשורים בבעלי חיים המתוארים בכתב היד הזה נערכו על פי חוק השויצרי ואושרו על ידי ממשל הווטרינרים של קנטון ציריך, שוויץ. 1. הצפת הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו פתרונות 1 - 4 ואת הורמון נוגד השתנה (ADH) פתרון (טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החיץ דיאליזה (טבלה 1). הערה: זהו המאגר משמש חיץ הדיאליזה במהלך זלוף. מאוחר יותר, אריתרוציטים ידוללו במאגר זה כדי ליצור את perfusate הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה כדורי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 250 מיליליטר של תרכיז כדורי אדם (חומר נבדק המתקבל מבנק הדם המקומי) ל -500 מיליליטר עם חיץ דיאליזה. צנטריפוגה XG ב 2000 במשך 8 דקות. הסר את החוצץ, נזהר שלא להסיר כל אריתרוציטים. חזור 3x. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את (אלבומין בסרום שור; BSA) אלבומין חיץ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת 200 מ&quot;ל של dialysiחיץ s, לפזר 44 גרם של BSA באמצעות בר ומערבב. סנן את הפתרון עם נייר סינון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את perfusate. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את אריתרוציטים משלבים 1.3.1 דרך נייר סינון לתוך מאגר BSA. מלאו עד נפח כולל של 800 מ&quot;ל עם חיץ דיאליזה. הערה: זהו perfusate הסופי. ההמטוקריט צריך להיות עכשיו בין 8 ל 12%. את perfusate ניתן לאחסן עד 12 שעות ב 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. דיאליזה ייזום חמצון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל באמבט המים המקיף את המאגר למאגר הגדול, מאגר מאגר קטן, ובית נבחרים הלחים (תא קטן, דופן כפולה הביא 37 ° C ו 100% לחות מאוחר יותר להחזיק הכליה) עד 37 ° C (איור 2) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את מיכל חיץ גדול עם למאגר דיאליזה המאגר קטן עם perfusate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את זרימת הגז 5% CO 2/95% O 2 למאגר דיאליזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל דיאליזה רציפה של perfusate נגד מאגר הדיאליזה. תשמור על עצמך כדי להשתמש צינורות דיאליזה נמוכים שטף. המשך לשלב 3. </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig2.jpg" /> איור 2: ציור סכמטי של מעגל זלוף. ערכת מוצגי הרכיבים העיקריים של מעגל זלוף ואת כיוון זרימת חיץ. כל הרכיבים מוקפים הכחול כהה נשמרים על 37 מעלות צלזיוס עם אמבט מים / תרמוסטט. 1: דיאליזת חיץ של לפחות 3 פעמים את הנפח של למאגר זלוף הוא מבעבע ברציפות עם 95% O 2/5% CO 2. 2: דיאליזת חיץ חיץ זלוף הם dialyzed ברציפות אחד נגד שני בתוך שפופרת דיאליזה באמצעות משאבת הרים. 3: בשל דיאליזה זה, למאגר זלוף מועשר 9% O 2/5% CO 2 ורמות אלקטרוליטים נשמרות througho מתמידזלוף ut. 4: משאבת הרים מניעה למאגר זלוף לכיוון הכליה. 5: windkessel מסיר גלי peristaltic ופועל כמלכודת בועה. 6: רגשי לחץ (מחובר 4. (משאבת הרים) כדי לשמור על לחץ מתמשך ובמקביל לאפשר זרימה לסירוגין בחופשיות). 7: במהלך זלוף, הכליה נשארה בתא לח עבור לחות באוויר 100% וטמפרטורת כליות 37 ° C. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54712/54712fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 3. הליך כירורגי חלק 1 (עבור תרשים של כל ליגטורות, ראה איור 3) הערה: בצע את כל ליגטורה באמצעות 5-0 חוט כירורגי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר בזריקה intraperitoneal (10 μl / גרם של משקל הגוף, 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​קטמין ו xylazine 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​מומס 0.9% NaCl). אשר עומק מספיק של anesthEsia ידי בדיקת עדר רפלקסים אחורי רגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את העכבר במצב שכיבה בתא לח. להגן על העיניים עם משחת וטרינר. מניחים מזרק 1 מ&quot;ל מתחת השדרה לרומם את כלי המותני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע laparotomy החציוני מפסגת הערווה לפתיחת החזה הראשון העור, אז שרירי הבטן, עם מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המעי ומניח אותו בצד השמאלי של העכבר לרוחב מהבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחרר את השלפוחית ​​מרקמות חיבור ולחקור הן השופכנים ואת השופכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ליגטורה סביב השופכן השמאלי (אני ליגטורה). סגור את זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ליגטורה סביב השופכה (ליגטורה השנייה). סגור את זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ליגטורה &quot;לאסו&quot; סביב השלפוחית ​​כולה (ליגטורה III). