Name: modeling myotonic dystrophy 1 in c2c12 myoblast cells
Uploaded: 2016-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells at JoVE.com

We thank Drs. Tom Cooper from the Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan from the University of Wisconsin-Madison, and Didier Trono from the University of Geneva for reagents. This work is supported by a University of Houston startup fund (YL), American Heart Association grant (YL, 11SDG5260033), and the National Natural Science Foundation of China (XP, 81460047).

1. C2C12 세포 배양 <ol><li> 성장 배지에서 100mm 플레이트 C2C12 마우스 근육 아세포를 유지 (둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)) 20 % 소 태아 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 2 mM의 L- 글루타민. 60 % 합류 - C2C12 계대 세포는 약 50이 될 수 있습니다. </li><li> 성장 배지를 버리고 3 ㎖을 실온 인산 완충 식염수 (PBS)로 C2C12 세포를 세척 하였다. PBS를 제거하고 세포를 분리하기 위해 500 ㎕를 0.25 % 트립신 - EDTA를 추가합니다. 5 분 - 3 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 접시를 놓습니다. </li><li> 3 ml의 성장 배지를 첨가함으로써 트립신을 중성화. 세포를 일시 중단 8 회 - 6 피펫. 새로운 100mm 판에 일시 중단 된 세포의 1 ML을 추가하고 37 ° C, 5 % CO 2 부화. </li></ol> 2. C2C12 세포 형질 / 전달 및 선택 <ol><li> C2C12 플라스미드 형질 <ol><li> 24 시간 이전에 형질 전환, 페이지에각 형질에 대한 여섯 잘 플레이트 잘 하나에 늦게 7.0 × 10 5 C2C12 세포. 참고 :이 50 리드 - 형질 전환시 60 %의 합류. </li><li> 형질 시약은 사용 전에 실온에 올 수 있습니다. </li><li> 간단히 미리 예열 무 혈청 배지와 소용돌이 200 μL에 플라스미드 DNA (GFP-CUG5 또는 GFP-CUG200)의 2 μg의 추가. 중간에 6 μl를 형질 전환 시약을 추가하고 소용돌이를 사용하여 30 초 즉시 섞는다. 실온에서 30 분 동안 혼합물을 인큐베이션. </li><li> 2.5 ml의 무 혈청 성장 미디어 C2C12 세포의 미디어를 변경합니다. 배양 한 후 세포에 형질 전환 혼합물을 추가합니다. 5 % CO 2, 37 ° C 배양기에 플레이트를 돌려줍니다. </li><li> 4 시간 또는 야간까지 형질 전환 혼합물 / 무 혈청 성장 배지에서 세포를 유지합니다. 다음 날 다시 성장 미디어 매체를 변경하거나 독성이 명백한 경우. 참고 : 세포 독성은 CE의 현미경 검사로 평가된다LLS. 세포 형태 및 세포 분리의 변화를 관찰한다. 한은 어떠한 명백한 독성이없는 한, 무 혈청 성장 배지에서 밤새 배양 한 형질을 향상시킨다. </li><li> (플라스미드없이 형질) 제어 문화가 살아있는 세포를 가지고 있지 않을 때까지 십일 ~ 1.6 ㎎ / ㎖의 G418 - 1.2을 추가하여 세포를 형질 전환 후 48 시간을 선택합니다. G418 보충 성장 미디어 매 2 일 매체를 변경합니다. </li><li> 후속 실험을 37 ℃에서 성장 배지 및 5 % CO 2에서 G418 내성 세포를 유지한다. </li></ol></li><li> 레트로 바이러스 제제와 C2C12의 레트로 바이러스 전달 <ol><li> 10 % 소 태아 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 및 2 mM L- 글루타민으로 DMEM 고 글루코스 보충하여 HEK 293 배지를 준비한다. <ol><li> 약 24 시간 형질 전환 이전에, 100 밀리미터 판 (형질에서 80 % 합류)에 4.0 × 10 6 ecotropic HEK 293 기반의 포장 세포를 플레이트 Containing 세포 배양 배지. </li></ol></li><li> 형질 시약은 사용 전에 실온에 올 수 있습니다. </li><li> 1 ml의 무 혈청 성장 배지에서 15 μg의 플라스미드 DNA (pMSCV-또는 순수하지 않아 pMSCV-Celf1Flag - 순수하지 않아)를 섞는다. 소용돌이 짧게. DNA를 / 무 혈청 성장 매체 튜브에 단계 2.2.2에서 30 ㎕를 형질 전환 시약을 추가하고 소용돌이를 사용하여 잘 섞는다. 30 분 동안 혼합물을 실온에서 인큐베이션. </li><li> ecotropic의 HEK 293 기반 패키징 세포로 형질 전환 혼합물 적가를 추가합니다. 부드럽게 플레이트 소용돌이와 5 % CO 2, 37 ° C 배양기에 다시를 반환합니다. 24 시간 후, 10 ml의 사전 예열 신선한 성장 매체에 미디어를 변경합니다. </li><li> 상층 액 (포함하는 레트로 바이러스) 피펫을 이용하여 형질 전환 후 48 시간을 수확하고 50 ML의 원심 분리기 튜브에 뜨는을 전송합니다. 