著者らは、幹細胞および再生医学だけでなく、ワシントン大学のワシントンナノファブリケーション施設のための研究所のリンとマイク・ガーベイイメージング研究所を承認したいと思います。彼らはまた、国立衛生研究所の財政支援は、（YZへ）DP2DK102258を付与し、訓練助成金（SSKとMARへ）T32EB001650とT32HL007312（MAR）は認めます。

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著者らは、開示することは何もありません。

操作された微小血管は、管腔の幾何学、流体力学的な力、および多細胞相互作用などの生理的特徴が存在して調整可能でin vitroモデルです。プラットフォームのこのタイプは、それがモデル化し、in vitroでの培養条件は、問題の微小環境のそれに一致させることができる様々な状況下で内皮挙動を研究する能力を提供することで強力です。例えば、このような血管新生などの内皮のプロセスを、駆動機構は、異なる器官で、そのような健康と病気44など、さまざまな病理学的状態、で異なって発生することが知られています。このため、平面内皮細胞培養物は、一貫して6不十分であり、そのようなフィールドは、コストと時間がかかる動物モデルに大きく依存しているように。 動物モデルは、生物学的研究の進展のために有益で不可欠ながら、常に診療所にうまく変換されません。これは主に、特に9,45を刺激するそれらの応答について、マウスおよびヒトの生物学との間の差に起因しています。動物モデルから収集された情報を補完する追加のヒト特異的データを提供することができるインビトロモデルで構築することができることが不可欠である。 インビトロプラットフォームを調整する追加容量その環境に関心の微小環境を模倣する可能性があります。このようなシステムの主な特徴は、3次元構造と幾何学、細胞外マトリックス組成物（ECM）、実質細胞の近接性との相互作用、血流、および生化学的刺激を含める必要があります。操作された微小血管は、これらすべてのパラメータを組み込む能力を持っています。これは、すべての包括的なモデルを作成するために同時に行われ、または個々の応答との相互作用を分離するために段階的様式で添加することができます。 操作された微小血管の強力な側面はする能力であります制御フローと操作する流体力は、内皮細胞に作用します。一例として、デバイスは、重力駆動流条件下または連続灌流（ 図2）を用いて培養することができます。血管壁のせん断応力の大きさは、流速および容器の幾何学的形状の変化によって、両方の条件に調節することができます。二つの条件の間の主な違いは、容器内のせん断応力の時間的な分布です。重力駆動流条件では、せん断応力は経時的に一定ではありません。入口リザーバが一杯になったときの流量及び剪断応力が直ちにメディアの変更後に最高です。メディア・ドレインと、せん断応力が減少します。これは、12時間かけてせん断応力の範囲につながります。流体力学的性質（例えば、内皮細胞上のせん断応力の影響を研究するために）を正確に制御する必要が実験は、連続流培養条件を使用する必要があります。 Engineered微小血管は、比較的容易に修正を加えた質問の広い範囲に答えるように調整することができます。異なる細胞タイプは、実質および内皮の両方が、異なる器官系をモデル化するために使用することができます。内皮細胞を播種して微小血管を作製することに加えて、上皮細胞ではなく腸のライニングに関連する研究、肺胞、腎臓尿細管などのためのチャネルを裏打ちするために使用することができます。微小環境は、細胞組成物によって定義されると、装置を灌流するために使用される栄養溶液（ すなわち、培地、血液、成長因子、または他の生物学的に関連する体液）は、細胞シグナル伝達、静止、せん断応力に関する複雑な質問に答えるために変更することができます、栄養素、薬剤応答、およびより多くの。また、容器の形状は、特に剪断応力及び屈曲に内皮細胞応答を調査するために設計することができます。例えば、鄭らからの最近の刊行物として。ら内皮細胞はincreasを有することを示しました高せん断応力と流れ加速と微小血管領域におけるED VWF分泌および繊維集合体。具体的には、VWFは、典型的には、ネットワーク内のコーナーや急カーブで形成されたバンドル。ネットワークジオメトリはまた多細胞細管を製造するように設計することができます。例えば、独自の入口と出口を有する2つの平行なチャネルをそれぞれ含んでいる設計は、濃度勾配を生成するために、又は隣接する細管環境（隣接する微小血管と、例えば、リンパ管）をモデル化するために使用することができます。 （ 図1A-Cに示されている）は、現在のネットワーク設計の格子状の構造体は、製造時に計算流体モデリングのためおよび構造的完全性のために有利で ​​あるが、体内の血管構造を示すものではありません。今後の研究では、このような階層分岐や角の丸いものなど、より生理的なネットワークパターンを使用する必要があります。 この手順に記載されているすべてのステップが重要ですが、成功した操作された微小血管の製造に必要とされるいくつかの重要なステップです。コラーゲンゲルは、均質な溶液を達成するために十分に混合しなければならない、この工程の間に気泡を導入しないことが不可欠です。これは、特に、コラーゲンマトリックス中で実質細胞を含む実験用の細胞の生存率および生理学的機能に必須です。コラーゲンの均一な混合物を得ることが困難である場合、それは中性であることを確認するために溶液のpHをチェックします。問題が解決しない場合、それはコラーゲンの株式を交換する必要があります可能性があります。もう一つの重要なステップは、上部と下部のハウジング部品の集合体である - このチャネルが崩壊する原因となりますので無理な力を使用しないことが必須です。いくつかの練習ラウンドはネジを回転させながら適用するために必要な力の量の感覚を得るために必要であり得ます。チャネルの崩壊やスマッシングで​​も練習後引き続き発生する場合は、PDMSネットワークが原因でabsorptに反っになっている可能です水分のイオン。新たに作製したPDMSの型で起動すると、この問題を解決するのに役立ちます。下のデバイスで不適切にネジ穴は、チャネルの崩壊を引き起こす可能性があります。ネジは組立時に滑らかに回転することができない場合は、余分な力は、多くの場合、構造的な障害の原因となる適用されなければなりません。強調されるべきである最後の重要なステップは頻繁に送り、通常、12時間ごとの重要性です。これは、内皮細胞を維持し、乾燥からデバイスを防ぐために必須です。内皮細胞は不健康現れたり、コラーゲン壁の内皮の健康を連続流を適用するために、シリンジポンプを使用して、より頻繁に容器を供給し、またはそれを保証するために、コラーゲンゲルのpHをチェックするためにされた改善する潜在的な方法を切り離し播種した場合に生理的なレベルです。 現在、このプラットフォームは、組み立て時にチャネルの構造的完全性を維持するために適切な剛性の細胞外マトリックスと製造に限定されます。密な共同でllagen以上より6 mg / mlでは十分であるが、コラーゲン未満6 mg / mlで、そのような全体の器官から脱細胞化マトリックスのような他の行列が弱すぎます。これは、当該マトリックスとコラーゲンの混合物を使用することによって克服することができます。操作された微小血管はまた、それらのサイズスケールによって制限されています。容器は約100μmの下限に製造することができるが、実質的な修飾は、より小さなスケールを達成するために適用される必要があるであろう。操作された微小血管の三次元内腔を作成するが、ネットワーク自体が平坦です。真の三次元の血管叢を作成するために、追加の改変には、複数の操作された容器を積み重ねることによって、多層ネットワークを作成するように適用される必要があります。 この方法で提示される代表的な結果は、バリア機能、細胞間シグナル伝達（周皮細胞の動員および血管の安定化）、新脈管形成、および血栓症を評価するために使用することができる方法を操作さ微小血管を示しています。 Highliこれらの研究のghtsは、以前の刊行物31,32で、より詳細なプレゼンテーションとここに提示されています。これらの研究は、血小板が活性化内皮31に付着し、周皮細胞が操作された微小血管31の内皮を移行し、コート方法を示し、および流体せん断応力は、内皮活性化とVWF分泌およびアセンブリ32を調節します 。操作された微小血管はさらに、腎臓33又は心臓34などの血管新生組織およびモデル器官特異システムを構築するために使用することができます。せん断応力、ジオメトリ、ECM、および細胞組成に関して、これらの生理学的な血液内皮相互作用およびチューニング微小環境を複製する能力は、血管疾患の将来の研究を可能にします。