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את שלפוחית ​​השתן 1 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cannulate הפתיחה עם צינורות 2 סנטימטר PE 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> III סביב צינור ליגטורה סגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את השופכן שמאלה דיסטלי השופכה מן ליגטורה. דפדףדר כעת מצורף השופכן התקין רק ובחופשיות נעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את אבי העורקים בבטן של רקמות שומן החיבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ליגטורה אמצע אבי העורקים בבטן (IV ליגטורה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ליגטורה סביב האאורטה מתחת לסרעפת בין העורק mesenteric מעולה המטען צליאק (V ליגטורה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ליגטורה סביב עורק mesenteric מעולה (VI ליגטורה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ליגטורה אבי העורקים ישירות מתחת ימינה ומעל עורק הכליה השמאלית (VII ליגטורה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ליגטורה סביב חבילת וריד הזנב (קאווה) (VIII ליגטורה). המשך לשלב 4. </li></ol><img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig3.jpg" /> איור 3: ציור סכמטי של ליגטורות להציב במהלך הניתוח. מראה כללי של הבטן הפתוחה לאחר פיום הבטן. המעי מועבר אל מחוץ שמאלה. L ו- R מצביעים הכליה הימנית והשמאלית. הקווים שחורים להציג את האזור של ליגטורה בהתאמה. ליגטורות ממוקמות ראשונה ולאחר מכן סגור, ברצף הנתון בטקסט. X מסמן את מיקום החתך עבור cannulation אבי העורקים. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54712/54712fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 4. לקרקע של סבב זלוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה הסיבובית למלא את הצינורות עם perfusate. תשמור על עצמך כדי לרוקן את כל בועות האוויר ממנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את המכשיר windkessel לכ מהדרג הבינוני עם perfusate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את מתמר לחץ 0 מ&quot;מ כספית כאשר כל הצינורות מתמלאים ותזרים הוא 0. שמור את מחט זלוף ברמת הכליות במהלך הזמן הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור זרימת ברמה מינימלית קבועה (0.6 מ&quot;ל / דקה) והמשך לשלב 5. </li></ol> 5. חלק הליך כירורגי 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח מהדק בין IV ליגטורה ואת ההסתעפות של רנה עזבהעורק l. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך קטן זנב אב העורקים של IV ליגטורה, נזהר שלא לחתוך את הקיר הגבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרחיב את פתח אב העורקים עם מרחיב כלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cannulate אבי העורקים עם מחט (2 ס&quot;מ, משך PE 50), דוחף את קצה רק כדי מהדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את המהדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחוף את קצה המחט cranially עד שהוא מגיע לצומת של העורק בכליה הימנית לבין אבי העורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> VII ליגטורה סגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IV ליגטורה סגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את החזה עם מספריים על ידי לנתח את הסרעפת. עם חתך אחד, להפריד את אב עורקים, וריד נבוב, לב ועצבים וגטטיבי. עם צעד זה, החיה הוא הקריב באמצעות exsanguination מהירה תחת הרדמה עמוקה רציפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפעיל את תכנית בקרת לחץ של משאבת זלוף. לשמור על לחץ הממוצע בין 80 ל -100 מ&quot;מ כספית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> V. ליגטורה Close </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> VI ליגטורה סגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> VIII ליגטורה סגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כליות חינם מימין של tissu החיבורדואר והטבעה שלה לתוך הקפסולה השומן במספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את אבי העורקים proximally כדי ליגטורה V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את העורק mesenteric מעולה distally כדי ליגטורה VI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את צרור כלי החוצה תומכת כליות, מקפיד לא לחתוך לתוך כלי עצמם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הכבד על הקשר לכליה. תשמור על עצמך כדי לשחרר את הכליה, אך להשאיר חלק קטן של החסיד הכבד אליו, כך הווריד הנבוב נשמר פתוח על ידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את צרור הכליות מתוך העכבר. הסר את העכבר מהאולם הלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ליגטורה &quot;לאסו&quot; סביב החיבור של הכבד והכליות (IX ליגטורה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cannulate את הווריד הנבוב עם קו ורידי (2 ס&quot;מ PE 50). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IX ליגטורה סגור. יצוא ורידי דרך קו הוורידים צריך להתחיל מייד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את התא הלח. </li></ol> 6. ניתוח Downstream <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך השעה הבאה, לפקח באופן רציף את זרימת הדם ואת intravascular לחץ 15. אסוף יצוא ורידי, אשר ניתן להשתמש בהם לצורך ניתוח של, למשל, שחרור רנין כליות 7. אסוף שתן לניתוח ריכוז אלקטרוליטים ו -14 קצב הסינון הגלומרולרי. אחרי שעת 1 של זלוף, כליות ניתן snap-קפוא במשך מערבי סופג או להיות קבוע עבור הדמיה מתקרבות 16. </li></ol>

