Name: tissue engineering by intrinsic vascularization in an in vivo tissue engineering chamber
Uploaded: 2016-05-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
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この作品は、NHMRCとスタッフォード・フォックス医療財団からの助成金によってサポートされていました。著者はスー・マッケイ、リリアナペペ、アンナDeftereosと実験的医療や外科ユニットのアマンダRixon、セントビンセント病院、メルボルンの外科的な支援を認めます。サポートはまた、ビクトリア朝の州政府のイノベーション省、産業と地域開発の運用インフラ支援プログラムによって提供されています。

ここで説明するプロトコルは、セントビンセント病院メルボルン、オーストラリアの動物倫理委員会によって承認されており、オーストラリア国立保健医療研究評議会のガイドラインに厳守下で行いました。 注：二室プロトコールを以下に記載します。 2つの異なるモデルおよびその特定のチャンバ設計は、 図1に示されている。チャンバは、（1）（ラット動静脈ループ室モデルの場合）、ポリカーボネートで作られています。これは、内径13ミリメートル、高さ4ミリメートルを有する円筒形です。壁内の1つのポイントでウィンドウが椎弓根のために妨げられることなくアクセスすることができます。 （ラットのフロースルー茎室モデルの）第2のモデルでは、チャンバは、アクリル製の矩形（10×4×8 mm 3で内部寸法）です。それは、チャンバを犯すように大腿動脈および静脈に適応するように両側に2つの1.5ミリメートルの開口部を有します。 1.ラット動静脈ループ商工モデル（Oneチャム動物当たりBER） 注：手術を開始する前に、すべての機器が適切に滅菌されていることを確認してください。同様に、滅菌タオル上の機器の残りを確保し、手続き中の汚染を避けるために、手術野から合理的な距離にあります。 <ol><li>手術のための動物の準備<ol><li>動静脈ループを作成するための血管のサイズが大きいために、少なくとも250gのラットを使用してください。 </li><li> 4％のイソフルラン吸入で動物をAnaesthetize。つま先ピンチに無応答性を評価することによって麻酔の十分な深さを裏付けます。麻酔した後、適切に2％イソフルランと手順を通して麻酔動物を維持します。 </li><li>温暖化パッド上に仰臥位で動物を置き、手術中の乾燥を防ぐために、目に無菌潤滑剤を適用します。 </li><li>電気かみそりを使用して、両方の股間を剃ると湿ったガーゼで髪を削除します。 </li><li>クロルヘキシジンと手術部位をPREP/ 70％エタノール溶液および無菌タオルで動物をドレープ。鎮痛剤としてカルプロフェン（5 mgの/ kgを皮下）の単回投与を管理します。 </li></ol></li><li>大腿静脈グラフトの収穫<ol><li> ＃15ブレードを使用して、鼠径靱帯に左鼠径部に平行に長さ4cmの皮膚切開を行います。これは、鼠径部脂肪パッドを露出させます。 </li><li>上腹部管に基づいて、その血管茎に取り付けられ、それを残してはさみで円周方向に脂肪パッドを通してカット。 </li><li>マイクロはさみを使用して、腹壁とその下にある大腿血管の間にフィルム状の結合組織の癒着を解放します。 </li><li>腹壁に開創器を置き、内側引き出します。これは、鼠径靱帯と大腿血管の全長を公開しています。 </li><li>マイクロ鉗子を使用し、湾曲したハサミを静かに引っ張り、切断によって上腹部静脈を分析し、その周囲の脂肪からそれを分離します。ループを構築するときに、この静脈は、テザーとして機能します。 </li><li> Usinグラムマイクロ鉗子湾曲マイクロハサミは大腿血管や神経の心窩部支店への分岐末端に鼠径靭帯からのすべての方法を含む血管周囲鞘を開きます。 </li><li>マイクロ鉗子を使用して、その外膜によって大腿静脈をピックアップし、静かに周囲の組織および添付動脈からそれを分離します。離れて組織を引っ張り、それを介して切断することにより、マイクロ鉗子湾曲ラウンド尖ったマイクロハサミでこれを行います。 注：これは血栓症の脆弱性が発生内膜への外傷を引き起こす可能性があるとして、静脈壁の全体の厚さをつかむことはありません。 </li><li>ライゲーション側枝は10/0ナイロン縫合糸で切開中に発見されたまたはバイポーラ凝固でそれらを凝固します。 </li><li>大腿静脈完全に無料で、4/0シルク縫合糸で、その近位端および遠位端を連結。少なくとも10ミリメートルの長さの静脈グラフトを取得することを確認しますと、男のロープのテザーとして使用する上腹部の枝の約0.5センチメートル長を含みますチャンバー内の開ループを保持します。 </li><li>マイクロ鉗子とストレートマイクロはさみを使用して、静かに引き出し、切断することにより、移植片の端部から外膜をトリミングします。これはまた、顕微吻合前に、後に行うことができます。 </li><li>ヘパリン添加生理食塩水（ヘパリンの10 U / ml）で静脈グラフトをフラッシュし、溶液中で休むようにそれを残します。連続走行4/0絹縫合糸と2つまたは3つの追加の簡単な中断されたステッチを使用して傷を閉じます。 </li></ol></li><li>商工会議所の動静脈ループと移植の作成<ol><li>繰り返しは、対側肢にまったく同じ方法で、1.2.4に1.2.1を繰り返します。 </li><li>マイクロ鉗子を使用して、上腹部動脈と静脈の両方を分析し、単離周囲の脂肪パッドを形成します。静かに血管から組織を引っ張ることによってこれを行います</li><li>マイクロ鉗子を使用して、その外膜により大腿動脈をピックアップし、周囲の組織からそれを解放します。マイクロ鉗子湾曲ラウンド尖ったマイクでこれを行います離れて組織を引っ張り、それを切断することにより、roのはさみ。