各器官における微小血管系は、組織微小環境を定義する組織の恒常性を維持し、炎症、透過性、血栓症、および線維素溶解1,2を制御するのに役立ちます。 5 -微小血管内皮細胞は、特に、従って血流と周辺組織との間の界面は、流体力及び循環サイトカインおよびホルモン3などの刺激に応答した血管および臓器機能の調節において重要な役割を果たしています。内皮、血液、および周囲の組織の微小環境との間の詳細な相互作用を理解することは、血管生物学と疾患の進行の研究のために重要です。しかし、これらの相互作用を研究の進展は、 生体内微小血管構造に再現し、6,7を機能しない試験管ツールに制限することによって妨げられてきました。その結果、フィールドと治療の進歩は、高価で、時間に大きく依存してきました10 -しばしば人間8の成功に変換することができない動物モデルを消費します。 in vivoモデルは、病気のメカニズムと血管機能の研究に貴重であるが、それらは複雑であり、多くの場合、携帯個々の生化学的、および生物物理学的手がかりの正確な制御を欠いています。 体全体の血管系は、同時に11を最適化灌流および栄養素の輸送を提供し、広大な毛細血管床と一緒に成熟した階層構造を有しています。最初は、初期の開発12,13の間に階層的に分枝状のネットワークに再編成し、プリミティブ叢などの血管系が形成されます。これらのプロセスに関与するシグナルの多くはウェル14に理解されていますが- 16を 、そのような血管のパターニングは15どのように決定されるかとらえどころのないままになります。ターンでは、組織化血管ネットワークを設計するためにインビトロでこのプロセスを反復することは蜂を持っていますnは難しい。多くの既存のin vitroでのプラットフォームは、このような2次元の内皮細胞培養物として、このような多細胞近接、3次元管腔ジオメトリ、流れ、および細胞外マトリックスのような重要な特性を欠いている、血管系をモデル化します。 3Dハイドロゲル（コラーゲンまたはフィブリン）における管形成アッセイ17から19または浸潤アッセイ20,21は、他の血管17,22または組織細胞型23と3Dとの相互作用における内皮機能を研究するために使用されてきました。しかし、これらのアッセイにおいてルーメン相互接続性、血行動態の流れ、および適切な灌流を欠いて組み立てました。さらに、これらのチューブ形成アッセイ24における血管退行の傾向を行うことができる機能的研究の程度を制限する長期培養および成熟を ​​妨げます。このように、適切にモデル化することができる微小血管ネットワーク専用のin vitroでのプラットフォームを設計する急成長が必要です特性をdothelialし、長期培養が可能です。 血管工学技術の様々な血管疾患を有する患者で交換する医療用途やバイパス影響を受けた船舶のために年間で浮上しています。ポリエチレンテレフタレート（PET）、およびポリテトラフルオロエチレン（ePTFE）などの合成材料から作製された大径の容器は、長期開存性（平均95％開通5年以上）25と、かなりの治療成功を収めています。小径合成移植片（&lt;6ミリメートル）は、典型的には、内膜過形成および血小板新生26などの合併症に直面するが- 28を 、生物学的材料で作られた組織工学小径移植片は大きな進展29,30を行っています。この種の進歩にもかかわらず、マイクロスケールに設計された血管は、チャレンジを続けています。適切微小血管系をモデル化するために、SUFで複雑なネットワークパターンを生成する必要がありますficient機械的強度が開通し、実質細胞および細胞リモデリングのための両方の栄養浸透を可能にするマトリックス組成物を維持します。 34 -このプロトコルは、調整可能かつ制御可能な微小環境31に設定し、in vivoでのネイティブを模倣小説人工灌流血管ネットワークを提供します。記載されている方法は、100ミクロンのオーダーの直径を有する操作された微小血管を生成します。操作された微小血管は、私は、ヒドロゲルコラーゲンソフトタイプ内に埋め込まれたマイクロ流体チャネルを介して内皮細胞を灌流することによって作製されます。このシステムは、開いた管腔構造のパターニングされたネットワークを生成する多細胞相互作用を複製する細胞外マトリックス組成物を調節する、および生理学的に関連する血行力学的力を適用する能力を有します。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Wafer Fabrication&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AutoGlow Plasma System</td><td>AutoGlow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Headway Spin Coater</td><td>Headway Research, Inc&amp;nbsp;</td><td>PWM32 Spin Coater&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ABM Contact Aligner</td><td>AB-M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alpha Step Profilometer</td><td>Tencor</td><td>Alpha Step 200</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Developer</td><td>Microchem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Resist</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000</td><td></td></tr><tr><td>8&quot; silicon wafer</td><td>Wafer World Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tabletop Micro Pattern Generator</td><td>Heidelberg Instruments</td><td>&amp;mu;PG 101</td><td>For generation of photomask</td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>VWR</td><td>97042-646</td><td></td></tr><tr><td>Ispropyl alcohol</td><td>Avantor Performance Materials</td><td>9088</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (120 x 120 mm, square)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z617679</td><td></td></tr><tr><td>Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MKBG3805V</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Mixed at 10:1 (w/w)</td></tr><tr><td>Vacuum desiccator</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z119024-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>VWR</td><td>9120976</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Device Fabrication and Culture&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poly(methyl methacrylate) (PMMA)</td><td>Plexiglas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corona Treater</td><td>Electro-Technic Products, Inc.