Name: modeling myotonic dystrophy 1 in c2c12 myoblast cells
Uploaded: 2016-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells at JoVE.com

We thank Drs. Tom Cooper from the Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan from the University of Wisconsin-Madison, and Didier Trono from the University of Geneva for reagents. This work is supported by a University of Houston startup fund (YL), American Heart Association grant (YL, 11SDG5260033), and the National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).

1. C2C12細胞培養<ol><li> 20％ウシ胎児血清、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを補充した増殖培地（ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM））中で100mMのプレートでC2C12マウス筋芽細胞を維持します。 60％コンフルエント - C2C12継代細胞が約50になることを許可します。 </li><li>増殖培地を廃棄3 mLの室温のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）でC2C12細胞を洗浄します。 PBSを削除し、細胞を剥離するために、500μlの0.25％トリプシン-EDTAを追加します。 5分- 37°C、3、5％CO 2インキュベーターでプレートを置きます。 </li><li> 3mlの増殖培地を添加することによりトリプシンを中和します。細胞を懸濁するために8回 - 6ピペット。新規の100mmプレートに懸濁させ、細胞1 mlを加え、37℃、5％CO 2でインキュベートします。 </li></ol> 2. C2C12細胞トランスフェクション/形質導入および選択<ol><li> C2C12のプラスミドトランスフェクション<ol><li>トランスフェクション前、pまで24時間各トランスフェクションのための6ウェルプレートの1ウェルに遅れて7.0×10 5 C2C12細胞。 注：これは50につながる - トランスフェクションの時点で60％コンフルエンス。 </li><li>トランスフェクション試薬は使用前に室温に戻します。 </li><li>簡単に予熱した無血清培地と渦を200μlにプラスミドDNA（GFP-CUG5またはGFP-CUG200）2μgのを追加します。培地に6μlのトランスフェクション試薬を加え、ボルテックスを用いて30秒間、すぐに混ぜます。室温で30分間混合物をインキュベートします。 </li><li> 2.5ミリリットルの無血清増殖培地にC2C12細胞のメディアを変更します。インキュベーション後、細胞にトランスフェクション混合物を追加します。 5％CO 2、37℃のインキュベーターにプレートを返します。 </li><li> 4時間または一晩までのトランスフェクション混合物/無血清増殖培地中で細胞を保管してください。翌日バック増殖培地へのメディアを変更するか、または細胞傷害性は明らかであるとき。 注：細胞毒性は、CEの顕微鏡検査によって評価されますLLS。細胞の形態と細胞の剥離の変化を観察します。限り、明白な細胞毒性がないように、無血清増殖培地中で一晩インキュベートし、トランスフェクションを増強します。 </li><li> （プラスミドなしでトランスフェクト）コントロール培養物は、生細胞を持っていないまで、10日〜のために1.6mg / mlのG418 - 1.2を追加することによって、細胞をトランスフェクション後48時間を選択します。 G418を補充した成長培地で2日毎に培地を変更します。 </li><li>その後の実験のために、37℃で増殖培地および5％CO 2でG418耐性細胞を維持します。 </li></ol></li><li>レトロウイルスの調製およびC2C12レトロウイルス形質導入<ol><li> 10％ウシ胎児血清、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを含むDMEM高グルコースを補充することによりHEK 293培地を準備します。 <ol><li>約24時間のトランスフェクションの前に、100ミリメートルプレート（トランスフェクション80％コンフルエンス）に4.0×10 6エコトロピックHEK 293ベースのパッケージング細胞をプレートContaining細胞培養培地。 </li></ol></li><li>トランスフェクション試薬は使用前に室温に戻します。 </li><li> 1ミリリットルの無血清増殖培地中で15μgのプラスミドDNA（のpMSCV-PuroのかのpMSCV-Celf1Flag-プーロ）を混ぜます。簡単にボルテックス。 DNA /無血清増殖培地チューブにステップ2.2.2から30μlのトランスフェクション試薬を追加し、ボルテックスを用いてよく混ぜます。室温で30分間混合物をインキュベートします。 </li><li>エコトロピックHEK 293ベースのパッケージング細胞にトランスフェクション混合物の滴下を追加します。静かにプレートを旋回し、5％CO 2、37℃のインキュベーターに戻し、それらを返します。 24時間後、10ミリリットル予め温めた新鮮な増殖培地にメディアを変更します。 </li><li>上清（含むレトロウイルス）ピペットを用いてトランスフェクションの48時間後に収穫し、50mlの遠心チューブに上清を移します。プレートに新しい暖かいメディアの10ミリリットルを加え、インキュベーターに戻します。 4℃で上清を保管してください。 注：メディアはトンに静かに追加されます彼は井戸の側細胞単層を破壊しないように。 </li><li>トランスフェクション後の上清60時間の第二のバッチを収穫し、2.2.5からの上清と、それをプールします。細胞破片を除去するために7分間500×gで、4℃で遠心分離します。 </li><li>新しい50ミリリットルの遠心管に上清を移します。 2.2.9またはアリコートに進み、将来の使用のために-20℃で上清を保存するために進むことによって、この時点でC2C12細胞を形質導入するためにレトロウイルスを使用してください。 </li><li>凍結ストックがここで使用されている場合、室温で2.2.7からレトロウイルスを解凍します。 注：複数の凍結融解の繰り返しは避けてください。 </li><li>合流の40％ - 30を目指し伝達の同じ日にC2C12細胞をプレート。 <ol><li>増殖培地を捨て、3ミリリットルの室温PBSでC2C12細胞を洗います。 PBSを削除し、500μlの0.25％トリプシン-EDTAを追加し、37°C、3、5％CO 2インキュベーター内でプレートをインキュベートする- 5分。 </li><li> 3ミリリットルの成長MEDを追加することにより、トリプシンを中和イウム。細胞を懸濁するために8回 - 6ピペット。血球計数器を用いて細胞を数え、60ミリメートルプレートに8.0×10 5 C2C12細胞を追加します。 </li></ol></li><li> 3ミリリットル成長培地中の細胞の1 60ミリメートルプレートを感染させるために0.5ミリリットルレトロウイルスを追加します。インキュベーターにプレートを返します。 </li><li> （ - 3 / mlのピ​​ューロマイシン1）感染後48時間で3ミリリットル選択抗生物質を補った新鮮な培地と交換してください。形質導入されていないC2C12制御文化が出て死ぬまで〜5日間、毎日抗生物質を含む培地3ミリリットルを交換してください。 </li></ol></li><li>レンチウイルスの調製およびC2C12のレンチウイルス形質導入 注：バイオセーフティレベル2キャビネット内のすべてのレンチウイルス関連の手順を実行し、生物学的安全性のガイドラインに従ってください。ウイルスを含有する液体廃棄物は、廃棄前に消毒する必要があります。 <ol><li> 10％の胎児を補充したHEK 293細胞培地（DMEM高グルコース100ミリメートルプレート（〜トランスフェクションの日に80％コンフルエント）でプレート4.0×10 6個の293T細胞を、ウシ血清、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および2mM L-グルタミン）トランスフェクション前に24時間。 </li><li>室温へのトランスフェクション試薬を温めます。 8μgのレンチウイルス導入ベクターと一緒にレンチウイルスパッケージングベクター（4μgのpMD2.Gと6μgのpsPAX2）ミックス（Celf1のshRNAをまたは対照shRNAをスクランブル）1ミリリットルの無血清細胞培養培地中。簡単にボルテックス。 </li><li> DNA / DMEMチューブに36μlの予熱したトランスフェクション試薬を加え、ボルテックスでよく混ぜます。室温で30分間混合物をインキュベートします。 </li><li>インキュベーターから293T細胞を除去し、プレートにトランスフェクション混合物を追加します。静かにプレートを旋回し、戻って5％CO 2、37℃インキュベーターにそれを返します。 24時間後、10ミリリットルの新鮮な培地でトランスフェクション混合物を交換してください。 </li><li>トランスフェクション後にレンチウイルスの48時間を含む上清を収集し、50ミリリットルの遠心分離管にそれを転送します。プレートに10ミリリットル新しい暖かいメディアを追加し、それを返しますインキュベーターへ。 4℃で上清を保管してください。 </li><li>トランスフェクション後の上清60時間の第二のバッチを収集し、2.3.5からの上清とそれを組み合わせます。 7分間500×gで、4℃で遠心分離簡単。 </li><li>新しい50ml遠心管に上清を移します。新鮮なウイルスを使用している場合は、2.3.9に進みます。将来の使用のために、店舗の10ミリリットルの分注して-20℃で上清をウイルス含有。 </li><li>凍結ストックが使用される場合、使用前に室温2.3.7からウイルスを解凍。 注：複数の凍結融解の繰り返しは避けてください。 </li><li> （2.1節）で得られたプレートC2C12-CUG200細胞の形質導入の同じ日に2.2.9で説明したように。 注：30を目指して - コンフルエンスの40％。 </li><li> C2C12-CUG200の60ミリメートルプレートに感染し、インキュベーターにプレートを返すために、0.5ミリリットルのウイルスを追加します。 </li><li>形質導入後72時間 - 選択抗生物質（3 / mlのピ​​ューロマイシン1）を補った新鮮な培地と培養液を交換してください。すべての形質導入されていないC2C12-CUG200制御文化が出て死ぬまで〜5日間の選択抗生物質で培養培地を毎日更新します。 </li><li> GFP-CUG200トランスフェクションした細胞でCelf1ノックダウンを確認するために、ウエスタンブロットを使用してください。 </li></ol></li></ol> 3. C2C12細胞の分化<ol><li>プレート分化の開始前に、2.5ミリリットルの増殖培地24時間で6ウェルプレートの1ウェル中の2×10 6個の細胞。 注：完全なコンフルエンスが24時間で達成されるように、プレーティング密度を調整することができます。 <ol><li> PBSでコンフルエント細胞をリンスし、低血清分化培地2.5 mLを加え（2％ウマ血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、および1μMインスリン） 。 2日毎に培地を交換してください。 注：凍結ストックのインスリンを保持し、各培地交換時にメディアに追加します。 </li></ol></li><li> C2C12分化の間に、泉のためのサンプルを収集titative以下の時点でのRT-PCR（セクション4を参照してください）​​：Day0、1、2、4、6日目に免疫染色のための培養6.プロセス - 8（第5節参照）。 </li></ol> 4. RNAの単離および定量的RT-PCR <ol><li> RNA単離のために、製造業者のプロトコルを使用してください。単離後、30μlのRNaseフリー水でRNAペレットを再懸濁し、上下に数回をピペットと。 注：サンプルは、定量的RT-PCRに進むか、または-80℃で保存することができます。 </li><li>定量的RT-PCR 10のためのRT定量PCRキットを使用し、製造元の指示に従ってください。 表1に従って反応ミックスを調製します。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 成分 </td><td> 容量（μL） </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td> 2×反応緩衝液</td><td> 10 </td><td> 1倍</tD&gt; </tr><tr><td>フォワードプライマー</td><td> 0.5 </td><td> 200 nMの</td></tr><tr><td>リバースプライマー</td><td> 0.5 </td><td> 200 nMの</td></tr><tr><td>プローブ</td><td> 0.5 </td><td> 200 nMの</td></tr><tr><td>転写酵素＆RNアーゼ阻害剤を逆に</td><td> 0.1 </td><td> 0.25 U / mlの</td></tr><tr><td>テンプレート</td><td> 1 </td><td> 100 ngの全RNA </td></tr><tr><td> RNaseを含まない水</td><td> 7.4 </td><td> NA </td></tr><tr><td>合計ミックス</td><td> 20 </td><td></td></tr></tbody></table> 表1定量的RT-PCRマスターミックス調製 <ol start="3"><li>熱プロファイルの表2を用いて、20μlのRT-qPCRの反応を実行します。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>逆転写ステップ</td><td> 30分間、48°C </td></tr><tr><td> DNAポリマーアーゼ活性化/逆転写酵素の不活化</td><td> 10分間、95°C </td></tr><tr><td rowspan="2"> 40サイクル</td><td> 15秒、95°C </td></tr><tr><td> 1分、60°C </td></tr></tbody></table> 表2の定量的RT-PCR温度プロファイル 5.免疫染色<ol><li>たて10分間室温で4％パラホルムアルデヒド/ PBSを用意し2.5ミリリットルで単層培養を修正しました。 </li><li>室温で30分間、2.5 mlの0.1％トリトンX-100 / PBSで試料を透過。 </li><li>加湿チャンバーにサンプルを転送します。 37℃で30分間、緩衝液（0.1％の非イオン性界面活性剤/ PBS、10％正常ヤギ血清）でブロッキング2.5 ml中にサンプルを遮断します。 </li><li>ブロッキングバッファーを捨て、バッファ（1：100）をブロックで希釈したミオシン重鎖に対して800μlの一次抗体を適用します。室温で一晩加湿チャンバー内でインキュベートします。 </li><li>プレート3ティムを洗います2日目に2.5ミリリットルの洗浄緩衝液（0.1％ポリソルベート20 / PBS）とエス（各10分）。 </li><li>洗浄バッファーを削除し、800μlの二次抗体（ヤギ抗マウスIgG、1：PBSで希釈した500）を適用します。 1時間室温で加湿チャンバー内でインキュベートします。 </li><li> 2.5ミリリットル洗浄緩衝液で2回（各10分）を洗浄します。 </li><li> 5分間（1μgの/ mlの蒸留脱イオンH 2 Oで希釈）800μlのDAPIと共にインキュベートします。 </li><li> 10分間再び2.5ミリリットルの洗浄緩衝液で洗浄します。 </li><li> 2.5ミリリットルのPBSに洗浄緩衝液を変更し、イメージをキャプチャするために、蛍光顕微鏡を使用しています。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