その側枝を結紮または凝固。 </li><li> 4/0絹縫合糸を用いて、上腹部管の出現に大腿動脈と静脈の先端を連結。 </li><li>大腿動脈と静脈のそれぞれの近位に単一のクランプを置きます。鋭いストレートマイクロはさみを使用して、上腹部枝の出現に各容器の先端でクリーンな横カットを行います。船の下の滅菌プラスチックコントラストの背景を配置します。 </li><li>すべての血液が内腔から除去されるまで、ヘパリン化生理食塩水の寛大な量と激しく血管をフラッシュします。 </li><li>術野に静脈グラフトを持参し、必要に応じて、ステップ1.2.10に従って船 &#39;末端から任意の冗長な外膜を除去します。 </li><li> 10/0ナイロン縫合糸と顕微吻合の両方を実行します。大腿静脈と大腿動脈への遠位端部に静脈グラフトの近位端を吻合。これがf血液が流れるようになります静脈グラフトの内側バルブから抵抗なく静脈側への動脈をROM。 注：任意のねじれずに大腿血管とその自然な位置にある静脈グラフトの残りの部分を確認してください。 </li><li>両方の吻合部に漏れがないか確認してください。上に脂肪の小片を置き、静かに5〜10分間圧縮することにより、吻合部位から出てくる非脈動血のように見える小さな漏れを解決します。急速にフィールド全体をあふれさせるより大きな脈動漏れが追加ステッチが必要になります。 </li><li>動静脈ループの開存性を確認してください。大腿動脈の穏やかな閉塞は、大腿静脈内の同じがそれをガブガブ飲むべきである、それが縮小する必要があります。 </li><li>ねじれやよじれのないその自然な位置にある後者の休息と動静脈ループの下に組織工学室のベースを置きます。 </li><li> 6/0ナイロン縫合糸で鼠径靭帯およびその下の筋筋膜に、チャンバのベースを固定します。 </li><li>上に蓋を置きベース大腿血管は、ノッチ（室側の窓）を通ってチャンバに入るようにします。蓋を閉じたとき、それはテザーを所定の位置に動静脈ループを保持するように作用チャンバーベースと蓋との間で、心窩部枝をキャッチしていることを確認します。 </li><li>連続走行4/0絹縫合糸と2つまたは3つの追加の簡単な中断されたステッチを使用して傷を閉じます。 </li><li>動物は加温パッド上で麻酔から回復することを可能にします。 </li><li>それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。同様に、完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返しません。 24時間後、鎮痛剤としてカルプロフェン（皮下5ミリグラム/キログラム）の別の単一用量を投与。 </li><li> 5日間のための局所抗生物質軟膏で傷口を扱います。傷口が開いている場合、1.1.5を介してステップ1.1.2のように動物を麻酔し、1.3のように傷口を閉じます0.14。毎日、動物の健康状態を監視します。動物はinacitivity、食欲不振、体重減少及び色の損失の複数の適度な兆候を示している場合（23 G針で0.25ミリリットルで163ミリグラム/ kg）を腹腔内lethabarb注入の致死量を用いて動物を安楽死させます。 </li></ol></li></ol> 2.フロースルー椎弓根商工会議所（動物ごとに2つのチェンバース） <ol><li>手術のための動物の準備<ol><li>繰り返しは、1.1.4を介して1.1.1を繰り返します。二つのチャンバは、単一のラットの双方の鼠径部領域に移植することができます。 </li></ol></li><li>大腿血管の単離と商工会議所の挿入<ol><li>繰り返しは、1.2.8を介して1.2.1を繰り返します。 </li><li>動脈と完全に周囲の組織から解放され、その枝を結紮静脈の両方で、術野にチャンバをもたらします。 </li><li>チャンバーベースがないねじれやよじれがないことを確認することの対応するスリットに無傷の大腿血管のそれぞれを置きます。 </li><li> attachiによってチャンバを閉じますベースに蓋をngの。連続走行4/0絹縫合糸と2つまたは3つの追加の簡単な中断されたステッチを使用して傷を閉じ、前述のように、動物が回復することを可能にします。 </li></ol></li></ol> 3.チェンバースの収穫と組織処理<ol><li>実験の時間点（4-6週間移植後）に到達したら、ステップ1.1.2のように動物を麻酔し、1.1.5まで手順1.1.3を繰り返します。 </li><li> ＃15ブレードを使用して傷を開き、チャンバが完全に露出するまでハサミで組織を切断。 </li><li>その後、遠位方向に血液を牛乳、静かに2マイクロピンセットで血管を閉塞し、最終的には近位鉗子を解放：血管開通のための構築物およびテストに大腿骨近位部の血管を公開します。容器は再び血液でいっぱいになると、これは、開通性を確認します。動静脈ループの場合には近位大腿血管を結紮し、両方の近位および遠位番目の場合には電子フロースルー設定、および一括含む組織でチャンバーを削除します。 </li><li>実験の最後に、（23 G針で0.25ミリリットルで163ミリグラム/ kg）を腹腔内lethobarb注入の致死量を用いて動物を安楽死させます。 </li><li> 24時間室温で4％パラホルムアルデヒド中で組織を修正しました。ディバイド複数の横断切片に組織（1-2 mm厚）、パラフィンワックスまたはそれぞれパラフィン切片のための最適な切削温度化合物（5ミクロン）または凍結切片（10μm）を、中に埋め込 ​​む。3,4,8,17,22、 24 </li><li>組織の一般的な形態を調べるために、このようなヘマトキシリン​​およびエオシンなどの日常的な組織学的染色を実行します。例えば心筋細胞のための心筋トロポニンTの免疫染色を関心、3,4,8,17,22,24,29の細胞型を同定するための特定の抗体を用いて免疫組織化学染色を行ってください。 </li></ol>