</td><td>BD-20</td><td>Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds</td></tr><tr><td>Soldering Iron</td><td>Weller&amp;nbsp;</td><td>WTCPS</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw</td><td>McMaster-Carr&amp;nbsp;</td><td>91785A096</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel dowel pins</td><td>McMaster-Carr&amp;nbsp;</td><td>93600A060</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers&amp;nbsp;</td><td>Miltex</td><td>24-572</td><td>Any similar tweezers may be used</td></tr><tr><td>Spatula (Micro Spoon)</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>62410-01</td><td></td></tr><tr><td>Screw driver</td><td></td><td></td><td>Any flat head screwdriver may be used, autoclaved</td></tr><tr><td>Glass coverslips (22 x 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td>4460030966</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (150 x 25 mm)</td><td>Corning</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (100 x 20 mm)</td><td>Corning</td><td>2909</td><td></td></tr><tr><td>Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces</td><td></td><td></td><td>Autoclaved</td></tr><tr><td>Polyethyleneimine (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3143</td><td>Dilute to 1% in cell culture grade water</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td>Dilute to 0.1% in cell culture grade water</td></tr><tr><td>Sterile H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td>Autoclaved DI H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid</td><td></td><td></td><td>Isolated from rat tails as described in Rajan &lt;i&gt;et. al.&lt;/i&gt; 2006 (ref #37)</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 ml syringe</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>30 ml conical tubes</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>M199 10x Media&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>1 N NaOH (sterile)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td>Dilute to 1 N in cell culture grade water</td></tr><tr><td>HUVECs</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Endothelial growth media</td><td>Lonza</td><td>CC-3124</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Dextran from Leuconostoc spp. (70&amp;nbsp;kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific Co.</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>Gel loading tips</td><td>VWR</td><td>37001-152</td><td></td></tr><tr><td>18 G Blunt Fill Needle</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>20 G Stainless Steel Dispensing Needle</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A123</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 1/32&amp;rdquo; ID, 3/32&quot; OD Silicon Tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-95702-00</td><td></td></tr><tr><td>1/16&quot; Tube-to-tube Coupling</td><td>McMaster-Carr</td><td>5116K165</td><td></td></tr><tr><td>90&amp;deg; Elbow Connectors, Tube-to-Tube</td><td>McMaster-Carr</td><td>5121K901</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock Coupling (Female, 1/16&quot; ID)</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K211</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Forceps, with Jaw Grips</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>72971</td><td></td></tr><tr><td>Dual Syringe Pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4505</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Polystyrene Round-bottom tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-2A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Device Analysis&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806-5G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-hCD31</td><td>Abcam</td><td>ab32457</td><td>1:25 working dilution</td></tr><tr><td>FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody</td><td>Abcam</td><td>ab8822</td><td>1:100 working dilution</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit 568 secondary antibody</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>1:100 working dilution</td></tr><tr><td>Hoescht</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>H1399</td><td>Resuspended in DMSO</td></tr><tr><td>Sodium cacodylate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td>To make 0.2 M cacodylate buffer</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR International</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>40 kDa FITC-conjugated Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD40S&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Additional Culture Reagents&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleck Chem</td><td>S2924</td><td>Small molecule GSK-3 inhibitor</td></tr><tr><td>Human recombinant VEGF</td><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant bFGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-18B</td><td></td></tr></tbody></table>