판에 새로운 따뜻한 매체의 10 ML을 추가하고 인큐베이터로 돌아갑니다. 4 ° C에서 뜨는을 유지합니다. 참고 : 용지가 T로 부드럽게 추가그는 또한 측면 세포 단층을 방해하지 않도록. </li><li> 형질 전환 후 상층 액을 60 시간의 두 번째 배치를 수확 및 2.2.5에서 뜨는와 함께 수영장. 500 XG, 7 분 4 ° C에서 원심 분리기 세포 파편을 제거합니다. </li><li> 새로운 50 ML의 원심 분리기 튜브에 뜨는을 전송합니다. 2.2.9 또는 나누어지는 단계로 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 뜨는을 저장하기 위해 진행하여이 시점에서 C2C12 세포를 형질 도입하는 레트로 바이러스를 사용합니다. </li><li> 냉동 재고가 여기에 사용되는 경우, 실온에서 2.2.7에서 레트로 바이러스를 녹여. 참고 : 여러 동결 해동 사이클을 피하십시오. </li><li> 합류의 40 % - 30을 목표로 전달의 같은 날에 C2C12 세포를 플레이트. <ol><li> 성장 배지를 버리고 3ml를 실온으로 PBS C2C12 세포를 세척 하였다. 의 PBS를 제거 500 ㎕를 0.25 % 트립신 - EDTA를 추가하고, 3 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 접시를 품어 - 5 분. </li><li> 3 ㎖ 성장 의대를 추가하여 트립신을 중화IUM. 세포를 일시 중단 8 회 - 6 피펫. 혈구를 사용하여 세포를 계산하고, 60mm 판에 8.0 × 10 5 C2C12 세포를 추가합니다. </li></ol></li><li> 3 ㎖ 성장 배지에서 세포의 하나 60mm 판을 감염 0.5 ml의 레트로 바이러스를 추가합니다. 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다. </li><li> 감염 후 48 시간 - 선택 항생제 (3 μg의 / ㎖의 퓨로 마이신 1)로 보충 3 ㎖ 새로운 미디어로 교체하십시오. untransduced C2C12 제어 문화가 밖으로 죽을 때까지 5 ~ 일 동안 매일 항생제와 3 ㎖ 매체를 교체합니다. </li></ol></li><li> 렌티 바이러스 준비와 C2C12의 렌티 바이러스 전달 참고 : 바이오 안전성 레벨 2 캐비닛을 모든 렌티 바이러스 관련 절차를 수행하고 생물 안전 지침을 따르십시오. 바이러스를 포함하는 액체 폐기물은 폐기하기 전에 소독해야합니다. <ol><li> 10 %의 태아 보충 HEK 293 세포 배양 배지 (DMEM 높은 포도당과 함께 100mm 접시 (~ 형질의 날에 80 % 합류)에 판 4.0 × 10 6 293T 세포,소 혈청, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 및 2 mM L- 글루타민) 형질 감염 전 24 시간. </li><li> 실온으로 형질 감염 시약을 따뜻하게. 8 μg의의 렌티 바이러스 전송 벡터와 함께 렌티 바이러스 포장 벡터 (4 μg의 pMD2.G 6 μg의 psPAX2) 혼합 (Celf1의 shRNA 또는 제어 shRNA를 스크램블) 1 ml의 무 혈청 세포 배양 배지에서. 소용돌이 짧게. </li><li> DNA를 / DMEM 튜브에 36 μL 사전 예열 형질 전환 시약을 추가하고 소용돌이에 의해 잘 섞는다. 30 분 동안 혼합물을 실온에서 인큐베이션. </li><li> 인큐베이터에서 293T 세포를 제거하고 판에 형질 전환 혼합물을 추가합니다. 부드럽게 플레이트 소용돌이 다시 5 % CO 2, 37 ° C 배양기에 반환. 24 시간 후, 10 ml의 신선한 배양액으로 형질 전환 혼합물을 교체합니다. </li><li> 형질 전환 후 상층 액을 포함 렌티 바이러스 48 시간을 수집하고 50 ml의 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. 접시에 10 ml의 새로운 따뜻한 미디어를 추가하고 반환인큐베이터합니다. 4 ° C에서 뜨는을 저장합니다. </li><li> 형질 전환 후 상층 액을 60 시간의 두 번째 배치를 수집하고 2.3.5에서 뜨는와 결합. 500 XG, 7 분 4 ° C에서 원심 분리기 잠시. </li><li> 신선한 50 ML의 원심 분리기 튜브에 뜨는을 전송합니다. 신선한 바이러스를 사용하는 경우, 2.3.9 단계로 진행합니다. 향후 사용을 위해, 매장 10 ㎖를 분취에서 -20 ° C에서 뜨는 바이러스 함유. </li><li> 동결 스톡이 사용되는 경우, 사용하기 전에 실온에서 2.3.7에서 바이러스를 해동. 참고 : 여러 동결 해동 사이클을 피하십시오. </li><li> 전달의 같은 날 2.2.9에 기술 된 바와 같이 (2.1 절에서 얻은) 플레이트 C2C12-CUG200 세포. 참고 : 30 목표 - 합류의 40 %. </li><li> C2C12-CUG200의 60mm 판을 감염 인큐베이터에 접시를 반환하는 0.5 ml의 바이러스를 추가합니다. </li><li> 전달 후 72 시간 - 선택 항생제 (3 μg의 / ㎖의 퓨로 마이신 1)와 보충 신선한 매체와 문화 매체를 교체합니다.모든 untransduced C2C12 - CUG200 제어 문화가 밖으로 죽을 때까지 5 ~ 일 동안 선택 항생제와 문화 매체 일상을 새로 고칩니다. </li><li> GFP-CUG200 형질 세포에서 Celf1 최저를 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 사용합니다. </li></ol></li></ol> 3. C2C12 세포 분화 <ol><li> 플레이트 분화 개시 전에 2.5 ml의 성장 매체 24 시간에서 6 웰 플레이트 잘 하나에 2 × 10 6 세포. 