<ol>
	<li>Carrel, A., Lindbergh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+of+whole+organs.">The culture of whole organs.</a> Science (New York, N.Y.). 81 (2112), 621-623 (1935).</li><li>Skutul, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> &#220;ber Durchstr&#246;mungsapparate Pfl&#252;ger's Archiv. 123 (4-6), 249-273 (1908).</li><li>Nizet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+perfused+kidney:+possibilities,+limitations+and+results.">The isolated perfused kidney: possibilities, limitations and results.</a> Kidney Int. 7 (1), 1-11 (1975).</li><li>Weiss, C., Passow, H., Rothstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+of+flow+in+isolated+rat+kidney+in+the+absence+of+red+cells.">Autoregulation of flow in isolated rat kidney in the absence of red cells.</a> Am J Physiol. 196 (5), 1115-1118 (1959).</li><li>Schurek, H. J., Kriz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+functional+evidence+for+oxygen+deficiency+in+the+isolated+perfused+rat+kidney.">Morphologic and functional evidence for oxygen deficiency in the isolated perfused rat kidney.</a> Lab Invest. 53 (2), 145-155 (1985).</li><li>Stolte, H., Schurek, H. J., Alt, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+albumin+filtration:+a+comparison+of+micropuncture+studies+in+the+isolated+perfused+rat+kidney+with+in+vivo+experimental+conditions.">Glomerular albumin filtration: a comparison of micropuncture studies in the isolated perfused rat kidney with in vivo experimental conditions.</a> Kidney Int. 16 (3), 377-384 (1979).</li><li>Schweda, F., Wagner, C., Kr&#228;mer, B. K., Schnermann, J., Kurtz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserved+macula+densa-dependent+renin+secretion+in+A1+adenosine+receptor+knockout+mice.">Preserved macula densa-dependent renin secretion in A1 adenosine receptor knockout mice.</a> AJP Renal Physiol. 284 (4), F770-F777 (2003).</li><li>Moers, C., Smits, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Machine+perfusion+or+cold+storage+in+deceased-donor+kidney+transplantation.">Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation.</a> N Engl J Med. 360 (1), 7-19 (2009).</li><li>Nicholson, M. L., Hosgood, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+transplantation+after+ex+vivo+normothermic+perfusion:+the+first+clinical+study.">Renal transplantation after ex vivo normothermic perfusion: the first clinical study.</a> Am J Transplant. 13 (5), 1246-1252 (2013).</li><li>Worner, M., Poore, S., Tilkorn, D., Lokmic, Z., Penington, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-cost,+small+volume+circuit+for+autologous+blood+normothermic+perfusion+of+rabbit+organs.">A low-cost, small volume circuit for autologous blood normothermic perfusion of rabbit organs.</a> Art Org. 38 (4), 352-361 (2014).</li><li>Kaths, J. M., Spetzler, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normothermic+Ex+Vivo+Kidney+Perfusion+for+the+Preservation+of+Kidney+Grafts+prior+to+Transplantation.">Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation.</a> J Vis Exp. (101), e52909 (2015).</li><li>Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S. E., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+experimental+orthotopic+transplantation+of+a+bioengineered+kidney.">Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney.</a> Nature Med. 19 (5), 646-651 (2013).</li><li>Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+imaging+of+the+functioning+kidney.">Multiphoton imaging of the functioning kidney.</a> JASN. 22 (7), 1297-1304 (2011).</li><li>Lindell, S. L., Williams, N., Brusilovsky, I., Mangino, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+IPK:+A+Powerful+Tool+to+Partially+Characterize+Renal+Reperfusion+and+Preservation+Injury.">Mouse IPK: A Powerful Tool to Partially Characterize Renal Reperfusion and Preservation Injury.</a> Open Transplant J. 5, 15-22 (2011).</li><li>Wagner, C., De Wit, C., Kurtz, L., Gr&#252;nberger, C., Kurtz, A., Schweda, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin40+is+essential+for+the+pressure+control+of+renin+synthesis+and+secretion.">Connexin40 is essential for the pressure control of renin synthesis and secretion.</a> Circ Res. 100 (4), 556-563 (2007).</li><li>Czogalla, J., Vohra, T., Penton, D., Kirschmann, M., Craigie, E., Loffing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mineralocorticoid+receptor+(MR)+regulates+ENaC+but+not+NCC+in+mice+with+random+MR+deletion.">The mineralocorticoid receptor (MR) regulates ENaC but not NCC in mice with random MR deletion.</a> Pfl&#252;ger's Archiv. , (2016).</li><li>Poosti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+kidney+slices+(PCKS)+to+study+development+of+renal+fibrosis+and+efficacy+of+drug+targeting+ex+vivo.">Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo.</a> Dis Model Mech. 8 (10), 1227-1236 (2015).</li><li>Rahgozar, M., Guan, Z., Matthias, A., Gob&#233;, G. C., Endre, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+facilitates+autoregulation+in+the+perfused+mouse+kidney:+An+optimized+in+vitro+model+for+assessment+of+renal+vascular+and+tubular+function.">Angiotensin II facilitates autoregulation in the perfused mouse kidney: An optimized in vitro model for assessment of renal vascular and tubular function.</a> Nephrology. 9 (5), 288-296 (2004).</li></ol>

