This research was supported by the AXonomIX research project financed by the Provincia Autonoma di Trento, Italy.

マウス組織を得るために使用される慣行は、トレント大学（イタリア）の動物の保護（OPBA）、プロトコルがないためにボディによって承認されました。 art.31政令に従って、04から2015まで、ありません。 2014分の26。全てのマウスを統合生物学センター（CIBIO）、トレント大学、イタリアのモデル生物の施設で維持しました。 注意：サンプルの任意のRNA分解を避けるためのRNaseの混入を最小限にするためにDEPC処理水を使用してすべてのバッファを準備します。 脳全体からポリソームの調製<ol><li>脳組織収集（15分） <ol><li> 5分36 CO 2窒息と野生型マウス株C57BL / 6を安楽死させます。慎重に、頭蓋骨36から脳を解剖1.5mlチューブに組織を配置し、直ちに液体窒素中に入れてください。使用するまで-80℃で保管してください。 </li></ol></li><li>溶解液の調製（30分） <ol><li>使用した全脳組織を粉砕液体窒素下で乳鉢と乳棒。 </li><li>冷たいマイクロ遠心チューブに約25mgの粉末を移し、すぐにすぐに上下にピペッティング25回溶解バッファー（ 表1参照）の0.8ミリリットルを追加し、細胞を崩壊させる（粉砕組織の融解を避けるため）。 </li><li>細胞破片をペレット化し、4℃で1分間、12,000×gでチューブを遠心。 </li><li>新しいマイクロチューブに上清を移し、15分間氷上でチューブを保持します。 </li><li>核とミトコンドリアをペレット化し、4℃で5分間、12,000×gでチューブを遠心。 </li><li>新しいマイクロチューブに上清を移します。 </li><li> 6ヶ月の最大のために-80℃で上清を保存したり、すぐにそれを使用しています。 </li></ol></li><li>スクロース勾配調製し、遠心分離（2時間30分） <ol><li> RNaseフリー水（ジエチル処理水（DEPC-水）または商業）ANと広範囲に洗浄超遠心管D 3％H 2 O 2 / DEPC H 2 O溶液。 </li><li>氷の上にチューブを入れて、（スクロース溶液については表1を参照）を各チューブの底の冷たい50％ショ糖溶液の5.5ミリリットルを追加します。慎重にチューブが完全に満たされるまで、鋭い相間を維持するために、中間相に近い滞在し、ドロップすることにより、15％ショ糖溶液のドロップを追加します。チューブが完全に満たされると、気泡の形成を回避するために、ゴム栓で閉じます。 </li><li>寒い部屋で静かに水平管を敷設し、2時間、この位置に保管してください。この時間の後、ゆっくりとバック垂直位置にチューブをまっすぐにし、氷の上に置きます。グラデーションは現在、使用される準備ができています。また、前者の従来の勾配を使用して、百分の15から50までのショ糖勾配を準備します。 </li><li> すなわち、上清をSTEで得られた（低温室で勾配の上部から慎重に1.0ミリリットルを除去し、細胞質ゾル溶解物とのドロップによりショ糖降下をオーバーレイP 1.2）。 </li><li>慎重スイングバケットローターのバケットにチューブを下げます。超遠心機を用いて、4℃で18万×gで100分間の勾配を遠心分離します。 </li><li>遠心分離後、勾配は安定化させるために4℃で20分間、彼らのバケットにチューブを残します。 </li></ol></li><li>スクロース勾配分画（2時間） <ol><li>慎重に超遠心ローターから1超遠心管を削除し、密度勾配分画システムのコレクタ装置にマウントします。 （ 図1上パネルを参照してください）UV / VIS検出器を用いて260 nmの吸光度を監視する1ミリリットルの画分を収集します。氷の上で集めた画分を保管してください。 </li><li> 、関心の画分の30-40μlのアリコートを準備し、使用するまで-80℃で保管する前に、氷の上に保管してください。二つ以上の凍結融解サイクルを受けたアリコートまたはショ糖画分を使用しないでください（ 図1下のパネルを参照）。 </li></ol> &lt;/李&gt; </ol>原子間力顕微鏡（3時間）2.サンプル調製<ol><li>マイカシートをはがし、テープを使用しました。 </li><li> DEPC水でマイカシートを3〜4回​​洗浄し、小さなペトリ皿に入れてください。その後、空気を用いて表面を乾燥させます。 </li><li> 1 mMののNiSO 4200μlでマイカをカバーし、室温で3分間インキュベートします。 </li><li>ニッケル溶液を外し、空気を用いて表面を乾燥。氷の上に雲母とペトリ皿を置くことによって4℃で将来のすべてのステップを実行してください。 </li><li>氷の上に1.4.2で得られた一定分量を解凍し、軽く雲母のドロップにより試料滴のすべてを追加します。 100~200μlのチップを使用して、雲母の表面全体にサンプルを広げ。 3分間氷上でサンプルをインキュベートします。 </li><li> 200μlの冷緩衝液-AFM（ 表1参照）でドロップすることによりマイカシートの低下をカバーし、氷上で1時間インキュベートします。 </li><li>液体中のイメージング<ol><li>慎重にバッファ-AFMを削除し、マイカシート3-4時間を洗います200μlの冷緩衝液-AFMでのsが過剰ショ糖を除去しました。