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著者には競合する利益を宣言しません。

微小循環のエンジニアリングは、現在、二つのアプローチを通して、本質的に検討されています。最初は、移植されたときに、ホストの血管床からの毛細血管は、このように周囲に栄養素だけでなく、の配信を保証する、吻合と呼ばれるプロセスを通じて移植構築物のものと接続するようにin vitroでの構文内で高度に相互接続血管網を開発したが含ままた、コア。21,32,33にこれは前血管新生と呼ばれています。毛細管発芽前または同時に移植された細胞の分化と組織の成長とのいずれかが発生するように第2のアプローチは、 生体内で直接宿主自身の血管系を強化しようとします。17,34 ここで提示インビボ組織工学室プロトコルでは、いずれかの動静脈ループまたはフロースルー茎構成と、動脈と静脈を配置することによって、後者の概念を活用します。保護された空の空間内に、時間をかけて新しい毛細血管の有意な発芽および形成を可能にするチャンバ3の利点は、インビトロ操作の（1）存在しないことを含みます。 （2）ホストによって拒否されることはありません完全に自家血管網の発生; （3）それは、虚血を起こしやすい組織構造物をレンダリングする1〜7日の間に取ることができ吻合期間を必要としないという事実を。35,36 それにもかかわらず、発生する発芽重要なキャピラリー、移植組織も不十分供給される期間の周り3-7日かかることに留意しなければならない。3遅延セルの注入室が十分に血管化された後、実際には生存率の改善を示しています。 17更なる利点は、室」材料（ すなわち、ポリカーボネートおよびポリアクリル酸）の生体適合性および非免疫原性を含んでいます。また、剛性の非折り畳み式チャムBERは、組織と合併し、そうでない場合は、拡張を妨げるし、新たに形成された組織の収穫が困難になるだろう周囲の環境と統合することなく成長する血管系のための保護された空間を提供します。これに対して、チャンバが閉じているという事実は、組織の成長を制限することができます。これは、しかし、今閉じものよりも、より効果的に組織を成長させることが示されている有孔チャンバを使用する動静脈ループモデルで対処されてきた。37 ここで提示組織工学室プロトコルは、再現性の高いですが、室はめったに通常、約70％の容量を、完了に記入しないことが強調されるべきです。一貫性のある結果は、いくつかの重要なステップと技術的な問題を考慮することを条件とする達成されます。血管での作業時の椎弓根の開通は顕微吻合が行われている場合は特に、究極の目的です。我々は一貫してVASC場合何の組織が成長しない発見しましたウラル椎弓根血栓症後早期手術。開通性に影響を与える要因は、大きく四つのカテゴリー、すなわち外科技術、血流、血栓症および痙攣に分類することができます。 まず、繊細な手術手技が成功への鍵です。この意味では、これらの手順、動静脈ループの生成を伴う特に1を容易に次の非生体モデルで、続いてラットの大腿血管の最初の実施することによって取得することができる外科技術の特定のレベルを必要とすることに留意すべきです原則と技術がここと他の場所に記載。血管壁、特に内膜に38のダメージは、避けなければならないすべての回で決して賢明な、ストレッチ過度の防止、血管壁の全層をつかんなかっ含ま血管の適切な取扱いにより、バイポーラ凝固の使用、および動静脈ループの場合には、細心かつ非外傷性顕微吻合の性能。ヘパリン添加生理食塩水で洗い流すことは、凝固を防ぐのに役立ちますが、それは細かい外科技術を置き換えることはありません。第二に、血流の要因は主に乱流およびうっ血に関連します。