The authors have no competing financial interests and nothing else to disclose.

העכבר מבודד כליות perfused הוא כלי לחקר תפקוד כליות בסביבה מבוקרת vivo לשעבר עבור שעה 1, לגשר על הפער בין in vivo ניסויים בבעלי חיים שלמים, אשר עשוי להיות פגומים על ידי ההשפעה של גורמים מערכתיים רבים, ובניסויים במבחנה מגזרי נפרון מבודדים או תאים בתרבית, אשר בהכרח להזניח את ההשפעה של מבנה איבר ללא פגע על תפקוד. יש, לידיעת המחברים, לא טכניקה חלופית שבה לבצע משימה ספציפית זו. מחקרים ביוכימיים על רקמת כליה, לעומת זאת, יכול להתבצע בצורה הרבה יותר פשוטה באמצעות פרוסות כליה 17. בעוד הטכניקה הציגה משמשת כיום בעיקר ללמוד פיזיולוגית כליות, יישומים חדשים רבים הם דנים. לדוגמה, זה יכול לשמש עבור Bioengineering בכליות במהלך decellularization זלוף recellularization 12. בנוסף, זלוף normothermic הממושך של כליות לפני transplantation, עם הממשל של מינונים גבוהים של נוגדות דחייה או הגנום עריכת סמים לתוך perfusate, נחקרת; אפילו במסגרות קליניות 8, 9, 10, 11. הכליה perfused מבודד העכבר הוא כלי מצוין שיכול לשמש עבור יישומים אלה, במיוחד כדי להבהיר את התפקיד של גנים בודדים עם מודלים בנוקאאוט. שלוש מדרגות הן קריטיות עבור ניסוי מוצלח. מאמר זה מספק מעבדות עניין עם האמצעי לשחזר את ההליך. ראשית, המאגר צריך להיות ערוך בצורה כזאת כי הכליה מקבלת את רוב חומרי המזון הדרושים כדאי ממושכות בתנאים לשחזור. איזון חייב להימצא בין תנאים בשליטה מלאה (חיץ סינטטי) ותנאי זלוף ילידים (דם מלא). לכן, אלבומין ו אריתרוציטים יונקים המטוקריט של 10% צריך להיכלל. המטוקריט זה מייצג, ב &#39;ניסיון המחברים, את הפשרה הטובה ביותר בין t מספיקנושא חמצון וצמיגות חיץ נמוך (הגדלת המטוקריט פוחתת לזרום באופן דרמטי במהלך זלוף לחץ-קבוע (להשוות ערכים המוצג במאמר זה לערכי בכליות perfused ללא אריתרוציטים 18)). האיכות והטריות של אריתרוציטים היא קריטית. במהלך שלבי הכביסה, אריתרוציטים צריכים להיות מטופל בזהירות כדי למנוע המוליזה. המאגר צריך להיות טרי ביום הניסוי. שנית, הניתוח צריך להתבצע על ידי מנתח מיומן בתוך זמן קצר ככל האפשר. המנתח צריך לבצע 6 ליגטורה סביב כלי הדם הראשיים המחברים את הכליה אל שאר חלקי הגוף, תוך שמירה על איבוד הדם של בעלי החיים עד למינימום. לקבלת תוצאות אופטימליות, התערבויות הכירורגיות צריכות להתבצע תוך 30 דקות. אם לחץ דם הדם הממוצע של חית טיפות, במהלך ניתוח ממושך או עקב הרדמה, מתחת ל -60 מ&quot;מ כספי, הפרפוזיה הכלייתית כבר תהיה מינימאלית ואת הרקמה תהיה נוטהכדי נמק. כדי לשלול זה, הכליה עזבה ניתן לקחת לאחר ניתוח, כאשר זלוף בכליה הימנית כבר החל, ומשמש קבוצת ביקורת. שלישית, בזמן של זלוף לתפקוד התקין של מנגנון זלוף, מורכב של מעגל קטן-חיה-זלוף סטנדרטי, צריך להיות מובטח. בזמן שהמחשב מבצע את זלוף ידי עצמו, פיקוח אנושי הכרחי, למשל כדי לבדוק בועות במעגל זלוף. הנתונים נציג הניתנים מאפשר הערכה של כדאיות כליות לאחר 1 hr של זלוף vivo לשעבר וההשוואה של ההצלחה הטכנית של כל ביצוע של שיטה זו על הגישה המתוארת במסמך זה. במהלך לפחות 1 שעה, זרימת דם כליות, התנגדות כלי דם, גזים בדם של יצוא הוורידים וקצב סינון גלומרולרי צריכים להישאר יציבים. ישנן מגבלות מסוימות על הטכניקה, אשר אחד צריך לזכור. אפילו קיdney הנפקה מהניתוח המצליח ביותר מסוגלים להמשיך להתקיים רק לזמן מוגבל. המחברים מצאו 1 hr להיות נקודת הזמן הטובה ביותר שבו להפסיק זלוף. בנוסף, בעוד זלוף של הכליה המבודדת מאפשר לחקר האיבר כולו המבודד לעומק, קשה להבדיל השפעות ספציפיות על סוג תא אחד. כליות השווות אחר 1 hr עלולות להראות פגמי מגזרי S3 של tubules הפרוקסימלי ותאי איבר עולה עבים, תוך glomeruli, מגזרי S1, DCTs, ותקליטורים צריכים להישאר שלמים. שימוש החובה של אריתרוציטים, במיוחד מבני האדם, קשור גם סיכונים פוטנציאליים (למשל, זיהומים) עבור הנסיין. לסיכום, הכליה perfused מבודד העכבר היא טכניקה יעילה שבה ללמוד את איבר שלם vivo לשעבר. כמו כל טכניקה, יש לו יתרונות ומגבלות מסוימים. החוקרים מאמינים כי הן היישומים החדשים סעפת הנובעים כיום פרוטוקול זה יכול לספק sufficienמומנטום t עבור מעבדות אחרות כדי לשחזר את המאמץ הזה.