次いで、溶液のいくつかのマイクロリットルで覆われた雲母表面を残し、（ 表1参照）冷洗浄液でマイカシートを3回洗浄します。 </li><li> 3（画像取得）を指すように移動します。 </li></ol></li><li>空気中のイメージング<ol><li>慎重にバッファ-AFMを削除し、過剰ショ糖を除去するために、200μlの冷緩衝液-AFMでマイカ3-4回洗浄します。そして、マイカを冷洗浄溶液で3回洗浄する（ 表1参照 ）、紙を使用して余分な水分を排出します。 </li><li>部分的に開いたペトリ皿の上部との化学フード下で乾燥させるためにサンプルを残します。 2時間後、室温でペトリ皿と店を閉じます。彼らは何年も安定しているように2〜3時間後のサンプルを測定します。 </li></ol></li></ol> 3.画像取得（熱安定化後の画像あたり15分） 注：雲母上に固定化されたポリソームがACモードを使用して、空気中または液体中で画像化することができます。 <ol><li>両面テープを使用して、サンプルホルダーに雲母を取り付けます。 </li><li>製造元の指示に従ってAFMステージにおけるサンプルホルダーを挿入します。可能な場合、撮像は、液体中に、時間的にポリソーム安定性を高めるためより低い温度25℃でサンプルを維持しようとします。 </li><li> ACイメージングに適したカンチレバーを選択して、チップホルダ以下のメーカーの指示にマウントします。ここでは、空気のイメージングのための2-20 N / mおよび液体イメージングのための周りに0.1 N / mの間に一定の力で使用カンチレバー。 </li><li>カンチレバー上のレーザスポットを調整し、象限検出器信号をゼロ。 </li><li>時宜を得た駆動周波数を選択して、10から20ナノメートルの振幅でカンチレバーを駆動します。 </li><li>先端が表面に係合するまでサンプルに近づきます。 </li><li> 2×2ミクロンのスキャン領域を選択し、少なくとも512×512ピクセルの画像を取得する（ピクセル幅&lt;4 nm）を、ライブバックグラウンド減算モードと20〜25ナノメートルのZスケールを選択します。 </li><li>トンを点検彼は、画像範囲25から30ナノメートルの空気と25と液体中の30nmの幅で取得する際の10と15nmの間の高さによって特徴づけラウンド物体の存在を探しています。鋭利なものを可視化されるまで、設定値とフィードバックのパラメーターを調整します。背景には、いくつかの2-4 nmの高さのオブジェクト（ 図2AおよびBを参照）で、良好な試料中の比較的平坦な表示されます。 </li><li> （ポイント3.8で示されるように）画像が良く見える場合は、別のサンプル領域におけるいくつかの（少なくとも10）2×2ミクロンのスキャンを取得します。 </li><li> （任意）。必要であれば、選択されたポリソームの高解像度の画像を取得する（ 図2C参照 ）。 </li><li> AFM像の任意の傾きを除去し、効果を漂流を修正するためにソフトウェアの修正（平面減算およびライン・バイ・ライン補正アルゴリズム）を適用します。 </li></ol> 4.データ解析（画像あたり30分） <ol><li> ImageJの中のエクスポート画像（オプション：スケールファクタを適用）preferentially 例えば 、可逆圧縮フォーマットを使用して、TIFF形式（ 図3A参照 ）。 </li><li> （ 図3Cを参照）ポリソームでリボソームをカウントする（ 図3Bを参照）、サンプルの統計的特性を計算するために（ImageJのマクロ/ツールセットのサブディレクトリにコピーする）ImageJのマクロツールセットRiboPick.ijmを使用してください。 <ol><li>プログラムの初期化&lt;読み取り画像&gt;ツールを使用して画像をロードを開始。 </li><li>標準ImageJの&lt;ポイント選択&gt;ツール（シフト+左クリックは、リボソームの複数選択を可能にする）とリボソームセンターを選択してください。 &lt;マークリボソーム&gt;ツールで選択されたリボソームをマークします。リボソーム座標は、カスタムテキストウィンドウに表示されます。 </li><li>ポイント4.2.2で示す手順を繰り返す同じポリソームへのより多くのリボソームを追加します。 </li><li>第1に最後に追加されたリボソームから取り外す開始する（&lt;最後のピックを元に戻す&gt;ツールを使用して、誤ってマークされたリボソームを削除します212;現在のポリソーム中のみ）。 </li><li>ポリソームが完了すると、&lt;新規ポリソーム&gt;ツールを使用します。ポリソーム数は画像のオーバーレイとして追加されるように、テキストウィンドウが更新されます。 </li><li>リボソームを書くために、&lt;結果を保存して閉じを&gt;使用して、ファイル（画像のデフォルトの単位が使用されている）と、選んだリボソームおよびポリソームをまとめたPNG画像を調整します。元の画像は保存されずに閉じられています。 </li></ol></li></ol>

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The authors have no competing financial interests in this paper and nothing to disclose.