주 : 전체 합류 24 시간에 도달되도록 도금 밀도를 조정할 수있다. <ol><li> PBS로 융합 세포를 씻어 낮은 혈청 분화 배지 2.5 ㎖ (둘 베코 이글 배지는 2 % 말 혈청 개질 100 U가 / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 2 mM L- 글루타민, 1 μM의 인슐린)을 추가 . 매 2 일 매체를 교체합니다. 참고 : 냉동 재고 인슐린을 유지하고 각각의 매체 변화에 미디어에 추가합니다. </li></ol></li><li> C2C12 차별화하는 동안, 콴에 대한 샘플을 수집titative 다음 시점에서 RT-PCR (섹션 4 참조) Day0, 1, 2, 4, 6 일째에 대한 면역 염색 배양 공정 6 - 8 (섹션 5 참조). </li></ol> 4. RNA의 분리 및 정량 RT-PCR <ol><li> RNA 분리에 대한 제조 업체의 프로토콜을 사용합니다. 분리 후, 30 μL의 RNase가없는 물에 RNA 펠렛을 재현 탁하고 다운 수회 피펫을하고. 주의 : 샘플을 정량적 RT-PCR을 진행 또는 -80 ° C에서 저장 될 수있다. </li><li> 정량적 RT-PCR (10)에 대한 RT qPCR에 키트를 사용하여 제조업체의 지시 사항을 따르십시오. 표 1에 따른 반응 혼합물을 준비한다. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 볼륨 (μL) </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> 2 × 반응 버퍼 </td><td> (10) </td><td> 1 배 </tD&gt; </tr><tr><td> 앞으로 프라이머 </td><td> 0.5 </td><td> 200 nm의 </td></tr><tr><td> 역방향 프라이머 </td><td> 0.5 </td><td> 200 nm의 </td></tr><tr><td> 조사 </td><td> 0.5 </td><td> 200 nm의 </td></tr><tr><td> 효소 및의 RNase 억제제 역 </td><td> 0.1 </td><td> 0.25 U / ㎖ </td></tr><tr><td> 주형 </td><td> 1 </td><td> 100 NG 총 RNA </td></tr><tr><td> 의 RNase없는 물 </td><td> 7.4 </td><td> NA </td></tr><tr><td> 총 믹스 </td><td> (20) </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 정량적 RT-PCR 마스터 믹스 준비 <ol start="3"><li> 열 프로파일 표 2를 사용하여 20 ㎕의 RT-qPCR에 반응을 실행합니다. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 역전사 단계 </td><td> 30 분, 48 ° C </td></tr><tr><td> DNA 폴리머ASE의 활성화 / 비활성화 역전사 </td><td> 10 분, 95 ° C </td></tr><tr><td rowspan="2"> (40) 사이클 </td><td> 15 초, 95 ° C </td></tr><tr><td> 1 분, 60 ° C </td></tr></tbody></table> 표 2. 정량적 RT-PCR 열 프로파일 5. 면역 염색 <ol><li> 2.5 단층 배양 해결 갓 실온에서 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 / PBS를 제조 ㎖로. </li><li> 실온에서 30 분 동안 2.5 ml의 0.1 % 트리톤 X-100 / PBS에서 샘플 Permeabilize 하시려면. </li><li> 가습 챔버에 샘플을 전송합니다. 37 ° C에서 30 분 동안 완충액 (0.1 % 비이 온성 계면 활성제 / PBS 10 % 정상 염소 혈청)을 차단하는 2.5 ml의 샘플을 차단. </li><li> 차단 버퍼를 취소하고 버퍼 (1 : 100)를 차단에 희석 마이 오신 무거운 사슬에 800 μL 차 항체를 적용합니다. 상온에서 습윤 챔버에서 밤새 인큐베이션. </li><li> 판 3 팀을 씻으십시오ES 2.5 ml의 세척 버퍼 2 일에 (0.1 % 폴리 소르 베이트 20 / PBS)와 (10 분마다). </li><li> 세척 완충액을 제거하고 800 ㎕의 차 항체 (염소 항 - 마우스 IgG, 1 : 500 희석 된 PBS)을 적용한다. 실온에서 1 시간 동안 습윤 챔버에서 인큐베이션. </li><li> 2.5 ml의 세척 버퍼로 2 회 (10 분마다)를 씻으십시오. </li><li> 5 분 (증류수 탈 H 2 O에 희석 1 μg의 / ㎖) 800 ㎕를의 DAPI로 품어. </li><li> 10 분 동안 다시 2.5 ml의 세척 버퍼로 씻으십시오. </li><li> 2.5 ml의 PBS로 세척 버퍼를 변경하고 이미지를 캡처하는 형광 현미경을 사용합니다. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart-specific+overexpression+of+CUGBP1+reproduces+functional+and+molecular+abnormalities+of+myotonic+dystrophy+type+1.">Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1.</a> Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