זלוף מבודד איברים כבר את הנושא של מאמץ מתמשך בין פיזיולוגים במשך עשורים רבים 1. הטכניקה מאפשרת את הפונקציה של האיברים, ללא השפעות מערכתיות כגון לחץ דם, הורמונים, או עצבים, כדי להיחקר. קרל אדוארד Loebell נחשב הראשון תאר את זלוף המוצלח של כליות מבודדות, בשנת 1849 2. מאז, מנגנון זלוף עבר עידון משמעותי. פריי גרובר הציגו ריאות מלאכותיות למשאבות חמצון pulsatile זלוף 2 הרציף. בעוד החוקרים מוקדם בעיקר למד הכליות יונקים-כלומר גדול, חזירים 2 וכלבים 3 -The הדו&quot;ח הראשון של השימוש הכליות עכברוש, על ידי וייס ואח &#39;. , היה ציון דרך בחקר זלוף 4 קטן-יונק-איבר. Schurek et al. דיווח על כך שיש צורך להוסיף אריתרוציטים יונקים אל perfusate אם צינורי כליות מספיקחמצון היה להיות מושגת 5. קריטי עבור ניסויים לטווח ארוך היה המבוא של דיאליזה הרציפה של למאגר על ידי אותה קבוצת המחקר 6. בשנת 2003, Schweda et al. היו הראשונים לדווח כליה perfused תפקודית מבודד העכבר (MIPK) 7, מעודן מאוחר יותר על ידי Rahgozar et al. 18 ו ואח &#39;לינדל. 14. למרות שמבחינה טכנית יותר מאתגר מאשר החולדה המבודדת כליות perfused, שימוש MIPK נושא את היתרון של המאפשרים השימוש במגוון רחב של עכברים שעברו שינוי גנטי. מאמר זה מציג את הפרטים של השיטה &#39;המחברים עבור מרוססת כליות עכבר מבודדות במשך שעה 1. השיטה מאפשרת הערכה הרציפה של קצב זרימת כליות, התנגדות כלי דם, שחרור הורמון, ניתוח גז דם, בדיקת שתן, ואת היישום של סמים. בעקבות ההליך, כליות יכולות להיות מעובד לניתוח מולקולרי ביוכימיים, להיות קבוע עבור מיקרוסקופיה, אוהושתל עכבר נמען (איור 1). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig1.jpg" /> איור 1: סקירה כללית של אפשריות קלט / פלט לכליה perfused מבודד. BGA: ניתוח גז דם. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54712/54712fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> טכניקה זו עשויה תקבל תשומת לב גוברת בשנים קרובות, כמו יישומים חדשניים רבים בדיונים מול השחר של זלוף כליות normothermic הממושך לפני ההשתלה (עם או בלי היישום של נוגדות דחייה או תרופות עריכת הגנום) 8, 9, 10 , 11, Bioengineering של הכליות כולו מן הפיגומים decellularized 12, ואת היישום של מינונים גבוהים של צבעי ניאון הדמיה multiphoton 13 </sup&gt;. זהו גם מודל אידיאלי שבה כדי ללמוד את התפקיד של גנים ספציפיים במהלך אי-ספיקת כליות חריפה 14. פרוטוקול צעד אחר צעד ניתן לאפשר מעבדות אחרות לבצע זלוף כלית עכבר המבודד בהצלחה. ראשית, ההרכב והכין למאגר מצוין. לאחר מכן, הניתוח מתואר בפירוט את השלבים הקריטיים מוצגים. נתונים שלישיים, מוצג מייצגות הכנה מוצלחת: זרימת דם כליות, התנגדות כלי דם, GFR, והפרשה-כל אלקטרוליט שבר המדידות התפקודיות ליום micrographs אלקטרוני הילוכים-הכדאיות של המורפולוגיה של מגזרים נפרון שונים של כליות perfused שוות אחר שעה 1 של זלוף.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Perfusion Circuit:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moist chamber 834/8</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2901</td><td></td></tr><tr><td>Cannular with basket and side port</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2947</td><td></td></tr><tr><td>Thermostat TC120-ST5&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-4544</td><td></td></tr><tr><td>ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-0114</td><td></td></tr><tr><td>Reservoir jacketed for buffer solution 1 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3438</td><td></td></tr><tr><td>Reservoir jacketed for buffer solution 0.5 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3436</td><td></td></tr><tr><td>Pressure Transducer APT300&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3862</td><td></td></tr><tr><td>TAM-D Plugsys Transducer</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-1793</td><td></td></tr><tr><td>SCP Plugsys servo controller</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2806</td><td></td></tr><tr><td>Windkessel&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3717</td><td></td></tr><tr><td>HSE-USB data acquisition</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3330</td><td></td></tr><tr><td>Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone</td><td>B.Braun</td><td>7203525</td><td></td></tr><tr><td>PE-Tubing for aorta cannulation 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D.</td><td>Scientific Commodities Inc.</td><td>BB31695-PE/8</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffer reagents:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminoplasmal 10%</td><td>B.Braun</td><td>134518064</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic acid monosodium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-(-)-Malic acid sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1125-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium-L-Lactate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7022-10G</td><td></td></tr><tr><td>alpha-Ketoglutaric acid sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1875-25G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60130-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Creatinine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4255-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Roche</td><td>10835242001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; * 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; * 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Riedel-de-Ha&amp;euml;n</td><td>12074</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr><tr><td>Antidiuretic Hormone dDAVP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2013-1MG</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Inulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter used for erythrocyte filtration</td><td>Macherey-Nagel</td><td>MN 615</td><td></td></tr><tr><td>BGA Analysis:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABL 80 flex</td><td>Radiometer Medical ApS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscope:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Philips CM100 TEM</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the mouse isolated perfused kidney technique

כלית perfused העכבר המבודדת (MIPK) היא טכניקה לשמירת כלית עכבר בתנאי vivo לשעבר perfused ופונקציונלי עבור שעה 1. זהו תנאי הכרחי ללימוד הפיזיולוגיה של האיבר מבודד עבור יישומים חדשניים רבים שעשויים להיות אפשרי בעתיד, כולל decellularization זלוף עבור Bioengineering כליות או הממשל של נוגדות דחייה או תרופות עריכת הגנום במינונים גבוהים פריים הכליה להשתלה. במהלך הזמן של זלוף, הכליה ניתן להשפיע, תפקוד כלייתי ניתן להעריך, ומגוון תרופות מנוהלות. לאחר שהסתיים ההליך, הכליה ניתן להשתיל או מעובדי ביולוגיה מולקולרית, לאנליזה ביוכימית, או במיקרוסקופ. מאמר זה מתאר את perfusate ואת הטכניקה הניתוחית דרושה זלוף vivo לשעבר של כליות עכבר. פרטים של מנגנון זלוף ניתנים ונתונים מוצגים מראים את נiability של הכנת הכליות: זרימת דם כליות, התנגדות כלי דם, ונתונים שתנו כמו micrographs אלקטרונים פונקציונלי, שידור של מגזרים נפרון שונים כמו readouts מורפולוגיים, וכתמים מערביים של חלבוני תחבורה של מגזרים נפרון שונים כמו readout המולקולרית.