C2C12細胞株は、筋形成11-14を研究するためのモデルとして使用されてきました。これらの細胞は、線維芽細胞様の外観を保持し、20％ウシ胎児血清を含む培地中で急速に増殖し、容易に2％ウマ血清15を含む培地中で分化します。速い増殖および分化は、筋形成細胞モデルにおいて有利な特性です。ここでは、C2C12細胞にcDNAを、3&#39;-UTR、およびshRNAをを導入するプラスミド、レトロウイルス、およびレンチウイルスベクターの使用を実証します。トランスフェクション/形質導入および分化の一貫性の維持のための重要なポイントは以下の強調表示されます。 毎日の細胞の維持における細胞密度が非常に重要です。 70％コンフルエンス - これらの細胞は、50の下で培養される必要があります。一晩放置したときにより短い集団倍加時間に、高合流（&gt; 70％）C2C12文化が自然に分化します。自然発生的に分化した細胞の割合は小さいかもしれないが、存在分化した細胞のその後の分化実験の不一致に貢献していきます。さらに、低継代数を有する新たに解凍したC2C12細胞であることが好ましいです。それらは24時間後に完全なコンフルエンスに到達するように分化するために、細胞を、予め決定された数で播種されます。インスリンは、小アリコートで凍結保存し、分化培地が変更されるたびに追加されます。これらの措置は、分化の成果を向上させます。 無血清培地は、C2C12細胞のトランスフェクションを増強します。細胞は、トランスフェクション混合物/無血清培地で一晩インキュベートすることができます。私たちの研究室では、細胞毒性のわずかな兆候を伴う20％のトランスフェクション率、最大達成します。 C2C12細胞を選択するために使用される薬剤の濃度は、ピューロマイシン1~3 / mlのより高い、1.2〜1.6 mg / mlでのG418かで、選択の持続時間が長く、ほとんどの他の細胞株よりなります。高い薬物濃度および拡張インキュベーション時間下で潜在的な毒性のために、ロット分化能の変動が生じ得ます。細胞の外観に基づいて選択方式（集中と持続時間）を調整するために、実験群と対照群を一緒に治療することが重要です。 我々は成功しDM1で3&#39;-UTR CUG展開を再現するC2C12細胞にGFP-CUG200を導入しています。 GFP-CUG200 C2C12細胞にC2C12細胞とCelf1のshRNAにCelf1を導入することは、それぞれ、DM1の筋芽細胞分化を助けるためにCelf1をターゲットのCelf1のアップレギュレーションおよび探査によってトリガー細胞および分子事象の評価を可能にしました。要約すると、ここで提示したC2C12筋芽細胞モデルは、筋緊張性ジストロフィーの調査だけでなく、一般的な筋細胞生物学および筋原性分化に利益をもたらします。このモデルの制限は、細胞株における所見は完全に生物を延長しないことです。現行モデルにおける知見は、多くの場合、動物から新鮮な筋芽細胞を単離し、それらの差異を研究に進められまする。最終的に我々は、生物における筋芽細胞の所見を実証します。 この研究のユニークな強さは、DM1におけるシーケンシャル遺伝的/病理学的事象をモデル化可能にする、C2C12筋芽細胞におけるマルチティア遺伝子操作です。 Celf1の病理学的役割を別々のマウスモデル16,17で研究しながら以前は、DMPK CUG拡張のRNA毒性効果は、筋芽細胞11-14に記載されていました。これらのシーケンシャル遺伝的/病理学的事象のモデリングは技術的に困難と時間動物モデルで実行した場合かかるものです。この研究で実証されるように、蛍光及び薬剤耐性マーカーとの併用は、筋強直性ジストロフィーにおける追加の分子事象のモデル化を可能にします。本研究で確立されたモデルは、DM1の病因における詳細なメカニズムを解剖するのに有用です。彼らはまた、DM1の病因の異なるステップを標的とする薬剤をスクリーニングするのに有益であろう。このの戦略と手続き研究では、筋芽細胞内の他の筋肉疾患モデルの確立に光を当てることがあります。