C2C12 세포주 11-14 근육 생성을 연구 모델로서 이용되어왔다. 이러한 세포는 섬유 아세포와 같은 모양을 유지, 20 % 소 태아 혈청을 함유하는 배지에서 증식 신속 용이 2 % 말 혈청 (15)를 포함하는 배지에서 분화. 빠른 성장 및 분화는 근육 생성 세포 모델에서 유리한 특성이다. 여기서는 C2C12 세포 내로 cDNA의 3&#39;-UTR, 및 shRNA를 소개하는 플라스미드, 레트로 바이러스 및 렌티 바이러스 벡터의 사용을 입증한다. 형질 전환 / 전달 및 분화의 일관성 유지를위한 중요한 포인트는 아래에 강조 표시됩니다. 매일 셀 유지 보수의 세포 밀도가 매우 중요하다. 70 % 합류 - 이들 세포는 50 이하로 배양 할 필요가있다. 밤새 떠날 때 때문에 짧은 인구 배가 시간에 높은 합류 (&gt; 70 %) C2C12 문화는 자발적으로 구별합니다. 자발적으로 분화 된 세포의 비율을 작게 할 수 있지만, 존재차별화 된 세포는 이후 분화 실험에서 일관성에 기여할 것입니다. 낮은 통로 번호를 갖고 또한 갓 해동 C2C12 세포가 바람직하다. 그들은 24 시간 후 완전 합류에 도달 할 수 있도록 차별화를 들어, 세포는 미리 정해진 번호로 도금되어있다. 인슐린은 작은 분취 량을 동결 보관하고, 분화 배지가 변경 될 때마다 추가된다. 이러한 조치는 차별화 성과를 향상시킬 수 있습니다. 무 혈청 배지는 C2C12 세포의 형질 감염을 향상시킨다. 세포를 밤새 형질 전환 혼합물 / 무 혈청 배지에서 배양 할 수있다. 연구실에서는 약간의 독성 증상을 동반 형질 감염 20 % 속도까지 달성한​​다. C2C12 세포를 선택하기 위해 사용되는 약물의 농도가 높은 1.2-1.6 ㎎ / ㎖의 G418 또는 1 내지 3 μg의 / ㎖ 푸로 마이신, 및 이상 대부분의 다른 세포주보다 선택의 지속 기간이다. 때문에 높은 약물 농도 하에서 잠재적 독성 및 연장 된 배양 기간 로트에분화 잠재력의 변화가 발생할 수 있습니다. 세포의 모양에 따라 선택 방식 (농도 및 지속 시간)을 조정하고, 함께 실험과 대조군의 치료에 매우 중요하다. 우리는 성공적으로 DM1의 3&#39;-UTR의 CUG 확장을 재현 C2C12 세포에 GFP-CUG200을 도입했습니다. GFP-CUG200 C2C12 세포로 C2C12 세포와 Celf1의 shRNA에 Celf1 소개는 Celf1의 상향 조절 및 Celf1 각각 DM1의 근육 모세포의 분화를 돕기 위해 대상의 탐사에 의해 유발 세포 및 분자 이벤트의 평가를 허용했다. 요약하면, 여기에 제시된 C2C12의 근원 세포 모델은 근긴장 성 이영양증뿐만 아니라 일반 근육 세포 생물학 및 근육 조직 분화의 조사에 도움이됩니다. 이 모델의 제한은 세포주의 연구 결과는 완전히 생물로 확장되지 않을 수있다. 현재 모델의 결과는 종종 자신의 differentia를 동물에서 신선한 근육 아세포를 분리하고 공부에 진출하는기. 궁극적으로 우리는 생물의 근원 세포 연구 결과를 입증. 이 연구의 고유 강도가 DM1의 연속 유전 적 / 병리학 이벤트를 모델링 가능 C2C12의 근육 아세포에서 다중 계층 유전자 조작이다. Celf1의 병리학 적 역할이 별도로 마우스 모델 (16, 17)에 조사하는 동안 이전 DMPK CUG 확장 RNA의 독성 효과는 근육 아세포 11-14에서 설명 하였다. 이러한 순차적 인 유전 / 병적 인 이벤트를 모델링하는 것은 기술적으로 어려운 시간 동물 모델에서 수행 한 경우이 소요됩니다. 이 연구에서 입증 된 바와 같이, 형광 및 약제 내성 마커의 조합 사용은 근긴장 성 이영양증에 추가 분자 이벤트의 모델링을 할 수 있습니다. 본 연구에서 확립 된 모델은 DM1의 발병 기전에 대한 자세한 메커니즘을 해부에 유용 할 것이다. 또한 DM1의 발병 기전의 다른 단계를 대상으로 의약품에 대한 심사에 도움이 될 것입니다. 전략이 절차연구는 근육 아세포의 다른 근육 질환 모델 구축을 밝혀 수 있습니다.