DNAの構造は転写およびクロマチンの組織化は、遺伝子発現の転写制御の我々の理解を進めたようなプロセスを記述するために最も重要であることが証明されたように、真実の理解を向上させるためにポリソームの組織構造を分析することが不可欠です翻訳とその調節の。 記載されたプロトコルを用いて、穏やかに平坦な表面上に固定化されたポリソームの最適密度は、AFM画像化に適したが得られます。好都合に調製したサンプルでこれらの条件を使用して、毎時約50ポリソームは、さらなる分析および特徴付けのための準備ができて取得することができます。また、室温で保存された乾燥した試料を、一年以上後のイメージングに適していることが証明されています。 成功した私たちのプロトコルでポリソーム画像を得るために、いくつかの重要なステップがあります：適切dissectio直後に瞬間凍結された組織を使用しますnおよびRNA分解を最小限に抑えるために-80℃で保存しました。 mRNAからリボソーム解離を避けるために、シクロヘキシミドおよびRNase阻害剤を含む溶解緩衝液を使用します。雲母上のサンプル堆積中に氷の上のすべてのインキュベーションを実行します。そして、広範囲にシクロヘキシミドの存在下でのバッファおよびRNaseを含まない水で雲母上のサンプルを洗浄するために、空気のAFMイメージングのためのサンプルを準備するとき。最後の点は特に重要です。画像は約右の高さを滑らかな表面を含んでいるように見えますが、100〜1000 nmの広い場合は、これが不十分洗浄した試料（多くの場合、リボソーム/ポリソームはまだかすかな、埋め込みオブジェクトとして観察することができる）を明確に示しています。この問題を解決する方法は、洗浄手順を繰り返すことであるが、これは、通常、すでに乾燥した試料上の問題を軽減しません。この場合、新たなアリコートで再び開始する価値があります。 AFMの解像度を考えると、ポリソームを研究するため、この方法は、STRUCを解決することはできませんポリソーム中のリボソームのインターフェイスのtural詳細。実際には、AFMは、効果的かつ堅牢な技術を表す、-EMを凍結するポリソームの数千を取得し、分析するために、より良いポリソームの全体的なリボソーム組織を理解し、相補し、単純なアプローチです。重要なことに、このプロトコルは、RNA 27と互換性のあるフィラメントを識別する固有の利点を有します。この全く同じ手順では、任意の生体組織または細胞株から得られた任意のポリソームサンプルのために使用することができます。より重要なことは、正常な最近ラウリアおよび共同研究者35によって示されるように、 インビトロ翻訳系を用いて転写固有の情報を取得するために使用することができます。この方法論は、ポリソーム形成または異なる細胞または組織の条件下でポリソーム組織の変化の動態の理解を得るために、いくつかの実験のために道を開きます。

タンパク質の合成は、細胞1,2の中で最もエネルギーを消費するプロセスです。したがって、タンパク質の存在量は、主に翻訳なく転写レベル3,4,5で制御されることではない驚くべきことです。ポリソームは、機能的なタンパク質性の読み出しへのmRNAの情報を変換する基本的な高分子成分です。ポリソームは、これまでいくつかの翻訳のコントロールが6-13を収束高分子複合体として認識されています。リボソーム構造14〜16に関する研究の数百にもかかわらず、翻訳のダイナミクスへの詳細な分子洞察やポリソームのトポロジーは、限られた関心が発生しました。その結果、ネイティブポリソームリボ核タンパク質複合体の組織や翻訳に対する潜在的な効果はまだとても曖昧な問題です。ポリソームは、潜在的にどのようなヌクレオソームとエピジェネティック制御をミラーリング、まだ不明注文し、機能的な組織を非表示にすることができますlsコマンドは、転写フィールドに表されています。実際、この魅力的な仮説の調査は、さらなる研究と新しい技術的なアプローチが必要です。この行では、構造的な技術や原子間力顕微鏡は、実り同様にヌクレオソーム17,18のために達成されたものに、遺伝子発現を制御するための新しいメカニズムを解明するために協力することができます。 リボソーム14-16の発見以来、その構造は、広範囲のタンパク質合成のベースにメカニズムの分子の説明を提供する、原核生物19,20、より最近のヒト22における酵母21とで特徴付けられています。ポリソームは、最初は、一般的な2D幾何学的な組織14を形成し 、小胞体の膜に認められました。前に述べたように、ポリソームアセンブリは、リボソーム構造などの一定の関心の対象ではなかったです。過去には、ポリソームはTRによって、本質的に研究されてきましたansmission EMベースの技術。ごく最近になって、クライオEM技術は、人間の細胞溶解物27またはセル28で、23-26 インビトロ翻訳系から精製されたポリソームの3D再構成を可能にしました。