micropatterning and assembly of 3d microvessels

インビトロプラットフォームでは 、内皮細胞および血管生物学の大部分は、2D内皮細胞培養物に限定されている研究するポリマー又はガラスベースの基板、及びヒドロゲルベース管形成アッセイを用いてチャンバを流れます。これらのアッセイは、有益ながら、血管機能の調節に重要な役割を果たしルーメンジオメトリ、適切な細胞外マトリックス、および多細胞近接性を、再現しません。この原稿は、100ミクロンのオーダーの直径を有する操作された血管を生成するための射出成形方法を説明します。微小血管は、私は、ヒドロゲルコラーゲンネイティブ型内に埋め込まれたマイクロ流体チャネルに内皮細胞を播種することによって作製されます。形成チャネルの前に、コラーゲンマトリックス中で実質細胞を組み込むことによって、特定の組織の微小環境をモデル化し、研究することができます。流体力学的特性および培地組成の追加の変調は、所望の微小環境内での複雑な血管機能の制御を可能にします。このプラットフォームは、血管周囲細胞動員、血液 - 内皮相互作用、フロー応答、および組織微小血管相互作用の研究を可能にします。操作された微小血管は、血管ニッチの個々の成分の影響を単離する能力を提供し、正確に健康と病気の両方に血管生物学を研究するために、その化学的、機械的、および生物学的特性を制御します。