근긴장 이상증 (DM)는 여러 시스템, 특히 심장과 골격 근육 (1)에 영향을 미치는 염색체 우성 질환이다. 이 질병, DM1과 DM2의 두 하위 유형이 있습니다. DM1 더 일반적이며 DM2 2보다 더 심한 표현이 있습니다. DM1 근본적인 유전 적 변이는 3 &#39;비 번역 영역 DM 단백질 키나제 유전자 (DMPK) 3 (UTR)에있는 CUG 삼중 반복의 확장이다. 영향을받지 않는 개인의 CUG 반복 수는 대조적으로 (37)에 5,은 50 개 이상으로 증가하고, 때로는 최대 DM1 환자 4 천에 달라집니다. 그 결과, 같은 RNA 결합 단백질, muscleblind 형 1 (MBNL1) CUGBP 및 Elav 같은 가정 한 (Celf1) misregulated이다. 때문에 확장 된 CUG 반복에 격리에 MBNL1 대체 스 플라이 싱 (5)을 조절하는 능력을 잃게된다. Celf1 반면에, 6,7-을 조절한다. Celf1 과발현 근육 손실과 연관된MBNL1 기능의 손실에 기인되지 않고 약점. DMPK 3&#39;-UTR CUG 확장, MBNL1 상실 및 과발현 Celf1 포함 DM1 관련 변화를 시뮬레이션 동물 모델이 수립되었다. 그러나, 근육 아세포에서 DM1을 모델링 특히 DM1 관련 세포 및 분자 이벤트를 해부에 대한 효율적인 대안을 제공합니다. C2C12 근육 모세포 세포주 제 부상 C3H 마우스 근육 분리 널리 근육 조직 분화 8,9을 연구하기 위해 사용되었다. C2C12 세포는 급속 소 태아 혈청 (FBS)을 함유 미디어 증식 용이 FBS가 소모 될 때 분화를 겪는다. 그러나,이 근육 모세포 분화 모델을 사용하여 두 가지 과제를 제시한다 : C2C12 세포는 종종 유전자 형질 전환 / 바이러스 형질 도입에 대해 내성이고; 세포 처리 및 분화 과정에 약간의 차이는 myotube 형성에 표시된 변경 될 수 있습니다. 우리 연구실은 정기적으로 교류 등 C2C12의 근육 아세포를 사용엘 모델과 효과적으로 C2C12 세포주 (10)에 플라스미드 형질 전환, 레트로 바이러스 전달 및 렌티 바이러스 전달에 의해 유전자를 제공하는 프로토콜을 개발했다. 비디오에서 우리는 / 형질 C2C12 세포를 형질 도입 및 DM1의 근원 세포 모델을 확립 차별화 일관성을 유지하기위한 최적화 과정을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM, high glucose</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td>for culture medium</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum - Premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>for culture medium</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td>for culture medium</td></tr><tr><td>Insulin from bovine pancreas</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634-100MG</td><td>for differentiation medium</td></tr><tr><td>equine serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12150</td><td>for differentiation medium</td></tr><tr><td>FuGENE&amp;nbsp;HD Transfection Reagent</td><td>Promega</td><td>E2311&amp;nbsp;</td><td>for transfection</td></tr><tr><td>G418 sulfate&amp;nbsp;</td><td>Gold Biotechnology&amp;nbsp;</td><td>G-418-10</td><td>for drug resistant selection</td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>sc-108071</td><td>for drug resistant selection</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well</td><td>Life Technologies</td><td>NP0323BOX</td><td>for western blot</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP00061</td><td>for western blot</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0002</td><td>for western blot</td></tr><tr><td>Amersham Protran Supported 0.2 NC, 300 mm x 4 m</td><td>GE healthcare life science</td><td>10600015</td><td>for western blot</td></tr><tr><td>MF 20</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>MF 20</td><td>primary Ab for immunostaining</td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Texas Red-X conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T-862</td><td>secondary Ab for immunostaining</td></tr><tr><td>One step qRT-PCR MasterMix</td><td>AnaSpec</td><td>05-QPRT-032X</td><td>for qRT-PCR</td></tr><tr><td>TriPure Isolation Reagent</td><td>Roche</td><td>11667165001</td><td>for RNA isolation</td></tr><tr><td>CUG-BP1 Antibody (3B1)</td><td>santa cruz</td><td>sc-20003</td><td>primary Ab western blot</td></tr><tr><td>Actin Antibody</td><td>santa cruz</td><td>sc-1615</td><td>goat polyclonal IgG for loading control</td></tr><tr><td>293T Ecopack</td><td>Clontech</td><td>631507</td><td>cells for retrovirus preparation</td></tr><tr><td>pMSCV-puro</td><td>Clontech</td><td>634401</td><td>empty retroviral vector for retrovirus preparation</td></tr><tr><td>pMSCV-Celf1Flag-puro</td><td>house-constructed</td><td>not available</td><td>retroviral vector encoding Celf1Flag, used in retrovirus preparation</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>gift from Didier Trono</td><td>not available</td><td>for lentivirus preparation</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>gift from Didier Trono</td><td>not available</td><td>for lentivirus preparation</td></tr><tr><td>GFP-CUG5</td><td>gift from M.S. Mahadevan</td><td>not available</td><td>details in reference 10&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>GFP- CUG200</td><td>gift from M.S. Mahadevan</td><td>not available</td><td>details in reference 10&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton&amp;nbsp;X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>TWEEN&amp;nbsp;20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>for immunostaining</td></tr></tbody></table>