これらの技術はポリソーム23、26-28と小麦胚芽ポリソーム24内の隣接するリボソームの接触面の予備的分子の説明ではリボソームリボソーム組織に関するより多くの洗練された情報を提供しました。したがって、クライオEM断層撮影法は、分子の詳細とリボソームリボソーム相互作用の開示を可能にするが、それはデータ処理のために重い計算リソースを必要とする大規模なポスト処理及び再構成の分析によって負担されます。また、リボソームリボソーム相互作用の分子の詳細を得るために、リボソームの高解像度のマップが必要とされ、基準リボソームのこの種のは、ほんの数種のために利用可能です。重要なことは、低温電子顕微鏡断層撮影法では、無料RNAを検出することができません。 Theref鉱石は、新しい技術が完全に翻訳機構の組織を理解する必要があります。 クライオEMのほかに、AFMはまた、下等真核生物29-33と人間27にポリソームの直接画像化のための有用なツールとして採用されています。 EMと比較すると、AFMには、サンプルの固定または標識化を必要としません。また、測定は、近くの生理学的条件下で、はっきりとリボソームと裸のRNA鎖27の両方を特定するユニークな可能性を用いて行うことができます。単一ポリソームのイメージングは​​、広範かつ重いポスト処理及び再構成に比べて少し後処理の労力でナノ分解能で数千ものイメージを取得し、比較的迅速に行うことができるクライオEM顕微鏡で必要とされる分析。その結果、AFMデータハンドリング及び分析は、高価なワークステーションと高い演算能力を必要としません。このように、この技術は、ポリソームの形状に関する情報を収集し、形態学的特性（例えば高さ、長さと幅）、リボソーム密度、自由なRNAの存在とクライオEMよりも高いスループットでポリソーム27あたりのリボソームの数。このように、AFMはポリソーム27を描写するためにEM技術に強力かつ補完的なアプローチを示します。 ここでは、AFMが画像に適用し、マウス脳ポリソームを分析されたデータの分析に精製からの完全なパイプラインを提示します。提案されたプロトコルは、精製の問題にとAFMイメージングのために使用されているマイカ基板上のポリソームの正確な堆積に焦点を当てています。簡単にAFMコミュニティで使用される一般的なソフトウェアを用いて行うことができる従来の粒子の分析に加えて、RiboPick呼ばImageJの34プラグインは、ポリソーム27、35当たりのリボソームの数をカウントするために提示されています。

<table><tbody><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>01810</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>DNAseI</td><td>Thermo Scientific</td><td>89836</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>RiboLock RNAse Inhibitor</td><td>Life technologies</td><td>EO-0381</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>40718</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8532</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Microcentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S5016</td><td>Sucrose gradient preparation</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima LE-80K</td><td>Sucrose gradient centrifugation</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW 41 Ti</td><td>Sucrose gradient centrifugation</td></tr><tr><td>Polyallomer tube</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td>Sucrose gradient centrifugation</td></tr><tr><td>Density Gradient Fractionation System&amp;nbsp;</td><td>Teledyne Isco</td><td>67-9000-176</td><td>Sucrose gradient fractionation</td></tr><tr><td>AFM</td><td>Asylum Research</td><td>Cypher</td><td>Polysome visualization</td></tr></tbody></table>