操作された容器プラットフォームは、私はマトリックスの天然型コラーゲンの中に埋め込 ​​まれた機能的な微小血管系を作成し、in vitroで 、細胞の生物物理学的および生化学的環境の厳密な制御を可能にします。操作された微小血管を作製するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、それらが特許ルーメンとコンフルエント内皮を形成する添付コラーゲン包埋マイクロ流体ネットワークを介して灌流します。 図1A-Cに示すように、容器の幾何学的形状は、具体的には、とりわけ、流量、ねじれ、および角度を分岐、に関する質問に答えるように設計することができます。微小血管を通る流量を調節することは、内皮細胞のせん断応力応答への洞察を提供します。以前に、製造の焦点は、主に100ミクロンのサイズ範囲の血管に、しかし500ミクロンまでの微小血管されているか、ある場合には、直径が50μmだけ小さくSUCCされていますessfully製培養しました。長期開存の例としては、重力駆動流（ 図2A）と連続印加された流れ（ 図2B）で培養微小血管の生存と同様に示されています。操作された微小血管のインビボ様性質は、いくつかの方法で証明することができます。様々な内皮機能がバリア機能（ 図3A）、細胞-細胞相互作用およびシグナル伝達（ 図3B）、および血管形成のリモデリング（ 図3C）を含む、このプラットフォームを使用して測定することができます。これらの微小血管の重要な特徴は、生物学的に関連する方法で、炎症性刺激に応答する能力です。これは最高の非活性化内皮が静止である図4A-Cでの全血（ 図4B）との相互作用を通じて実証されており、活性化内皮は、血栓形成（ 図4C）を誘導します 。ジ内皮細胞を培養することによってこのプラットフォーム内起源ffering、異なる供給源からの内皮細胞間の機能的不均一性を理解することが可能である。 図5A-Cは、その培養された微小血管システムディスプレイにおける2つの異なるヒト幹細胞由来の内皮細胞タイプでこの不均一性の例を示しています大幅に異なる表現型41。流れプロファイル、細胞組成物、および培養条件を調整することにより、人工微小血管は、健康と病気の両方において内皮生物学および微小血管系を研究するためのインビトロのツールに強力なを提供します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54457/54457fig1.jpg" /> 図1のネットワークの概略設計及び血管網の幾何学的形状は、特に、異なるフローパターンを生成するように設計することができる。マイクロチャネル製造プロトコルは A.例えば 、分枝状設計がFL減少しているであろう同じ容器31。B内の内皮上の様々なせん断応力の領域では、得られた中央付近の片道料金（3×3グリッド内の8倍の減少）。高度に分岐したグリッドは、以前のデザインとしてではなく、より大きな神経叢と同じ原理に従っています。千Paの圧力降下は、ネットワーク32を横切って印加されたときに、この設計では、10〜500秒の剪断速度の低下をもたらす流量の50倍の減少の効果は、-1に観察することができる。C.より複雑な設計がそのような鋭い角32と曲がりくねったネットワークとしてしばしば病理学的文脈で42を発生する層流の中断に対する内皮応答に関する質問に答えるために使用することができます。マイクロチャネルの製造中の3つの手順がありますが150μmD. - 。これらのパターンから作られた微小血管は100の直径を持つことになります。まず、住宅用治具の上部は、PDMの上に配置されます入口と出口とが整列されるようにパターン化ネットワーク型をS。コラーゲンIは、次いで、注入ポート（黒矢印）を介して密閉空間に注入されます。典型的には、0.75％のコラーゲンIの混合物を製造するために使用されます。成功した微小血管の製造0.6％のコラーゲンと低いで達成することができるが0.6％未満では、典型的に不十分な機械的強度及びチャネルの崩壊をもたらす。コラーゲンのE. A薄層がカバースリップの上に底部片に添加し、かつ平坦化されます37℃でゲル化した後、別のPDMSピース。F.と、カビが除去され、PDMSと上部と底部ハウジング治具には、ネットワークを囲むようにネジ止めされている。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54457/54457fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54457/54457fig2.jpg" /> <strong<html>制御された流れプロファイルを用いて培養&gt;図2.微小血管。 A. HUVECを、重力駆動流の下で培養微小血管に播種し、B.は 3μL/分の速度で連続的な流れを適用しました。この効果駆動正確なメカニズムは不明であるが、適用流下培養は最高の接合形成を増強するルーメン内の物理的圧力を加えることによって、マイクロ流体コラーゲンベースの微小血管を安定化させることが示されているメディアの3.5％デキストランの添加によって達成され、39 。微小血管内皮結合タンパク質CD31または分化31（赤）のクラスタに対して染色し、フォン・ヴィレブランド因子（VWF）顆粒（緑）。A &#39;、B&#39;。