血管のねじれ、曲がりやよじれに二次的乱流が血栓形成を促進します。したがって流線無制限の流れは、動静脈ループとフロースルーモデルの両方に確保されなければなりません。この意味で、動静脈ループモデルにおける心窩部支店のテザリング効果は、曲げ防止することが不可欠です。何らかの理由でこれらのブランチが使用できない場合は、周囲の組織への血管壁からの単純な10/0ナイロンステッチは慎重に代わりに配置する必要があります。動静脈ループ手順の間に吻合部位での静的血液はまた、高度に血栓形成され、前および吻合を通して、ヘパリン化生理食塩水と激しく容器を洗い流すことによって防止しなければなりません。このような術野と最もimportaからの汚染物質などの第三に、プロ血栓要因ntly吻合内側外膜の断片の存在は避けるべきです。前顕微縫合に正しく終了容器を準備し、定期的にフラッシュすることにより、クリーンフィールドと吻合を維持することが動静脈ループを構築する際に考慮すべき重要な側面です。最後になりましたが、血管攣縮の問題があります。血管痙攣の病態生理は完全に解明されていないにもかかわらず、局所および全身の両方の要因に起因する可能性があります。局所因子は、血管外傷、手術野における血液の存在と組織乾燥が含まれます。全身の要因は、他の一方で、低いコア温度、低血圧、痛みに交感神経反応を含んでいる。38 このように、動静脈ループとフロースルーモデルの両方で、一緒に繊細な手術手技と動物の適正な取扱いと準備はいくら強調してもしすぎることはできません。けいれんを解決するための戦略は、温かい生理食塩水または希釈していないと灌漑を含みます1％キシロカインと5〜10分間の休止期間を持ちます。血管拡張および外膜の剥離はまた、その局所交感神経作用にけいれんを緩和するのを助けることができる。38顕微吻合し、それが意味する技術的課題を実行する必要性を回避するために、カフの技術が他の場所に記載のように使用することができる。 図39は、この技術は、構成されてい容器の1を挿入すると、カフに終わるのは、それを裏返すと円周6/0ナイロン縫合糸で固定します。次に、他の容器端部は、カフの上にスライドさせて同様の方法で固定されています。 組織工学室は、実験的研究の可能性の新しいウィンドウを開いていると着実に潜在的な臨床目的に向かって進んでいます。今までは、ここで紹介するモデルは、異なる系統の組織の生成のために主に使用されている。4,7,8,17,22、24,25,27-29,37,40はそれにもかかわらず、彼らは数を持っています他の潜在的なアプリケーション。例えば、我々ヘクタールヒト人工多能性幹細胞の移植後の奇形腫形成に効果的で比較的速いモデルとしてフロースルーチャンバを使用しまし。41,42従って、このアプローチは腫瘍のない組織工学を達成するために、「品質管理」ツールとして使用することができます多能性幹細胞を用いました。また、薬物毒性試験は、チャンバ内に増殖させたヒトの組織で検討することができました。同様に、病理学的組織の生成は、疾患のモデリングおよび薬物検査に向けた興味深いアプローチをもたらす可能性があります。最後に、組織工学室はまた、 インビボで細胞の運命の組織の成長と追跡を研究するための潜在的なモデルになるかもしれません。 結論として、我々は、2つの異なる方法を介して動物における皮下室の配置を含むプロトコルを記載している：顕微静脈ループ、またはフロースルー茎構成を使用します。技術が高度に再現可能であり、一貫性のある結果をもたらします。その使用時間これまでの組織工学の分野で主に利用されてきたように、しかし、これらのチャンバは素晴らしいアプリケーションであるかもしれないいる他の潜在的な研究分野があります。