עם תארה את השיטה, כליות עכבר מבודדות יכולות להישאר קיימא עבור שעות 1 לפחות. בדקנו את כדאיות הרקמות לאחר 1 hr של זלוף הרציף עם (זרימת דם כליות והתנגדות וסקולרית, ניתוח גז דם של יצוא ורידים, GFR, + Na שבר שתן ו- K + הפרשה, ו osmolality שתן) פונקציונליות מורפולוגיים (אלקטרוני הילוכים מיקרוסקופיה, TEM) שיטות בארבע כליות של wildtype C57Bl / 6 עכברים. בנוסף, כתמים מערביים של חלבוני סמן פסגה של מגזרים אבובית שונים בוצעו, השוואת כליות perfused מבודדות לכליות unperfused של באותן חיות. בכל הניסויים, זלוף לחץ מתמיד שימש, שמירה על לחץ זלוף ב ~ 100 מ&quot;מ כספית (איור 4). בשנת הכליות אלה, זרימת perfusate והתנגדות וסקולרית נשאר יציב לאורך זמן של 55 דקות ב 15.6 ± 0.4 מ&quot;ל / g * דקות של משקל כליות 35 ± 1.0 מ&quot;מ כספית * דק &#39;/ מ&quot;ל, בהתאמה (איור 4 א). ירידה של זרימת perfusate או עלייה בתנגודת כלי דם היא פרמטר רגיש לגבי הפחתת כדאיות רקמות וצריכים להיות במעקב לאורך זלוף בזהירות. גז דם וניתוח אלקטרוליטי 100 דגימות μl נלקחו 60 דקות לאחר תחילת זלוף חשפו ייצור כליות CO 2 וצריכת O 2, כאשר יבואו העורקים הושווה יצוא הוורידים (הטבלה 2). הפרמטרים האחרים לא חלו שינוי בין עורק לוריד (טבלה 2). דגש מיוחד צריך להיות ממוקם על שחרור אשלגן ללא שינוי ורידים, כגידול עלול להתרחש במהלך ניזק לרקמות. GFR, כפי שהוערך FITC-אינולין סיקול 14, נטה לעלות לאורך זמן (איור 4 ב) אך מגמה זו לא נמצאת מובהקת. הפרשה חלקית של נתרן ואשלגן העריכה לאחר 55 דקות של זלוףהוא גדל לעומת המצב vivo (איור 4 ג). Osmolality שתן אינו מוגבה מעל osmolality של יצוא ורידי לאחר 55 דקות של זלוף (איור 4 D). עבור מחקרים מורפולוגיים, הכליות תוקנו לאחר זלוף paraformaldehyde 3% ו glutaraldehyde 0.1% חיץ דיאליזה כפי שתואר לעיל 17. ultrastructure הכליה הוערך עם TEM. מגזרי glomeruli ו S1 של tubules הפרוקסימלי הופיעו ללא שינוי בעיקר לאחר זלוף (איורים 5 א &#39;וב&#39;). חלק, אבל לא בכל המגזרים S2 / S3 של tubules הפרוקסימלי ואת הגפיים עולה עבה כי לא היו קרובים חבילות וסקולרית הראו סימנים של נזק לאיבר, כפי שתואר לעיל בכליות perfused מבודד עכברוש 5 (איורים 5 C ו- D). גם בדיקה מקרוב, האבובית המרוחקת ותעלות איסוף לא להראות סימנים ברורים של נמק (איורים 5, F, E ו- G). לסיכום, הממצאים מורפולוגיים כליות עכבר לשקף את המצב נמצא בכלית perfused מבודדת עכברוש 5. כתמים מערביים של חלבוני סמן פסגה של מגזרי נפרון השונים בכליות perfused מבודדות (snap-קפוא אחרי שעת 1 של זלוף) לעומת כליות נגדיות unperfused של אותו בעל חיים (snap-קפוא לפני תחילת זלוף) לא לחשוף שינויים משמעותיים. למדנו NaPi-IIa (הממוקם tubules הפרוקסימלי), NKCC2 (גפיים עולה עבה), NCC (האבובית המרוחקת), ו ENaC (חיבור tubules / איסוף צינוריות) (איורים 6 א &#39;וב&#39;). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig4.jpg" /> איור 4: הערכת הכדאיות הפונקציונלית של כליות perfused במשך 55 דקות. א) &lt;/ Strong&gt; במהלך זלוף לחץ מתמיד, התנגדות כלי הדם ואת זרימת perfusate נותר יציב במשך 55 דקות. 15 הדקות הראשונות אינן נכללות בגלל ההשתנות הגבוהה לראות תמיד בתקופה זו. B) קצב הסינון הגלומרולרי (FITC-אינולין) של ארבעה הכליות העריכו לאחר 25 ו -55 דקות המוצג עלייה משמעותית קלה אך לא לאורך זמן. C) הפרשה חלקית של נתרן ואשלגן העריכה לאחר 55 דקות של טפטוף. D) פלזמת ורידים ושתן osmolality לאחר 55 דקות של טפטוף. n = 4 בכל הניסויים. הנתונים מוצגים כאמצעי ± SEM. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54712/54712fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig5.jpg" /> איור 5: הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים. נציג מורפולוגיה של D<html> מגזרי נפרון ifferent של perfused הכליות לעבר נקודת הסיום של 1 שעה. א) glomeruli הם שלמים. פירוט של podocyte בתוך glomerulus. B) קטע S1 של אבובית הפרוקסימלי. מגזרי S1 הם שלמים. C) S2 / קטע S3 של אבובית הפרוקסימלי. חלק, אבל לא בכל המגזרים S2 / S3 של tubules הפרוקסימלי הם נמקי מאוד. תאי המראה נפוחים ולהיראות גדול ניזק תאי. מתווית צינורי נשמרה רק על ידי קרום המרתף. D) עבה עולה איבר (TAL). TALs אלה רחוקים החבילות וסקולרית להראות הסימנים הראשונים של ניוון hydropic. ממברנות לומינל להופיע דליל ושביר. E) האבובית המרוחקת (DCT). DCTs הם שלמים. F) הפירוט של infoldings basolateral של תא DCT. האנדותל Fenestrated, קרום במרתף, infoldings basolateral, ואת המיטוכונדריה הם שלמים. G) איסוף צינור (CD). תקליטורים הם שלמים.e.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig5large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig6.jpg" /> איור 6: כתם המערבי של Apical מרקר חלבונים בכליות perfused מבודדים בהשוואת Unperfused ולכליות על ידי בעלי החיים הזהים. א) כתמים מערביים של כליות perfused עבור שעה 1 וכליות unperfused. NaPi-IIa הוא נציג אבובית הפרוקסימלי. NKCC2 מייצג על אותו איבר עולה עבה. NCC ו- NCC פוספורילציה ב תראונין 53 (pT53 NCC) נמצאים באופן בלעדי האבובית המרוחקת. יחידות משנת אלפא וגמא של ENaC באורך המלא שלהם והמוצרים שלהם בקעו proteolytically מוצגות נציג צינור אבובית / איסוף חיבור. ב) כימות של א) לא גילה הבדלים משמעותיים בין הכליות perfused fאו 1 hr וכליות unperfused. n = 3 בניסויים בכלל. הנתונים מוצגים כאמצעי ± SEM וערכים בודדים מוצגים. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54712/54712fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="שולחן 1" src="/files/ftp_upload/54712/54712tbl1.jpg" /> טבלה 1: רכב פתרונות דיאליזת הצפה. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54712/54712tbl1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של השולחן הזה.</a> <img alt="טבלה 2" src="/files/ftp_upload/54712/54712tbl2.jpg" /> טבלה 2: גז דם אלקטרוליט ניתוח של יבוא עורקי יצוא ורידים של perfused עכבר כליות 60 דקות לאחר תחילת זלוף (n = 4). הנתונים מוצגים כאמצעי ±SEM.