筋強直性ジストロフィー（DM）は、複数のシステム、最も特に心臓および骨格筋1に影響を与える常染色体優性疾患です。この病気、DM1とDM2の2つのサブタイプがあります。 DM1は、より一般的であり、DM2 2よりも深刻な症状を持っています。 DM1の根底にある遺伝的変異は、DMプロテインキナーゼ遺伝子（DMPK）3の3 &#39;非翻訳領域（UTR）に位置するCUGトリプレットリピートの拡大です。影響を受けていない個体でのCUG繰り返し数は対照的に、5から37まで変化し、それが50以上に、そして時にはDM1患者4で数千にまで増加します。その結果、のようなRNA結合タンパク質、マッスルのような1（MBNL1）、CUGBP、及びELAV様ファミリー1（Celf1）、誤調節されています。拡大CUGリピート上の隔離に、MBNL1は、選択的スプライシング5を調節する能力を失います。 Celf1が、一方、6,7アップレギュレートされています。 Celf1の過剰発現は、筋肉の損失に関連付けられていますMBNL1機能の喪失に起因しておらず、衰弱、。 DMPK 3&#39;-UTR CUG拡張、MBNL1の損失、およびCelf1の過剰発現を含むDM1​​関連の変化をシミュレートする動物モデルは、確立されています。しかし、筋芽細胞にDM1をモデル化することは、特にDM1に関連する細胞および分子事象を解剖するために、効率的な代替手段を提供しています。 C2C12筋芽細胞株は、最初に負傷したC3Hマウスの筋肉から単離され、広く筋原性分化8,9を研究するために使用しました。 C2C12細胞は急速にウシ胎児血清（FBS）培地を含有して増殖し、容易にFBSが枯渇したとき分化を受けます。しかし、この筋芽細胞分化モデルを使用して2つの課題を提示する：C2C12細胞は、多くの場合、遺伝子導入/形質導入、ウイルスに対して耐性です。および細胞取り扱いおよび分化手順のわずかな変動は、筋管形成の著しい変化につながることができます。 私たちの研究室では、日常的に交流としてC2C12筋芽細胞を使用していますエル・モデルと効果的C2C12細胞株10へのプラスミドのトランスフェクション、レトロウイルス形質導入、およびレンチウイルス形質導入によって遺伝子を送達プロトコルを開発しました。ビデオでは、我々は/トランスフェクトC2C12細胞に形質導入​​し、DM1の筋芽細胞モデルの確立に分化一貫性を維持するための最適化された手順を示しています。