機能的な血管化組織を作製する組織工学アプローチを使用して再生医療における新興のパラダイムである。損傷した組織または欠陥のある臓器の置換のために新しく健康な組織を操作するために1,2の多くのアプローチが開発されている、3-6実験で小動物モデルで有望な臨床的可能性。7,8。しかし、血管新生は、臨床的に関連する大きさの組織を成長させる可能性を制限する組織工学のための大きな課題の一つである。9 組織は新しい血管が受信者血管床から成長外因性経路のいずれかに従うと、移植された組織は、10または脈管構造が成長し、新たに開発組織と一体となって展開する内因性血管新生経路を構築を通じて侵入する血管新生化するための現在のアプローチ。11外因性アプローチ伝統的な足場上に細胞を播種することを含みます血管の内部成長が遅すぎると非常に薄いインプラント（としてin vitroで 、以前に培養培地により供給される栄養素は、血液循環から供給されることを期待して生きている動物に完全な構築物を注入する。12,13コンセプトは&lt;単純化されて1〜2ミリメートルの厚さ）が生存したままになります。十分かつ迅速な血管新生によって栄養と酸素を提供することは、骨、筋肉、脂肪および固体臓器など、より複雑で、より大きな組織工学代用を成長させるための任意の成功した試みの心臓部である。14,15組み込み血管新生は、の可能性を提供していますより大きな構築物は、その拡大の血液供給に見合ったプログレッシブ組織の成長によって開発します。一つのデザインは、細胞播種足場を伴うまたは伴わない血管茎のチャンバ内へのin vivoでの移植である。5,6これは厚い本質的に血管新生した組織の生成のための新しい手順への道を開いた。16,17 &lt;/ P&gt; より最近では、戦略は、移植前に、事前血管を通す組織移植片に開発されてきました。これらの組み込まれた血管ネットワークは、移植厚い組織移植片のすべての部分の生存率を改善するための完全な血液供給の迅速な提供を可能にする注入でホスト血管と吻合することを目的としている。18 私たちは、灌流血管茎と細胞含有生体材料を含む皮下移植半硬質の密閉チャンバを伴う小動物におけるインビボ血管組織工学モデルを開拓してきました。室は、移植された血管からの血管新生発芽を刺激し、虚血性環境を作成します。3血管茎が再構成された動静脈ループまたは無傷のフロースルー動脈と静脈をいずれかであることができる。3-6,19この血管茎の芽機能と豊富な動脈を両方の芸術でリンク-capillary、静脈網erioleと静脈は血管茎で終わる。3,20また、周囲の中空の支持室が潜在的に機械的な力を変形させることから、発達中の組織を保護し、血管新生を高めるために、虚血性ドライブを延長する。3,21,22血管茎は単純に移植された場合室内の保護された空間内の正常組織ではなく、血管新生発芽は通常の創傷と同じタイムラインに沿って停止し、新しい組織が椎弓根の周りに蓄積されません。調べでは、支持的脈管構造とし、臨床的に関連する大きさの3次元機能に血管新生組織構築物を生成するために、このin vivoでの設定を使用しています。4,23さらに、その無傷の血管茎と工学血管組織構築物は、損傷部位でのその後の移植のために採取することができます。24,25より臨床的に実現可能なシナリオは、復興のための決定的なサイトでチャンバを作成することになります胸としてUCH。したがって、この新規組織工学アプローチは、再建手術のための機能的な標的組織の新たな供給源を提供するための臨床的可能性を有することができる。26-28 以下のプロトコルは、異なる動物モデルで適応および血管新生、マトリックス産生、および細胞遊走および分化の複雑な過程を調べるために使用することができるラットにおけるインビボ血管新生組織工学室を構築する一般的なガイドを提供します。