modeling myotonic dystrophy 1 in c2c12 myoblast cells

근긴장 이상증 1 (DM1)는 근육 영양 장애의 일반적인 형태입니다. 여러 동물 모델이 DM1 설립되었지만 그들은 세포 및 분자 이벤트를 공부하기위한 효율적인 세포의 대안을 제공하기 때문에, 근원 세포 세포 모델은 여전히​​ 중요하다. C2C12 근육 모세포의 세포가 광범위하게 유전자 형질 전환, 형질 도입 또는 바이러스에 근육 생성, 저항을 연구하는 데 사용되었다하더라도, C2C12 세포의 연구를 방해한다. 여기, 우리는 C2C12의 근육 아세포 및 심근 분화의 유도에 유전자를 도입하는 일상적인 유지 보수, 형질 전환 및 전달 절차를 포함하는 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 종합적으로, 이러한 절차는 최선의 형질 전환 / 전달 효율뿐만 아니라 일관성있는 차별화 된 성과를 가능하게한다. 근긴장 성 이영양증의 연구뿐만 아니라 다른 근육 질환에 유익 할 DM1 근육 모세포 셀 모델 확립에 기재된 프로토콜.

C2C12 세포는 GFP-CUG5 또는 GFP-CUG200로 형질했다. 약제 내성의 선택 후, 안정한 풀을 GFP 발현 (도 1a)에 의해 시각화 될 수있는 확립 하였다. 차별화 된 근육 아세포에서 Myotube 형성은 10 (그림 1B)를 면역 염색 중쇄를 미오신에 의해 검출되었다. myotube 형성의 정량은 융합 지수는 2.6 ± 1.1 %로 35.4 ± 4.1 %로 감소하고, myotube 영역이 GFP-CUG200 (그림 1C)에 이상 CUG 확장에 의해 2.7 ± 0.8 %로 35.6 ± 2.2 %로 감소되었음을 보여 주었다. 융합 인덱스 및 myotube 영역 핵의 총수 및 각각 myotubes 의해 덮여 전체 화상 영역의 비율로 나눈 myotubes (≥ 2 핵)의 핵의 총 개수로 계산 하였다. 실시간 RT-PCR (10)는 다른 근육의 숫자에 대한 표현을 분석 하였다MyoD, MyoG, Mef2c 및 Celf1 포함 iation 관련 유전자. CUG5 배양에 비해 CUG200 분화의 시작 아세포 증식에​​ Celf1의 mRNA의 발현이 증가 하였다. 이전 보고서와 일치하는, Celf1의 상향 조절은 근육 조직의 영양 장애 1 (그림 1D)에 CUG 팽창과 연관이 있었다. 또한, 웨스턴 블로 팅 (10)는 지속적으로 보여 Celf1 단백질 수준 (그림 1E) 상승 및 CUG200는 분화 (그림 1D) 동안 MyoD, MyoG 및 Mef2c의 발현을 억제되었다. 이러한 결과는 CUG-확장 결함과 장애 근원 세포의 분화를 myotube에 이르게하는 것이 좋습니다. 근원 세포의 분화에 Celf1의 역할을 연구하기 위해, pMSCV- Celf1Flag의 레트로 바이러스 벡터는 C2C12 세포를 형질 도입하도록 구성되었다. 10 퓨로 마이신 내성 클론 분화 연구에 풀링 하였다. 웨스턴 블롯 결과를 보여 주었다 플래그 - 타gged Celf1는 pMSCV-Celf1Flag 형질 문화 만 존재하고 Celf1 단백질의 발현은 (그림 2A)를 상향 조절했다. Celf1의 과발현 심각한 근육 모세포 분화 저해 제안 제어 배양 (도 2B)에 비해 세포 Celf1가 과발현에 myotubes의 형성은 드물다. Celf1의 최저은 CUG 팽창 세포에서 분화 결핍을 구출 있는지 확인하려면 Celf1의 shRNA는 렌티 바이러스 벡터에 의해 GFP-CUG200 세포에 전달했다. 더블 내성 클론 (G418 및 퓨로 마이신)를 선택 분화 연구에 풀링 하였다. Celf1 내인성 단백질의 수준이 현저 Celf1의 shRNA (도 3A)의 존재 하에서 감소 하였다. 분화 6 일 후, myotube 형성을 증가에 Celf1의 shRNA의 효과 (그림 3B) 분명했다. 퓨전 지수와 myotube은로 4.6 ± 0.8 % 및 제어 배양 (도 3c)에서 5.1 ± 1.3 %과 비교하여 각각 16.1 ± 3.0 % 15.2 ± 1.2 %였다. 한편, 실시간 RT-PCR 결과 MyoD, 및 MyoG Mef2c의 발현이 현저히 Celf1 최저 구출 근세포 분화 결핍지지 Celf1 shRNA를 셀 (도 3D)이 증가되었음을 시사한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54078/54078fig1.jpg" /> 그림 1. CUG-확장 C2C12 세포에서 심근 세포의 분화를 억제한다. (A) C2C12 세포는 선택 후 재하 GFP-CUG5 또는 GFP-CUG200를 표명했다. 스케일 바는 100 μm의 수 있습니다. 이 수치는 이전 용지 (10)에서 수정되었습니다. (B)는 Myotubes는 GFP-CUG5 세포에서 형성하지만 GFP-CUG200 세포에서 덜했다. Myotubes는 중쇄 (MF-20) 면역 염색을 미오신에 의해 가시화되었다. 스케일 바는 100 μm의입니다. (C) </str옹&gt; GFP-CUG200 문화는 상당히 융합 지수와 myotube 영역을 감소시켰다. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. (D) Celf1의 실시간 RT-PCR 분석, 전사는 근육 모세포의 분화 동안 MyoD, MyoG 및 Mef2c 발현 요인. mRNA 수준은 GAPDH 정규화 후의 플롯 하였다. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 스튜던트 T 테스트 컨트롤 시험을 비교 하​​였다. N&gt; 3 * P &lt;0.05. (E) GFP-CUG200 형질 증가 Celf1 단백질 발현. ß-굴지는로드 컨트롤로 표시됩니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54078/54078fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54078/54078fig2.jpg" /> Celf1 손상 근육 모세포의 분화 그림 2. 과발현. 외인성 Celf1Flag의 expre의 (A) 증명웨스턴 블롯에 의해 C2C12 세포에서 ssion는. (B) Myotube 형성은 Celf1Flag 과발현 C2C12의 근육 아세포에 손상되었다. Myotubes은 MF-20의 면역 염색에 의해 가시화되었다. 스케일 바는 100 μm의입니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54078/54078fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54078/54078fig3.jpg" /> Celf1 부분적으로 구출 CUG-확장 유도 근원 세포의 분화 결핍의 그림 3. 최저. 웨스턴 블롯에 의해 Celf1 최저의 (A) 증거. GFP-CUG200의 근육 아세포에서 (B) Celf1 shRNA를 유도 myotube 형성. Myotubes은 MF-20의 면역 염색에 의해 가시화되었다. 스케일 바는 융합 지수와 myotube 영역을 증가 하였다 100 μm의. (C) Celf1의 shRNA가-구조 세포이다. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. (D) Celf1의 실시간 RT-PCR 분석, 전사는 차별화 동안 MyoD, MyoG 및 Mef2c 발현 요인. mRNA의 수준은 GAPDH의 정규화 이후에 플롯 하였다. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 학생의 T 테스트는 컨트롤에 검사를 비교 하​​였다. N&gt; 3, * P &lt;0.05. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54078/54078fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