<table><tbody><tr><td>DMEM, high glucose</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td>for culture medium</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum - Premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>for culture medium</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td>for culture medium</td></tr><tr><td>Insulin from bovine pancreas</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634-100MG</td><td>for differentiation medium</td></tr><tr><td>equine serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12150</td><td>for differentiation medium</td></tr><tr><td>FuGENE&amp;nbsp;HD Transfection Reagent</td><td>Promega</td><td>E2311&amp;nbsp;</td><td>for transfection</td></tr><tr><td>G418 sulfate&amp;nbsp;</td><td>Gold Biotechnology&amp;nbsp;</td><td>G-418-10</td><td>for drug resistant selection</td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>sc-108071</td><td>for drug resistant selection</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well</td><td>Life Technologies</td><td>NP0323BOX</td><td>for western blot</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP00061</td><td>for western blot</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0002</td><td>for western blot</td></tr><tr><td>Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300 mm x 4 m</td><td>GE healthcare life science</td><td>10600015</td><td>for western blot</td></tr><tr><td>MF 20</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>MF 20</td><td>primary Ab for immunostaining</td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T-862</td><td>secondary Ab for immunostaining</td></tr><tr><td>One step qRT-PCR MasterMix</td><td>AnaSpec</td><td>05-QPRT-032X</td><td>for qRT-PCR</td></tr><tr><td>TriPure Isolation Reagent</td><td>Roche</td><td>11667165001</td><td>for RNA isolation</td></tr><tr><td>CUG-BP1 Antibody (3B1)</td><td>santa cruz</td><td>sc-20003</td><td>primary Ab western blot</td></tr><tr><td>Actin Antibody</td><td>santa cruz</td><td>sc-1615</td><td>goat polyclonal IgG for loading control</td></tr><tr><td>293T Ecopack</td><td>Clontech</td><td>631507</td><td>cells for retrovirus preparation</td></tr><tr><td>pMSCV-puro</td><td>Clontech</td><td>634401</td><td>empty retroviral vector for retrovirus preparation</td></tr><tr><td>pMSCV-Celf1Flag-puro</td><td>house-constructed</td><td>not available</td><td>retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>gift from Didier Trono</td><td>not available</td><td>for lentivirus preparation</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>gift from Didier Trono</td><td>not available</td><td>for lentivirus preparation</td></tr><tr><td>GFP-CUG5</td><td>gift from M.S. Mahadevan</td><td>not available</td><td>details in reference 10&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>GFP- CUG200</td><td>gift from M.S. Mahadevan</td><td>not available</td><td>details in reference 10&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton&amp;nbsp;X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>TWEEN&amp;nbsp;20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>for immunostaining</td></tr></tbody></table>

modeling myotonic dystrophy 1 in c2c12 myoblast cells

筋強直性ジストロフィー1（DM1）は、筋ジストロフィーの一般的な形式です。いくつかの動物モデルは、DM1のために確立されてきたが、彼らは細胞および分子事象を研究するための効率的な細胞の代替を提供するので、筋芽細胞モデルは依然として重要です。 C2C12筋芽細胞は広く遺伝子トランスフェクション、またはウイルス形質導入に筋形成、抵抗性を研究するために使用されているが、C2C12細胞の研究を妨げています。ここでは、C2C12筋芽細胞および筋細胞分化の誘導に遺伝子を導入するために日常のメンテナンス、トランスフェクションおよび形質導入手順が含まれて最適化されたプロトコルを記述します。まとめると、これらの手順は、最高のトランスフェクション/形質導入効率を可能にするだけでなく、一貫性の分化の結果。筋緊張性ジストロフィーの研究だけでなく、他の筋肉疾患に利益をもたらすDM1筋芽細胞モデルの確立に記載されているプロトコル。