<table><tbody><tr><td>1 15 Blade Scalpel</td><td>Braun</td><td>BB515</td><td></td></tr><tr><td>1 Toothed Adson Forceps</td><td>Braun</td><td>BD527R</td><td></td></tr><tr><td>1 Needle Holder</td><td>Braun</td><td>BM201R</td><td></td></tr><tr><td>1 Bipolar Coagulator&amp;nbsp;</td><td>Braun</td><td>US335</td><td></td></tr><tr><td>1 Micro Needle Holder B-15-8.3</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00763</td><td></td></tr><tr><td>1 Micro Dilator Forceps D-5a.2</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00125</td><td></td></tr><tr><td>1 Micro Jeweler&#039;s Forceps JF-5</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00108</td><td></td></tr><tr><td>1 Micro Scissors - Straight SAS-11</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00098</td><td></td></tr><tr><td>1 Micro Scissors - Curved SDC-11</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00090</td><td></td></tr><tr><td>2 Single Clamps B-3</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00400</td><td></td></tr><tr><td>2 10/0 nylon suture</td><td>S &amp;amp; T</td><td>03199</td><td></td></tr><tr><td>1 6/0 nylon suture</td><td>Braun</td><td>G2095469</td><td></td></tr><tr><td>2 4/0 Silk Sutures</td><td>Braun</td><td>C0760145</td><td></td></tr><tr><td>Xilocaine 1%</td><td>Dealmed</td><td>150733</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Heparin Sodium</td><td>Dealmed</td><td>272301</td><td>5,000 UI/ml</td></tr><tr><td>Ringer Lactate</td><td>Baxter</td><td>JB2323</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>1 dome-shaped tissue engineering chamber</td><td>custom made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 flow-through chamber</td><td>custom made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lectin I, Griffonia Simplicifolia&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1105</td><td>1.67 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Troponin T antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab8295</td><td>4 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Human-specific Ku80 antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab80592</td><td>0.06 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Desmin antibody</td><td>Dako</td><td>M0760</td><td>2.55 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Cell Tracker CM-DiI dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C-7000</td><td>3 mg/10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; cells</td></tr><tr><td>Lethabarb (sodium pentobarbitone)</td><td><a href="www.virbac.com.au" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Virbac Animal Health</a></td><td>LETHA450</td><td>325 mg/ml</td></tr><tr><td>Heat pad flexible</td><td><a href="http://www.redzoneheating.com.au" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Redzone Heating</a></td><td>RZ/Medium</td><td></td></tr></tbody></table>

tissue engineering by intrinsic vascularization in an in vivo tissue engineering chamber

再建手術では、複雑で自家復興の現在の方法に代わる、コスト高と貿易別のものの欠陥のための臨床的な必要性があります。組織工学は、この需要の増加に対処するための約束を保持しています。しかし、ほとんどの組織工学戦略が悪いため、血管新生の安定した機能的組織代替物を生成することができません。本論文では、灌流動脈と静脈のいずれかの動静脈ループまたはフロースルー椎弓根構成としては、保護された中空室の内部に向けられている固有の血管新生のin vivo組織工学室モデルに焦点を当てています。この室ベースのシステムでは、血管新生発芽は、動静脈の血管から発生し、このシステムは徐々に線維血管組織でチャンバ空間を埋め駆動虚血性および炎症性の内因性の細胞遊走を魅了しています。外因性の細胞/チャンバーの構築時に行列注入は、セルシュールを強化しますvivalと開発工学組織の特異性を決定します。我々の研究は、この室モデルがうまくそのような脂肪、心筋、肝臓などのような様々な組織を生成することができることを示しています。しかしながら、修正及び改良は、標的組織の形成を一貫して再現可能であることを確認する必要があります。この記事では、生体内で二つの異なる血管組織工学室モデルの製造のための標準化されたプロトコルについて説明します。