이 프로토콜에서는, 우리는 최적화 된 C2C12 세포의 유지 보수, 유전자 형질 전환 / 전달 및 심근 분화를 포함한 근긴장 성 이영양증 1 근원 세포 모델을 설정하는 절차를 제시한다.

C2C12 근육 모세포의 세포에 근긴장 성 이영양증 1 모델링

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

15.2K 조회수.  University of Houston.  이 프로토콜에서는, 우리는 최적화 된 C2C12 세포의 유지 보수, 유전자 형질 전환 / 전달 및 심근 분화를 포함한 근긴장 성 이영양증 1 근원 세포 모델을 설정하는 절차를 제시한다. 

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Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

전기 자극의 손쥐 Myoblast의 전구 세포 및 응용에서 공학 골격근 조직도

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

연구

생체공학

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily conserved structures that compose it are assembled remains under investigation. Their size and physiological features often constrain manipulation and imaging applications. The culture of immortalized cell lines is widely used, but it can only replicate the early steps of differentiation.
Here, we describe a protocol that enables easy genetic manipulation of myofibers originating from primary mouse myoblasts. After one week of differentiation, the myofibers display contractility, aligned sarcomeres and triads, as well as peripheral nuclei. The entire differentiation process can be followed by live imaging or immunofluorescence. This system combines the advantages of the existing ex vivo and in vitro protocols. The possibility of easy and efficient transfection as well as the ease of access to all differentiation stages broadens the potential applications. Myofibers can subsequently be used not only to address relevant developmental and cell biology questions, but also to reproduce muscle disease phenotypes for clinical applications.

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

라이브 영상에 대한 성숙한 근섬유의 체외 분화

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

발생학

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

문화 접시에있는 기능성 모터 단위 : 척수의 Explants와 근육 세포의 공동 문화

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

신경과학

Molecular Imaging to Target Transplanted Muscle Progenitor Cells

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe genetic neuromuscular disorder that affects 1 in 3,500 boys, and is characterized by progressive muscle degeneration1, 2. In patients, the ability of resident muscle satellite cells (SCs) to regenerate damaged myofibers becomes increasingly inefficient4. Therefore, transplantation of muscle progenitor cells (MPCs)/myoblasts from healthy subjects is a promising therapeutic approach to DMD. A major limitation to the use of stem cell therapy, however, is a lack of reliable imaging technologies for long-term monitoring of implanted cells, and for evaluating its effectiveness. Here, we describe a non-invasive, real-time approach to evaluate the success of myoblast transplantation. This method takes advantage of a unified fusion reporter gene composed of genes (firefly luciferase [fluc], monomeric red fluorescent protein [mrfp] and sr39 thymidine kinase [sr39tk]) whose expression can be imaged with different imaging modalities9, 10. A variety of imaging modalities, including positron emission tomography (PET), single-photon emission computed tomography (SPECT), magnetic resonance imaging (MRI), optical imaging, and high frequency 3D-ultrasound are now available, each with unique advantages and limitations11. Bioluminescence imaging (BLI) studies, for example, have the advantage of being relatively low cost and high-throughput. It is for this reason that, in this study, we make use of the firefly luciferase (fluc) reporter gene sequence contained within the fusion gene and bioluminescence imaging (BLI) for the short-term localization of viable C2C12 myoblasts following implantation into a mouse model of DMD (muscular dystrophy on the X chromosome [mdx] mouse)12-14. Importantly, BLI provides us with a means to examine the kinetics of labeled MPCs post-implantation, and will be useful to track cells repeatedly over time and following migration. Our reporter gene approach further allows us to merge multiple imaging modalities in a single living subject; given the tomographic nature, fine spatial resolution and ability to scale up to larger animals and humans10,11, PET will form the basis of future work that we suggest may facilitate rapid translation of methods developed in cells to preclinical models and to clinical applications.