C2C12細胞を、GFP-CUG5またはGFP-CUG200でトランスフェクトしました。薬剤耐性の選択の後、安定したプールは、GFP発現（ 図1A）によって可視化することができる、確立しました。分化した筋芽細胞における筋管形成は、10（ 図1B）を免疫染色重鎖ミオシンによって検出しました。筋管形成の定量化は、融合指数は2.6±1.1％に35.4±4.1％から減少し、筋管領域は、GFP-CUG200（ 図1C）に異常CUG拡大により2.7±0.8％に35.6±2.2％から減少したことを実証しました。融合インデックス及び筋管領域が核の総数は、それぞれ、筋管で覆われた総画像面積の割合で割った筋管（≥2核）における核の総数を介してカウントしました。リアルタイムRT-PCR 10は、異なる筋肉の数の発現を分析するために行きました。MyoD、MyoG、MEF2CとCelf1含むiation関連遺伝子。 CUG5培養物と比較して、CUG200は、分化の開始時に筋芽細胞の増殖にCelf1 mRNAの発現を増加させました。以前の報告と一致、Celf1のアップレギュレーションは、筋原性ジストロフィー1（ 図1D）にCUG-拡大と関連していました。さらに、ウェスタンブロッティング10は一貫して示したCelf1タンパク質レベルは、（ 図1E）上昇、およびCUG200は、分化（ 図1D）の間のMyoD、MyoGとMEF2Cの発現を阻害しました。これらの結果は、CUG-拡大が欠陥および減損筋芽細胞分化を筋管につながることを示唆しています。 筋芽細胞分化におけるCelf1の役割を研究するために、pMSCV- Celf1Flagレトロウイルスベクターは、C2C12細胞を形質導入するために構築した。10ピューロマイシン耐性クローンが分化の研究のためにプールしました。ウエスタンブロット結果は、旗-TAgged Celf1はのpMSCV-Celf1Flag形質導入された培養物中にのみ存在し、Celf1タンパク質の発現は、（ 図2A）をアップレギュレートされました。 Celf1の過剰発現は厳しく筋芽細胞分化を阻害することを示唆している対照培養（ 図2B）と比較した場合Celf1過剰発現細胞における筋管の形成は稀です。 Celf1ノックダウンは、CUG-拡張細胞に分化欠乏を救出するかどうかを判断するには、Celf1のshRNAは、レンチウイルスベクターによりGFP-CUG200細胞に送達しました。ダブル耐性クローン（G418およびピューロマイシン）が分化研究のために選択し、プールしました。内因性Celf1タンパク質のレベルは顕著Celf1のshRNA（ 図 3A）の存在下で還元しました。分化の6日後に、増加筋管形成にCelf1 shRNAの効果は、（ 図3B）が明らかでした。フュージョン指標と筋管は、4.6±0.8％と対照培養物（ 図3C）で5.1±1.3％に比べ、それぞれ16.1±3.0％および15.2±1.2％でした。一方、リアルタイムRT-PCRの結果は、MyoDの、MyoGとMEF2Cの発現が有意Celf1ノックダウン救出筋細胞分化の欠乏をサポートCelf1のshRNA細胞（ 図3D）に増加したことを示唆しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54078/54078fig1.jpg" /> 図1. CUG-拡張は、C2C12細胞における筋細胞の分化を抑制する。 （A）C2C12細胞を選択した後、遍在GFP-CUG5またはGFP-CUG200を表明しました。スケールバーは100μmです。この図は、私たちの前の紙10。（B）筋管から変更されているGFP-CUG200細胞に少ないGFP-CUG5細胞内に形成されたが。筋管は、重鎖（MF-20）、免疫染色をミオシンによって可視化しました。スケールバーは100μmである。（C） </strオング&gt; GFP-CUG200培養大幅に削減融合インデックスと筋管領域。エラーバーは標準偏差を表す。（D）Celf1のリアルタイムRT-PCR分析は、転写が筋芽細胞分化の間のMyoD、MyoG、およびMEF2C発現因子。 mRNAレベルは、GAPDH正規化された後にプロットしました。エラーバーは標準偏差を表します。スチューデントT検定は、対照と実験を比較しました。 nは&gt; 3、* P &lt;0.05。（E）GFP-CUG200トランスフェクションは、Celf1タンパク質の発現を増加させました。 β-アクチンをローディングコントロールとして示されている。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54078/54078fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54078/54078fig2.jpg" /> Celf1損なう筋芽細胞分化の図2.過剰発現。外因性Celf1Flagのexpreの（A）証明ウェスタンブロットによるC2C12細胞におけるssion。（B）筋管形成はCelf1Flag過剰発現C2C12筋芽細胞で損なわれました。筋管は、MF-20の免疫染色により可視化しました。スケールバーは100μmである。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54078/54078fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54078/54078fig3.jpg" /> Celf1部分的に救助CUG-拡張誘起筋芽細胞分化不全の 図3 ノックダウン。 GFP-CUG200筋芽細胞における（A）、ウェスタンブロットによりCelf1ノックダウンの証明。（B）Celf1のshRNA誘導された筋管形成。筋管は、MF-20の免疫染色により可視化しました。スケールバーは、融合指標と筋管面積を増加した100ミクロン（C）Celf1のshRNA-レスキュー細胞です。エラーバーは標準偏差を表します。（D）Celf1のリアルタイムRT-PCR分析は、転写、分化中のMyoD、MyoG、およびMEF2C発現因子。 mRNAレベルは、GAPDHのものに正規化した後にプロットしました。エラーバーは標準偏差を表します。スチューデントT検定を制御するための実験を​​比較しました。 nは&gt; 3、* P &lt;0.05。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54078/54078fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

このプロトコルでは、我々は、最適化されたC2C12細胞の維持、遺伝子トランスフェクション/形質導入、および筋細胞分化を含む、筋緊張性ジストロフィー1筋芽細胞モデルを確立する手順を提示します。

C2C12筋芽細胞における筋強直性ジストロフィー1のモデル化

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

15.2K ビュー.  University of Houston. このプロトコルでは、我々は、最適化されたC2C12細胞の維持、遺伝子トランスフェクション/形質導入、および筋細胞分化を含む、筋緊張性ジストロフィー1筋芽細胞モデルを確立する手順を提示します。 

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Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