両方の条件では、HUVECを細胞間結合およびVWFの内皮マーカーを発現させました顆粒。A」、Bは「。直交ビューは、特許や文化の中で6日後に丸みを帯びたルーメンを示しています。arge.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54457/54457fig3.jpg" /> 内皮機能の研究のための図3.エンジニア微小血管。内皮バリア機能は、FITC（フルオレセインイソチオシアネート）の灌流後に評価ネットワーク（上）およびバルクコラーゲン（下部）へのその拡散の後続の測定によってデキストラン抱合することができます。カスタムコードを使用して、灌流のビデオFITCデキストランの透過係数K（μM/秒）を決定するために経時的にフレーム内の関心領域上にピクセル強度をプロットするために分析することができます。ラボによる前の刊行物は、これらの操作された血管の透過性がex vivoで哺乳類の血管31,43のそれに匹敵することを明らかにした。B。 perivと内皮細胞の相互作用ascularまたは支持細胞がコラーゲンマトリックスの細胞組成を調節することによって、このプラットフォームで解析することができます。平滑筋細胞は、血管の周囲のコラーゲンの中に埋め込まれている場合、ここで、これらの細胞間相互作用の例を見ることができます。培養14日後、平滑筋細胞は、内皮と関連付ける（緑色α平滑筋アクチン（αSMA）について染色）と血管壁に沿ってプロセスを拡張して、正射影31に見られるような血管周囲細胞として作用します。パネルAおよびBに示されている画像は、以前の出版物31から複製されている。C。血管形成出芽及びリモデリングは、血管新生の刺激を含むように培地を改変することによって操作された微小血管で評価することができます。血管新生刺激がなければ、HUVECを（左）最小限の発芽を示します。血管新生刺激（1μMGSK-3の小分子阻害剤、20 ngの/ mlの血管内皮増殖因子、および20 ng / mlの塩基性線維芽細胞GROとトップダウン予測と直交ビュー（右）に見られるような要因WTH）、HUVECを容易にマトリックスに発芽します。芽の長さと数は、ImageJソフトウェア41と、容易に定量化可能である。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54457/54457fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54457/54457fig4.jpg" /> 図4.血液内皮相互作用。操作された微小血管が静止していると炎症性刺激に適切に対応。A.アン入口付近に撮影改変されていない、HUVEC培養容器は強いCD31接合部染色（赤）とラウンド、オープンルーメン。A &#39;を示している。直交内腔のビューが示されている。B.を CD41a標識血小板（緑）で全血をクエン酸すると、同様に静止容器に灌流され、最小限の広告内皮への血小板（緑）のhesionが観察されている。Cを 。メディアへのそのようなホルボール-12-ミリステート-13-アセテート（PMA、50 ngの/ mlの）などの炎症性刺激に曝露すると、チャネル内の大きな血栓の形成における全血結果の灌流（CD41a標識、緑）、血管壁31への白血球の接着（CD45 +はラベルされた、白）。ここに見られる画像は以前の出版物31から再生されている。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54457/54457fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54457/54457fig5.jpg" /> ヒト幹細胞派生のEC。その他の内皮細胞の供給源で生成され、図5微小血管は、操作微小血管を生成するために使用することができます。今年初め、Palpant ら。らは、二つの異なるサブタイプOことを実証しましたFヒト胚性幹細胞由来の内皮細胞は、分化中のwnt /βカテニンシグナル伝達を操作することによって得ることができる：式によって部分的に特徴付けられる（HAND1の発現と高い造血電位によって特徴付けられる）造血内皮細胞及び心内膜のような内皮細胞（ NFATC1とGATA4）41。Aの3D容器プラットフォームに播種し、培養は、造血のECは、いくつかの血管新生発芽を受けたとき。B.しかし 、心内膜のような電気部品は、おそらくに応じて、機能的な違いを示唆し、より多くの血管新生と回遊していますECの2つのサブタイプ間の流れ、（この作品は以前の出版物41に詳細に示されています）。両方の細胞型は、CD31接合タンパク質（赤色）およびいくつかのVWF（緑色）を発現します。両方の直交するビューは、特許管腔を示す。C.は、容器内の心内膜のようなECの走査型電子顕微鏡画像は、血管新生芽を示す見られるように腔側から。パネルAおよびBに提示される画像はPalpant らから複製されています。アル。41。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54457/54457fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