上記のプロトコールに記載されるように、組織工学室の顕微作成を行いました。チャンバ内部で発生組織3.種々の組織タイプの正常インビボ血管新生室（ 図2）を使用して操作されたプロトコルのステップで説明するように組織学的に調べることができます。これらは、新生児ラット心筋細胞（ 図2A）、脂肪組織の細胞外マトリックス（ 図2C）に由来ハイドロゲルラット骨格筋芽細胞（ 図2B）、および脂肪組織と筋肉組織との心臓組織が ​​含まれます。 組織の形態学的評価は、ステレオ治験システムまたはImageJソフトウェアのいずれかで行うことができる。3,4,8,17,22,29様々な組織成分の定性的評価に加えて、立体学システムは、公平な定量化を可能にします特定の組織体積のfication。例えば、レクチン（齧歯類内皮細胞のマーカー）は、横断面（ 図3）は、立体学システムとビデオ顕微鏡を用いて採取した組織構築物の血管の容積を推定するために使用され得る染色しました。同様の定量方法は、他の組織型の量を評価するために適用することができます。 組織工学チャンバはまた、 インビボ移植に以下の細胞の運命を追跡するために使用することができます。細胞は、移植前に、このようなDiIを、PKH26又は量子ドットのような蛍光色素で予め標識することができます。例えば、のDiIで予め標識した新生仔ラット心筋細胞は、3日後に注入（ 図4A）で回収した組織構築物中で検出することができます。我々はまた、成功し、移植後4週間までのDiIで予め標識された移植細胞を追跡してきました。あるいは、種特異的抗体は、iを使用することができます異種移植研究に移植された細胞をdentify。例えば、免疫無防備状態ラットにおける組織工学チャンバ内部移植したヒト人工多能性幹細胞は、ヒト特異的Ku80を抗体（ 図4B）で免疫染色することにより採取した組織構築物において同定され得ます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54099/54099fig1.jpg" /> 図 1：in vivoでの 血管新生したチャンバ と心臓組織工学動静脈ループ室モデルとフロースルー椎弓根室モデルと組み込み血管新生アプローチ。チャンバは、ポリカーボネート又はアクリルのいずれかから作られた、これらの材料は、 インビボで非炎症性かつ非毒性であることが試験されました。スケールバー= 5ミリメートル。 30からの許可を得て再印刷。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54099/54099fig1large.jpg" target="_blank">嘆願</a><html> seがこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54099/54099fig2.jpg" /> 図2：新生児ラット心筋細胞を用いたin vivo 血管新生化室 から操作された組織 （A）心臓組織。心筋細胞は、心筋トロポニンT抗体（茶色）で免疫染色しました。 （B）ラット骨格筋芽細胞と筋肉組織。筋細胞は、デスミン抗体（茶色）で免疫染色しました。 （C）脂肪組織の細胞外マトリックス由来ヒドロゲルと脂肪組織。31ヘマトキシリンおよびエオシン染色。スケールバー=50μmである。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54099/54099fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> /files/ftp_upload/54099/54099fig3.jpg &quot;/&gt; 図3：移植後4週目に採取した組織構築物の血管分布レクチン染色切片の代表的な画像。。大腿動脈（*）から出芽血管のレクチン（褐色）で標識しました。スケールバー= 200（左）ミクロンと100ミクロン（右）。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54099/54099fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54099/54099fig4.jpg" /> 図4：組織構築物における移植細胞の同定 （A）のDiI-ラベル新生児ラット心筋細胞（赤と白矢印）、移植後3日目に採取したラットの組織構築物中。 （B）ラットTISSUから採取した組織構築物の代表的なヒト特異的Ku80を染色し、組織学の画像28日後、移植のヒト人工多能性幹細胞を移植した電子工学室。人間の核を免疫標識茶色及び免疫無防備状態ラットは、ヒト細胞の拒絶を予防するために使用しました。スケールバー=50μmである。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54099/54099fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

中に組み込み血管新生による組織工学<em&gt;インビボ</em&gt;ティッシュ・エンジニアリング商工会議所

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

8.8K ビュー.  St Vincent's Institute of Medical Research. This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling. 

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Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

拍動バイオリアクターを用いた工学生物学ベースの人工血管

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

生物工学

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, and observation and quantification are very challenging. However, conventional in vitro microvessel assays have limitations when representing in vivo microvessels with respect to three-dimensional (3D) geometry and providing continuous fluid flow. Using a combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics, we have developed a multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip, which mimics the 3D geometry of in vivo microvessels and runs under controlled continuous perfusion flow. A positive reflowable photoresist was used to fabricate a master mold with a semicircular cross-sectional microchannel network. By the alignment and bonding of the two polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated from the master mold, a cylindrical microchannel network was created. The diameters of the microchannels can be well controlled. In addition, primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) seeded inside the chip showed that the cells lined the inner surface of the microchannels under controlled perfusion lasting for a time period between 4 days to 2 weeks.

A microchannels-on-a-chip platform was developed by the combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics. The endothelialized microchannels platform mimics the three-dimensional (3D) geometry of in vivo microvessels, runs under controlled continuous perfusion flow, allows for high-quality and real-time imaging&#160;and can be applied for microvascular research.

マルチ深円形の断面内皮マイクロチャンネル·オン·ア·チップの開発のための手順

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

生体材料の血管新生を評価するために、完全な皮膚欠損モデル<em&gt;インビボ</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent endothelial progenitors (EPs), which can differentiate into the cell types necessary to assemble mature, functional vasculature, have been derived from both embryonic and induced pluripotent stem cells. However, these cells have not been rigorously evaluated in three-dimensional environments, and a quantitative measure of their vasculogenic potential remains elusive. Here, the generation and isolation of iPSC-EPs via fluorescent-activated cell sorting are first outlined, followed by a description of the encapsulation and culture of iPSC-EPs in collagen hydrogels. This extracellular matrix (ECM)-mimicking microenvironment encourages a robust vasculogenic response; vascular networks form after a week of culture. The creation of a computational pipeline that utilizes open-source software to quantify this vasculogenic response is delineated. This pipeline is specifically designed to preserve the 3D architecture of the capillary plexus to robustly identify the number of branches, branching points, and the total network length with minimal user input.