電気刺激のマウス筋芽細胞前駆細胞およびアプリケーションからの工学骨格筋組織

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

生物工学

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily conserved structures that compose it are assembled remains under investigation. Their size and physiological features often constrain manipulation and imaging applications. The culture of immortalized cell lines is widely used, but it can only replicate the early steps of differentiation.
Here, we describe a protocol that enables easy genetic manipulation of myofibers originating from primary mouse myoblasts. After one week of differentiation, the myofibers display contractility, aligned sarcomeres and triads, as well as peripheral nuclei. The entire differentiation process can be followed by live imaging or immunofluorescence. This system combines the advantages of the existing ex vivo and in vitro protocols. The possibility of easy and efficient transfection as well as the ease of access to all differentiation stages broadens the potential applications. Myofibers can subsequently be used not only to address relevant developmental and cell biology questions, but also to reproduce muscle disease phenotypes for clinical applications.

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

ライブイメージングのための成熟した筋線維のin vitro分化に

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

発生生物学

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

培養皿内の機能モーターユニット：脊髄外植片と筋細胞の共培養

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

神経科学

Molecular Imaging to Target Transplanted Muscle Progenitor Cells

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe genetic neuromuscular disorder that affects 1 in 3,500 boys, and is characterized by progressive muscle degeneration1, 2. In patients, the ability of resident muscle satellite cells (SCs) to regenerate damaged myofibers becomes increasingly inefficient4. Therefore, transplantation of muscle progenitor cells (MPCs)/myoblasts from healthy subjects is a promising therapeutic approach to DMD. A major limitation to the use of stem cell therapy, however, is a lack of reliable imaging technologies for long-term monitoring of implanted cells, and for evaluating its effectiveness. Here, we describe a non-invasive, real-time approach to evaluate the success of myoblast transplantation. This method takes advantage of a unified fusion reporter gene composed of genes (firefly luciferase [fluc], monomeric red fluorescent protein [mrfp] and sr39 thymidine kinase [sr39tk]) whose expression can be imaged with different imaging modalities9, 10. A variety of imaging modalities, including positron emission tomography (PET), single-photon emission computed tomography (SPECT), magnetic resonance imaging (MRI), optical imaging, and high frequency 3D-ultrasound are now available, each with unique advantages and limitations11. Bioluminescence imaging (BLI) studies, for example, have the advantage of being relatively low cost and high-throughput. It is for this reason that, in this study, we make use of the firefly luciferase (fluc) reporter gene sequence contained within the fusion gene and bioluminescence imaging (BLI) for the short-term localization of viable C2C12 myoblasts following implantation into a mouse model of DMD (muscular dystrophy on the X chromosome [mdx] mouse)12-14. Importantly, BLI provides us with a means to examine the kinetics of labeled MPCs post-implantation, and will be useful to track cells repeatedly over time and following migration. Our reporter gene approach further allows us to merge multiple imaging modalities in a single living subject; given the tomographic nature, fine spatial resolution and ability to scale up to larger animals and humans10,11, PET will form the basis of future work that we suggest may facilitate rapid translation of methods developed in cells to preclinical models and to clinical applications.

A non-invasive means to evaluate the success of myoblast transplantation is described. The method takes advantage of a unified fusion reporter gene composed of genes whose expression can be imaged with different imaging modalities. Here, we make use of a fluc reporter gene sequence to target cells via bioluminescence imaging.

移植筋前駆細胞を標的とする分子イメージング

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe genetic neuromuscular disorder that affects 1 in 3,500 boys, and is characterized by progressive muscle ...

医学

Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA

Extracellular matrix (ECM) proteins are crucial for skeletal muscle development and homeostasis. The stable knockdown of genes coding for ECM proteins in C2C12 myoblasts can be applied to study the role of these proteins in skeletal muscle development. Here, we describe a protocol to deplete the ECM protein ADAMTSL2 as an example, using small-hairpin (sh) RNA in C2C12 cells. Following transfection of shRNA plasmids, stable cells were batch-selected using puromycin. We further describe the maintenance of these cell lines and the phenotypic analysis via mRNA expression, protein expression, and C2C12 differentiation. The advantages of the method are the relatively fast generation of stable C2C12 knockdown cells and the reliable differentiation of C2C12 cells into multinucleated myotubes upon depletion of serum in the cell culture medium. Differentiation of C2C12 cells can be monitored by bright field microscopy and by measuring the expression levels of canonical marker genes, such as MyoD, myogenin, or myosin heavy chain (MyHC) indicating the progression of C2C12 myoblast differentiation into myotubes. In contrast to the transient knockdown of genes with small-interfering (si) RNA, genes that are expressed later during C2C12 differentiation or during myotube maturation can be targeted more efficiently by generating C2C12 cells that stably express shRNA. Limitations of the method are a variability in the knockdown efficiencies, depending on the specific shRNA that may be overcome by using gene knockout strategies based on CRISPR/Cas9, as well as potential off-target effects of the shRNA that should be considered.

Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin shRNA

We provide a protocol to stably knock down genes encoding extracellular matrix (ECM) proteins in C2C12 myoblasts using small-hairpin (sh) RNA. Targeting ADAMTSL2 as an example, we describe the methods for the validation of the knockdown efficiency on the mRNA, protein, and cellular level during C2C12 myoblast to myotube differentiation.