Watch this Scientific Journal Video about The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique at JoVE.com

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

כלית perfused העכבר המבודדת (MIPK) היא טכניקה לשמירת כלית עכבר בתנאי vivo לשעבר perfused ופונקציונלי עבור שעה 1. החוצצים טכניקה כירורגית מתוארים בפירוט.

טכניקת כלית עכבר המבודדת perfused

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

the-mouse-isolated-perfused-kidney-technique

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

21.6K Views.  University of Zürich.  כלית perfused העכבר המבודדת (MIPK) היא טכניקה לשמירת כלית עכבר בתנאי vivo לשעבר perfused ופונקציונלי עבור שעה 1. החוצצים טכניקה כירורגית מתוארים בפירוט. 

Video: The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

Use of a Hanging-weight System for Isolated Renal Artery Occlusion

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients revealed that only a mild increase in serum creatinine levels (0.3 to 0.4 mg/dl) is associated with a 70% greater risk of death than in persons without any increase 1. Along these lines, surgical procedures requiring cross-clamping of the aorta and renal vessels are associated with a renal failure rates of up to 30% 4. Similarly, AKI after cardiac surgery occurs in over 10% of patients under normal circumstances and is associated with dramatic increases in mortality. AKI are also common complications after liver transplantation. At least 8-17% of patients end up requiring renal replacement therapy 5. Moreover, delayed graft function due to tubule cell injury during kidney transplantation is frequently related to ischemia-associated AKI 6. Moreover, AKI occurs in approximately 20% of patients suffering from sepsis 6.The occurrence of AKI is associated with dramatic increases of morbidity and mortality 1. Therapeutic approaches are very limited and the majority of interventional trials in AKI have failed in humans. Therefore, additional therapeutic modalities to prevent renal injury from ischemia are urgently needed 3, 7-9. 
To elucidate mechanisms of renal injury due to ischemia and possible therapeutic strategies murine models are intensively required 7-13. Mouse models provide the possibility of utilizing different genetic models including gene-targeted mice and tissue specific gene-targeted mice (cre-flox system). However, murine renal ischemia is technically challenging and experimental details significantly influence results. We performed a systematic evaluation of a novel model for isolated renal artery occlusion in mice, which specifically avoids the use of clamping or suturing the renal pedicle 14. This model requires a nephrectomy of the right kidney since ischemia can be only performed in one kidney due to the experimental setting. In fact, by using a hanging-weight system, the renal artery is only instrumented once throughout the surgical procedure. In addition, no venous or urethral obstruction occurs with this technique. We could demonstrate time-dose-dependent and highly reproducible renal injury with ischemia by measuring serum creatinine. Moreover, when comparing this new model with conventional clamping of the whole pedicle, renal protection by ischemic preconditioning is more profound and more reliable. Therefore his new technique might be useful for other researchers who are working in the field of acute kidney injury.

A precise murine model for acute kidney injury (AKI) due to ischemia is an important tool to investigate acute kidney injury and possibly find therapeutic tools to treat renal injury. The hanging weight system offers a tool for immediate and reliable renal artery occlusion and reperfusion without causing renal congestion.

השימוש במערכת תלוי במשקל עבור חסימת עורק הכליה מבודדת

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients ...

Medicine

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and podocytes with their slit diaphragms. The delicate structure of the glomerular filter, especially the slit diaphragm, relies on the interplay of diverse cell surface proteins. Studying these cell surface proteins has so far been limited to in vitro studies or histologic analysis. Here, we present a murine in vivo biotinylation labeling method, which enables the study of glomerular cell surface proteins under physiologic and pathophysiologic conditions. This protocol contains information on how to perfuse mouse kidneys, isolate glomeruli, and perform endogenous immunoprecipitation of a protein of interest. Semi-quantitation of glomerular cell surface abundance is readily available with this novel method, and all proteins accessible to biotin perfusion and immunoprecipitation can be studied. In addition, isolation of glomeruli with or without biotinylation enables further analysis of glomerular RNA and protein as well as primary glomerular cell culture (i.e., primary podocyte cell culture).

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Here we present a protocol for murine in vivo labeling of glomerular cell surface proteins with biotin. This protocol contains information on how to perfuse mouse kidneys, isolate glomeruli, and perform endogenous immunoprecipitation of the protein of interest.

בידוד של Glomeruli, In Vivo תיוג של חלבונים פני שטח התא Glomerular

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Biochemistry

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

השתלת כליה עכבר: מודלים של דחיית השתל

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.

Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

הפקת יעילות אמינה גבוהה של תאים מכליות חיסון

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

Immunology and Infection

Comparative Proteomic Analysis of Whole Kidney, Medulla, and Cortical Tubules in Diabetic Pathogenesis of Kidney Injury in Mice

Defining the sequence of events in renal disease is the cornerstone of clinical practice in the nephrologist toolkit. Tissue proteomic analyses are a significant approach to understanding the fundamental physiological and molecular processes of renal pathophysiology. The methods and protocols we present here will allow for the molecular dissection of the kidney in each specific region of interest related to disease sequelae. To determine the effects of disease on specific kidney regions and structures with unique functions, the goals of this protocol are to demonstrate simplified mouse kidney compartmentalization and renal cortical tubule isolation techniques in tandem with streamlined label-free quantitative proteomic workflows. Combining these methods will assist in the identification of perturbed molecular patterns in the whole kidney, medullary compartments, and cortical tubule structures of kidneys, with the ultimate and eventual goal of single-cell proteomics in pathological contexts. Applying these methods in virtually any disease model will be helpful in delineating mechanisms of pathology related to kidney dysfunction.