Endothelial progenitors derived from induced pluripotent stem cells (iPSC-EPs) have the potential to revolutionize cardiovascular disease treatments and to enable the creation of more faithful cardiovascular disease models. Herein, the encapsulation of iPSC-EPs in three-dimensional (3D) collagen microenvironments and a quantitative analysis of these cells&#8217; vasculogenic potential are described.

iPSC由来内皮前駆体の血管学的電位を定量化するインビトロ3Dモデルと計算パイプライン

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

発生生物学

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

微細と3D微小血管の組立

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

マイクロ流体工学に基づく血管新生ヒト微小腫瘍モデルの準備

Establishing a Physiologic Human Vascularized Micro-Tumor Model for Cancer Research

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical cancer research and therapeutic development.&#160;To overcome this problem, we have developed the vascularized microtumor (VMT), or tumor chip, a microphysiological system that realistically models the complex human tumor microenvironment. The VMT forms de novo within a microfluidic platform by co-culture of multiple human cell types under dynamic, physiological flow conditions. This tissue-engineered micro-tumor construct incorporates a living perfused vascular network that supports the growing tumor mass just as newly formed vessels do in vivo. Importantly, drugs and immune cells must cross the endothelial layer to reach the tumor, modeling in vivo physiological barriers to therapeutic delivery and efficacy. Since the VMT platform is optically transparent, high-resolution imaging of dynamic processes such as immune cell extravasation and metastasis can be achieved with direct visualization of fluorescently labeled cells within the tissue. Further, the VMT retains in vivo tumor heterogeneity, gene expression signatures, and drug responses. Virtually any tumor type can be adapted to the platform, and primary cells from fresh surgical tissues grow and respond to drug treatment in the VMT, paving the way toward truly personalized medicine. Here, the methods for establishing the VMT and utilizing it for oncology research are outlined. This innovative approach opens new possibilities for studying tumors and drug responses, providing researchers with a powerful tool to advance cancer research.

著者スポットライト:トランスレーショナルがん研究のモデルとしてのヒト血管新生微小腫瘍の作成 

This protocol presents a physiologically relevant tumor-on-a-chip model to perform high-throughput basic and translational human cancer research, advancing drug screening, disease modeling, and personalized medicine approaches with a description of loading, maintenance, and evaluation procedures.

がん研究のための生理学的ヒト血管新生微小腫瘍モデルの確立

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical ...

がん研究

The Arteriovenous (AV) Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in pathological situations such as cancer, vascularization plays a leading role in disease progression. Consequently, there is a strong need for a standardized and well-characterized in vivo model in order to elucidate the mechanisms of neovascularization and develop different vascularization approaches for tissue engineering and regenerative medicine.
We describe a microsurgical approach for a small animal model for induction of a vascular axis consisting of a vein and artery that are anastomosed to an arteriovenous (AV) loop. The AV loop is transferred to an enclosed implantation chamber to create an isolated microenvironment in vivo, which is connected to the living organism only by means of the vascular axis. Using 3D imaging (MRI, micro-CT) and immunohistology, the growing vasculature can be visualized over time. By implanting different cells, growth factors and matrices, their function in blood vessel network formation can be analyzed without any disturbing influences from the surroundings in a well controllable environment. 
In addition to angiogenesis and antiangiogenesis studies, the AV loop model is also perfectly suited for engineering vascularized tissues. After a certain prevascularization time, the generated tissues can be transplanted into the defect site and microsurgically connected to the local vessels, thereby ensuring immediate blood supply and integration of the engineered tissue. By varying the matrices, cells, growth factors and chamber architecture, it is possible to generate various tissues, which can then be tailored to the individual patient's needs.

The Arteriovenous AV Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

We describe a microsurgical approach for the generation of an arteriovenous (AV) loop as a model for analyzing vascularization in vivo in an isolated and well-characterized environment. This model is not only useful for the investigation of angiogenesis, but is also optimally suited for engineering axially vascularized and transplantable tissues.

血管新生および血管組織工学を研究するための小さな動物モデルにおける動静脈（AV）ループ

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

中に組み込み血管新生による組織工学

要約

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拍動バイオリアクターを用いた工学生物学ベースの人工血管

マルチ深円形の断面内皮マイクロチャンネル·オン·ア·チップの開発のための手順

生体材料の血管新生を評価するために、完全な皮膚欠損モデル

iPSC由来内皮前駆体の血管学的電位を定量化するインビトロ3Dモデルと計算パイプライン

微細と3D微小血管の組立

がん研究のための生理学的ヒト血管新生微小腫瘍モデルの確立

がん研究のための生理学的ヒト血管新生微小腫瘍モデルの確立

がん研究のための生理学的ヒト血管新生微小腫瘍モデルの確立

血管新生および血管組織工学を研究するための小さな動物モデルにおける動静脈（AV）ループ

マイクロ流体デバイスにおける組織モデルと perfusable の血管ネットワーク