小ヘアピン(sh)RNAを用いたC2C12筋芽細胞細胞株系の細胞外マトリックスタンパク質をコードする遺伝子の安定ノックダウン

Extracellular matrix (ECM) proteins are crucial for skeletal muscle development and homeostasis. The stable knockdown of genes coding for ECM proteins in ...

遺伝学

Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of human myoblasts. Several mouse models have been created but they either do not truly represent the human physiopathology of the disease or are not representative of the broad spectrum of mutations found in humans. The immortalization of human primary myoblasts is an alternative to this limitation; however, it is still dependent on muscle biopsies, which are invasive and not easily available. In contrast, skin biopsies are easier to obtain and less invasive to patients. Fibroblasts derived from skin biopsies can be immortalized and transdifferentiated into myoblasts, providing a source of cells with excellent myogenic potential. Here, we describe a fast and direct reprogramming method of fibroblast into a myogenic lineage. Fibroblasts are transduced with two lentiviruses: hTERT to immortalize the primary culture and a tet-inducible MYOD, which upon the addition of doxycycline, induces the conversion of fibroblasts into myoblasts and then mature myotubes, which express late differentiation markers. This quick transdifferentiation protocol represents a powerful tool to investigate pathological mechanisms and to investigate innovative gene-based or pharmacological biotherapies for neuromuscular disorders.

This protocol describes the conversion of skin fibroblasts into myoblasts and their differentiation into myotubes. The cell lines are derived from patients with neuromuscular disorders and can be used to investigate pathological mechanisms and to test therapeutic strategies.

神経筋障害の治療法を調査するヒト線維芽細胞の筋芽細胞への直接リプログラミング

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

マウス骨格筋移植からの原発性筋芽生の単離と分化

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

病気のモデリングのための筋生検からの患者由来の細胞株の単離と不死

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, Charcot-Marie-Tooth disease, and spinal muscular atrophy, which are all associated with muscular atrophy. Primary cultures of spinal MNs have been used widely to demonstrate the involvement of specific genes in such diseases and characterize the cellular consequences of their mutations. This protocol models a primary MN culture derived from the seminal work of Henderson and colleagues more than twenty years ago. First, we detail a method of dissecting the anterior horns of the spinal cord from a mouse embryo and isolating the MNs from neighboring cells using a density gradient. Then, we present a new way of efficiently transfecting MNs with expression plasmids using magnetofection. Finally, we illustrate how to fix and immunostain primary MNs. Using neurofilament mutations that cause Charcot-Marie-Tooth disease type 2, this protocol demonstrates a qualitative approach to expressing proteins of interest and studying their involvement in MN growth, maintenance, and survival.

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

The goal of this technique is to prepare a highly enriched culture of primary motoneurons (MNs) from murine spinal cord. To evaluate the consequences of mutations causing MN diseases, we describe here the isolation of these isolated MNs and their transfection by magnetofection.

株マウス一次運動ニューロンによるシャルコー ・ マリー ・ トゥース病の in Vitroモデル化

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

C2C12筋芽細胞における筋強直性ジストロフィー1のモデル化

要約

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電気刺激のマウス筋芽細胞前駆細胞およびアプリケーションからの工学骨格筋組織

ライブイメージングのための成熟した筋線維のin vitro分化に

培養皿内の機能モーターユニット：脊髄外植片と筋細胞の共培養

移植筋前駆細胞を標的とする分子イメージング

小ヘアピン(sh)RNAを用いたC2C12筋芽細胞細胞株系の細胞外マトリックスタンパク質をコードする遺伝子の安定ノックダウン

神経筋障害の治療法を調査するヒト線維芽細胞の筋芽細胞への直接リプログラミング

マウス骨格筋移植からの原発性筋芽生の単離と分化

病気のモデリングのための筋生検からの患者由来の細胞株の単離と不死

株マウス一次運動ニューロンによるシャルコー・マリー・トゥース病の in Vitroモデル化

出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養

C2C12筋芽細胞における筋強直性ジストロフィー1のモデル化

要約

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電気刺激のマウス筋芽細胞前駆細胞およびアプリケーションからの工学骨格筋組織

ライブイメージングのための成熟した筋線維のin vitro分化に

培養皿内の機能モーターユニット：脊髄外植片と筋細胞の共培養

移植筋前駆細胞を標的とする分子イメージング

小ヘアピン(sh)RNAを用いたC2C12筋芽細胞細胞株系の細胞外マトリックスタンパク質をコードする遺伝子の安定ノックダウン

神経筋障害の治療法を調査するヒト線維芽細胞の筋芽細胞への直接リプログラミング

マウス骨格筋移植からの原発性筋芽生の単離と分化

病気のモデリングのための筋生検からの患者由来の細胞株の単離と不死

株マウス一次運動ニューロンによるシャルコー ・ マリー ・ トゥース病の in Vitroモデル化

出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養

株マウス一次運動ニューロンによるシャルコー・マリー・トゥース病の in Vitroモデル化