A non-invasive means to evaluate the success of myoblast transplantation is described. The method takes advantage of a unified fusion reporter gene composed of genes whose expression can be imaged with different imaging modalities. Here, we make use of a fluc reporter gene sequence to target cells via bioluminescence imaging.

이식 근육 전구 세포를 타겟팅 할 수 분자 이미징

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe genetic neuromuscular disorder that affects 1 in 3,500 boys, and is characterized by progressive muscle ...

의학

Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA

Extracellular matrix (ECM) proteins are crucial for skeletal muscle development and homeostasis. The stable knockdown of genes coding for ECM proteins in C2C12 myoblasts can be applied to study the role of these proteins in skeletal muscle development. Here, we describe a protocol to deplete the ECM protein ADAMTSL2 as an example, using small-hairpin (sh) RNA in C2C12 cells. Following transfection of shRNA plasmids, stable cells were batch-selected using puromycin. We further describe the maintenance of these cell lines and the phenotypic analysis via mRNA expression, protein expression, and C2C12 differentiation. The advantages of the method are the relatively fast generation of stable C2C12 knockdown cells and the reliable differentiation of C2C12 cells into multinucleated myotubes upon depletion of serum in the cell culture medium. Differentiation of C2C12 cells can be monitored by bright field microscopy and by measuring the expression levels of canonical marker genes, such as MyoD, myogenin, or myosin heavy chain (MyHC) indicating the progression of C2C12 myoblast differentiation into myotubes. In contrast to the transient knockdown of genes with small-interfering (si) RNA, genes that are expressed later during C2C12 differentiation or during myotube maturation can be targeted more efficiently by generating C2C12 cells that stably express shRNA. Limitations of the method are a variability in the knockdown efficiencies, depending on the specific shRNA that may be overcome by using gene knockout strategies based on CRISPR/Cas9, as well as potential off-target effects of the shRNA that should be considered.

Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin shRNA

We provide a protocol to stably knock down genes encoding extracellular matrix (ECM) proteins in C2C12 myoblasts using small-hairpin (sh) RNA. Targeting ADAMTSL2 as an example, we describe the methods for the validation of the knockdown efficiency on the mRNA, protein, and cellular level during C2C12 myoblast to myotube differentiation.

작은 헤어핀 (sh)RNA를 사용하여 C2C12 근강 세포주에서 세포 외 매트릭스 단백질을 코딩하는 유전자의 안정적인 녹다운

Extracellular matrix (ECM) proteins are crucial for skeletal muscle development and homeostasis. The stable knockdown of genes coding for ECM proteins in ...

유전학

Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of human myoblasts. Several mouse models have been created but they either do not truly represent the human physiopathology of the disease or are not representative of the broad spectrum of mutations found in humans. The immortalization of human primary myoblasts is an alternative to this limitation; however, it is still dependent on muscle biopsies, which are invasive and not easily available. In contrast, skin biopsies are easier to obtain and less invasive to patients. Fibroblasts derived from skin biopsies can be immortalized and transdifferentiated into myoblasts, providing a source of cells with excellent myogenic potential. Here, we describe a fast and direct reprogramming method of fibroblast into a myogenic lineage. Fibroblasts are transduced with two lentiviruses: hTERT to immortalize the primary culture and a tet-inducible MYOD, which upon the addition of doxycycline, induces the conversion of fibroblasts into myoblasts and then mature myotubes, which express late differentiation markers. This quick transdifferentiation protocol represents a powerful tool to investigate pathological mechanisms and to investigate innovative gene-based or pharmacological biotherapies for neuromuscular disorders.

This protocol describes the conversion of skin fibroblasts into myoblasts and their differentiation into myotubes. The cell lines are derived from patients with neuromuscular disorders and can be used to investigate pathological mechanisms and to test therapeutic strategies.

신경 근육 장애에 대 한 치료를 조사 하기 위해 Myoblasts에 인간 섬유 아 세포의 직접 재프로그래밍

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

마우스 골격 근 이식에서 기본 근구의 격리 및 분화

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

질병 모델링을위한 근육 조직 검사에서 환자 유래 세포주의 분리 및 멸화

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, Charcot-Marie-Tooth disease, and spinal muscular atrophy, which are all associated with muscular atrophy. Primary cultures of spinal MNs have been used widely to demonstrate the involvement of specific genes in such diseases and characterize the cellular consequences of their mutations. This protocol models a primary MN culture derived from the seminal work of Henderson and colleagues more than twenty years ago. First, we detail a method of dissecting the anterior horns of the spinal cord from a mouse embryo and isolating the MNs from neighboring cells using a density gradient. Then, we present a new way of efficiently transfecting MNs with expression plasmids using magnetofection. Finally, we illustrate how to fix and immunostain primary MNs. Using neurofilament mutations that cause Charcot-Marie-Tooth disease type 2, this protocol demonstrates a qualitative approach to expressing proteins of interest and studying their involvement in MN growth, maintenance, and survival.

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

The goal of this technique is to prepare a highly enriched culture of primary motoneurons (MNs) from murine spinal cord. To evaluate the consequences of mutations causing MN diseases, we describe here the isolation of these isolated MNs and their transfection by magnetofection.

마우스 기본 Motoneurons Transfecting으로 Charcot Marie이 질병에서 체 외에서 모델링

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

초기 산후 발달에 있는 에머리 드레이푸스 근 이영양증의 Murine 모형에서 단 근섬유 격리 및 문화

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...