この原稿は、内皮の生理学的特性を再現微小血管を設計するための射出成形方法を提供します。マイクロ流体ベースのプロセスは、このような流れ、細胞組成、幾何学、および生化学的勾配などの調整可能な条件、との特許の3D血管ネットワークを作成します。製造プロセスと潜在的な用途の例について説明します。

微細と3D微小血管の組立

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.7K ビュー.  University of Washington. この原稿は、内皮の生理学的特性を再現微小血管を設計するための射出成形方法を提供します。マイクロ流体ベースのプロセスは、このような流れ、細胞組成、幾何学、および生化学的勾配などの調整可能な条件、との特許の3D血管ネットワークを作成します。製造プロセスと潜在的な用途の例について説明します。 

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Process of Making Three-dimensional Microstructures using Vaporization of a Sacrificial Component

Vascular structures in natural systems are able to provide high mass transport through high surface areas and optimized structure. Few synthetic material fabrication techniques are able to mimic the complexity of these structures while maintaining scalability. The Vaporization of a Sacrificial Component (VaSC) process is able to do so. This process uses sacrificial fibers as a template to form hollow, cylindrical microchannels embedded within a matrix. Tin (II) oxalate (SnOx) is embedded within poly(lactic) acid (PLA) fibers which facilitates the use of this process. The SnOx catalyzes the depolymerization of the PLA fibers at lower temperatures. The lactic acid monomers are gaseous at these temperatures and can be removed from the embedded matrix at temperatures that do not damage the matrix. Here we show a method for aligning these fibers using micromachined plates and a tensioning device to create complex patterns of three-dimensionally arrayed microchannels. The process allows the exploration of virtually any arrangement of fiber topologies and structures.

The Vaporization of a Sacrificial Component (VaSC) process is used to fabricate microvascular structures. This procedure uses sacrificial poly(lactic) acid fibers to form hollow microchannels with precise 3D geometric positioning provided by laser micromachined guide plates.

犠牲成分の蒸発を用いた三次元微細構造を作る過程

Vascular structures in natural systems are able to provide high mass transport through high surface areas and optimized structure. Few synthetic material ...

工学

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

細胞挙動を研究するための溝パターンを用いたマイクロ流体デバイス

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

生物学

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

三次元細胞培養用チップサイズの足場の微細加工

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Capillary-based Centrifugal Microfluidic Device for Size-controllable Formation of Monodisperse Microdroplets

Here, we demonstrate a simple method for the rapid production of size-controllable, monodisperse, W/O microdroplets using a capillary-based centrifugal microfluidic device. W/O microdroplets have recently been used in powerful methods that enable miniaturized chemical experiments. Therefore, developing a versatile method to yield monodisperse W/O microdroplets is needed. We have developed a method for generating monodisperse W/O microdroplets based on a capillary-based centrifugal axisymmetric co-flowing microfluidic device. We succeeded in controlling the size of microdroplets by adjusting the capillary orifice. Our method requires equipment that is easier-to-use than with other microfluidic techniques, requires only a small volume (0.1-1 &#181;l) of sample solution for encapsulation, and enables the production of hundreds of thousands number of W/O microdroplets per second. We expect this method will assist biological studies that require precious biological samples by conserving the volume of the samples for rapid quantitative analysis biochemical and biological studies.

Here, we demonstrate a simple production method for size-controllable, monodisperse, water-in-oil (W/O) microdroplets using a capillary-based centrifugal microfluidic device. This method requires only a small sample volume and enables high-yield production. We expect this method will be useful for rapid biochemical and cellular analyses.

単分散微小液滴のサイズ制御可能な形成のためのキャピラリーベースの遠心マイクロ流体デバイス

Here, we demonstrate a simple method for the rapid production of size-controllable, monodisperse, W/O microdroplets using a capillary-based centrifugal ...