Here, we present a detailed protocol for proteomic analysis of the whole kidney, isolated cortical tubule, and medullary proteomes. The study also compares regional proteomes in a diabetic mouse model and non-diabetic mice.

ניתוח פרוטאומי השוואתי של כליות שלמות, מדולה וצינורות קליפת המוח בפתוגנזה סוכרתית של פגיעה בכליות בעכברים

Defining the sequence of events in renal disease is the cornerstone of clinical practice in the nephrologist toolkit. Tissue proteomic analyses are a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

בידוד של עכבר כליות תושב CD8+ תאי T לניתוח ציטומטריה זרימה

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) imaging. They have received great attention in all research areas for the potential to analyze microscopic multicellular structures that extend over macroscopic distances. Given that kidney tubules, vasculature, nerves, and glomeruli extend in many directions, which have been only partially captured by traditional two-dimensional techniques so far, tissue clearing also opened up many new areas of kidney research. The list of optical clearing methods is rapidly growing, but it remains difficult for beginners in this field to choose the best method for a given research question. Provided here is a simple method that combines antibody labeling of thick mouse kidney slices; optical clearing with cheap, non-toxic and ready-to-use chemical ethyl cinnamate; and confocal imaging. This protocol describes how to perfuse kidneys and use an antigen-retrieval step to increase antibody- binding without requiring specialized equipment. Its application is presented in imaging different multicellular structures within the kidney, and how to troubleshoot poor antibody penetration into tissue is addressed. We also discuss the potential difficulties of imaging endogenous fluorophores and acquiring very large samples and how to overcome them. This simple protocol provides an easy-to-setup and comprehensive tool to study tissue in three dimensions.

The combination of antibody labeling, optical clearing, and advanced light microscopy allows three-dimensional analysis of complete structures or organs. Described here is a simple method to combine immunolabeling of thick kidney slices, optical clearing with ethyl cinnamate, and confocal imaging that enables visualization and quantification of three-dimensional kidney structures.

ניקוי אופטי ודימות רקמות כליות של אימונוולילד

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

An Effective Mouse Model of Unilateral Renal Ischemia-Reperfusion Injury

Ischemia-reperfusion injury (IRI) is the leading cause of acute renal failure and is a significant contributor to delayed graft function. Animal models are the only available resources that mimic the complexities of the IRI-associated damage encountered in vivo. This paper describes an effective mouse model of unilateral renal IRI that delivers highly reproducible data. Ischemia is induced by occluding the right renal pedicle for 30 min followed by reperfusion. In addition to the surgical procedure, a sequential overview of the expected physiological and histopathological changes following renal IRI will be provided by comparing data from seven different reperfusion times (4 h, 8 h, 16 h, 1 day, 2 days, 4 days, and 7 days). Critical data for planning experiments ahead, such as mean surgical time, average anesthetic consumption, and body weight changes over time, will be shared. This work will help researchers implement a reliable renal IRI model and select the appropriate reperfusion time that aligns with their intended investigative goals.

Renal ischemia-reperfusion injury is associated with high morbidity and mortality in hospitalized patients. Here, we present a simple and effective mouse model of unilateral renal ischemia-reperfusion injury and provide a sequential overview of representative pathological changes observed in the kidney.

מודל עכבר יעיל של פגיעה חד-צדדית באיסכמיה-רפרפוזיה של הכליה

Ischemia-reperfusion injury (IRI) is the leading cause of acute renal failure and is a significant contributor to delayed graft function. Animal models ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). Therefore, assessing mitochondrial function in primary TECs may provide valuable insight into the bioenergetic status of the cells, providing insight into the pathophysiology of CKD. While there are a number of complex protocols available for the isolation and purification of proximal tubules in different species, the field lacks a cost-effective method optimized for&#160;tubular cell isolation without the need for purification. Here, we provide an isolation protocol that allows for studies focusing on both primary mouse proximal and distal renal TECs. In addition to cost-effective reagents and minimal animal procedures required in this protocol, the isolated cells maintain high energy levels after isolation and can be sub-cultured up to four&#160;passages, allowing for continuous studies. Furthermore, using a high throughput extracellular flux analyzer, we assess the mitochondrial respiration directly in the isolated TECs in a 96-well plate for which we provide recommendations for the optimization of cell density and compound concentration. These observations suggest that this protocol can be used for renal tubular ex vivo studies with a consistent, well-standardized production of renal TECs. This protocol may have broader future applications to study mitochondrial dysfunction associated with renal disorders for drug discovery or drug characterization purposes.

This protocol provides a cost-effective approach to isolate and characterize mouse primary renal tubular cells that can subsequently be sub-cultured to assess renal biological functions ex vivo, including mitochondrial bioenergetics.

ניתוח השטף חוץ-תאי בידוד, אפיון, תפוקה גבוהה של העכבר הראשי כליות צינורי בתאי אפיתל

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Glomeruli Isolation: A Technique to Obtain Intact Glomeruli from Murine Kidney

Source: Eymael, J. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/60324" target="_blank">Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video describes the method to isolate intact glomeruli from mouse kidneys. The encapsulated and decapsulated glomeruli thus obtained can further be used for culturing parietal epithelial cell outgrowths from the murine kidney.

בידוד גלומרולי: טכניקה להשגת גלומרולי שלם מכליה מורין

Source: Eymael, J. et al. Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation. J. Vis. Exp. ...