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

スキージベースアセンブリ法による生体膜マイクロアレイの形成

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

生物工学

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

マイクロ流体ジェッティングを使用して、脂質二重層小胞の生成

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Patterning of Microorganisms and Microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, including studies of microbial physiology and interactions. At the simplest level, accurate spatial patterning of microorganisms would enable reliable, long-term imaging of large numbers of individual cells and transform the ability to quantitatively study distance-dependent microbe-microbe interactions. More uniquely, coupling accurate spatial patterning and full control over environmental conditions, as offered by microfluidic technology, would provide a powerful and versatile platform for single-cell studies in microbial ecology. 
This paper presents a microfluidic platform to produce versatile and user-defined patterns of microorganisms within a microfluidic channel, allowing complete optical access for long-term, high-throughput monitoring. This new microfluidic technology is based on capillarity-assisted particle assembly and exploits the capillary forces arising from the controlled motion of an evaporating suspension inside a microfluidic channel to deposit individual microsized objects in an array of traps microfabricated onto a polydimethylsiloxane (PDMS) substrate. Sequential depositions generate the desired spatial layout of single or multiple types of micro-sized objects, dictated solely by the geometry of the traps and the filling sequence. 
The platform has been calibrated using colloidal particles of different dimensions and materials: it has proven to be a powerful tool to generate diverse colloidal patterns and perform surface functionalization of trapped particles. Furthermore, the platform was tested on microbial cells, using Escherichia coli cells as a model bacterium. Thousands of individual cells were patterned on the surface, and their growth was monitored over time. In this platform, the coupling of single-cell deposition and microfluidic technology allows both geometric patterning of microorganisms and precise control of environmental conditions. It thus opens a window into the physiology of single microbes and the ecology of microbe-microbe interactions, as shown by preliminary experiments.

We present a technology that uses capillarity-assisted assembly in a microfluidic platform to pattern micro-sized objects suspended in a liquid, such as bacteria and colloids, into prescribed arrays on a polydimethylsiloxane substrate.

シーケンシャルキャピラリティーアシストアセンブリによる微生物と微粒子のパターニング

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels. Here, we describe the creation of virtual masks that allow for image-guided laser control; the photopolymerization of a micromolded PEGDA hydrogel, suitable for microfluidic network fabrication and pressure head-driven flow; the setup and use of a commercially available laser scanning confocal microscope paired with a femtosecond pulsed Ti:S laser to induce hydrogel degradation; and the imaging of fabricated microfluidic networks using fluorescent species and confocal microscopy. Much of the protocol is focused on the proper setup and implementation of the microscope software and microscope macro, as these are crucial steps in using a commercial microscope for microfluidic fabrication purposes that contain a number of intricacies. The image-guided component of this technique allows for the implementation of 3D image stacks or user-generated 3D models, thereby allowing for creative microfluidic design and for the fabrication of complex microfluidic systems of virtually any configuration. With an expected impact in tissue engineering, the methods outlined in this protocol could aid in the fabrication of advanced biomimetic microtissue constructs for organ- and human-on-a-chip devices. By mimicking the complex architecture, tortuosity, size, and density of in vivo vasculature, essential biological transport processes can be replicated in these constructs, leading to more accurate in vitro modeling of drug pharmacokinetics and disease.

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

血管由来のマイクロ流体ネットワークの画像誘導、レーザーベースの試作

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

パターニングタンパク質および細胞の多彩な方法

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular compartments while circumventing complications arising from natural cell-to-cell variations. To standardize cell shape, cells are either confined in 3D molds or controlled for adhesive geometry through adhesive islands. However, traditional micropatterning techniques based on photolithography and deep UV etching heavily depend on clean rooms or specialized equipment. Here we present an infrared laser assisted micropatterning technique (microphotopatterning) modified from Doyle et al. that can be conveniently set up with commercially available imaging systems. In this protocol, we use a Nikon A1R MP+ imaging system to generate micropatterns with micron precision through an infrared (IR) laser that ablates preset regions on poly-vinyl alcohol coated coverslips. We employ a custom script to enable automated pattern fabrication with high efficiency and accuracy in systems not equipped with a hardware autofocus. We show that this IR laser assisted micropatterning (microphotopatterning) protocol results in defined patterns to which cells attach exclusively and take on the desired shape. Furthermore, data from a large number of cells can be averaged due to the standardization of cell shape. Patterns generated with this protocol, combined with high resolution imaging and quantitative analysis, can be used for relatively high throughput screens to identify molecular players mediating the link between form and function.

The protocol presented here enables automated fabrication of micropatterns that standardizes cell shape to study cytoskeletal structures within mammalian cells. This user-friendly technique can be set up with commercially available imaging systems and does not require specialized equipment inaccessible to standard cell biology laboratories.

赤外線レーザー支援マイクロパターンによる細胞形状の制御

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...