peering at brain polysomes with atomic force microscopy

翻訳機構は、 すなわち、ポリソームまたはポリリボソームは、細胞内で最大かつ最も複雑な細胞質機械の一つです。リボソーム、mRNAを、いくつかのタンパク質非コードRNAによって形成されたポリソームは、翻訳制御が行われるプラットフォームを統合表します。リボソームは、広く研究されているがしかし、ポリソームの組織はまだ包括的に理解を欠いています。このように多くの努力がポリソーム組織と埋め込まれていてもよい翻訳制御のいずれかの新たなメカニズムを解明するために必要とされます。原子間力顕微鏡（AFM）は、ナノスケールの解像度で3D画像の取得を可能にする走査型プローブ顕微鏡の一種です。電子顕微鏡（EM）の技術に比べて、AFMの主な利点の一つは、それが染色およびプロ固定を必要とせずに近くの生理学的条件下で維持されるべきサンプルを可能に空気中で、溶液中に両方の画像の数千を取得することができるということですcedures。ここでは、マウス脳及びマイカ基板上での堆積からポリソームの正確な精製のための詳細なプロトコールが記載されています。このプロトコルは、AFMと3次元物体としての復興と空気や液体中でポリソームイメージングを可能にします。低温電子顕微鏡（クライオEM）に相補的な、提案された方法は、好都合に系統的ポリソームを分析し、それらの組織を研究するために使用することができます。

全マウス脳のショ糖勾配ポリソームプロファイリング 彼らの重量とサイズに合わせて巨大分子を分離ポリソームプロファイリングによって、細胞溶解物からポリソームを精製することが可能です。ポリソームプロファイリングでは、このような本例のように培養した細胞または組織から得られた細胞質溶解物は、（その沈降係数に従って40Sおよび60Sサブユニット、80Sリボソームおよびポリソームから無料でRNAを分離するために超遠心分離することにより、線形ショ糖勾配上にロードされ、処理されます図1上パネル）。 254 nmでサンプルの吸光度とフラクションコレクションは、転写物あたりのリボソームの数が異なるリボソームやポリソームに富むショ糖画分の分離を可能にします。画分を集め、AFM画像化のために等分し、-80℃で保存することができる（ 図1下のパネル）。 空気中でAFMによって観察マウス脳由来の天然ポリソームは、タイトなリボソーム相互作用を明らかにする 画像取得は、（また、タッピングモードとしても知られる）、ACモードを使用して行われます。この様式は、チップ - サンプル相互作用及び対応する剪断力が大幅に低減されているため（例えば、ポリソームなど）のソフトサンプルを撮像するために特に適しています。このように、チップと試料の両方が保持されます。 AFMイメージングは​​、このような測定条件、チップの種類、試料の性質等の様々な要因に依存する正確な値を使用して、高解像度のデータの取得を可能にします。この論文に記載された条件で、約4-6ナノメートルの横方向の解像度と0.1から0.2ナノメートルの垂直解像度が達成可能です。雲母上のショ糖のアリコートを堆積させた後、AFMは、単一のポリソームの記述を提供します密集したリボソーム（ 図2A、CおよびC）のクラスタとして表示されます。クロスセクション分析（ 図2D）ことにより、リボソームのピークの高さは、以前に空気乾燥27後ポリソーム中のヒトリボソームのために観察されたものと合わせて14ナノメートル程度です。ラインプロファイルによって識別されるリボソームの中心までの距離に中心を溶液37、38におけるリボソームの寸法と一致している23 nmです。 単一の画分からポリソームあたりのリボソームの数は、単分散分布を示しています 図3Aは、ショ糖勾配の画分から雲母に吸収されたサンプルを取得することによって得られる典型的なAFM像を報告します。挿入図はribosの同定に適した倍率で、単一のポリソームのデジタルズームを示していますポリソームでomes。パネルBは 、RiboPickマクロとリボソーム識別した後に同じ画像を示しています。レッド円は、（挿入図を参照）リボソームをマークし、プログレッシブ数（シアン）は、リボソームの会合は、特定のポリソームとの調整を支援するために使用されます。ポリソームあたりのリボソームの数の頻度分布は明らかに単一のピークを示し、（ パネルC、灰色のバー）（中程度の分子量のポリソーム（MMW）に対応し、 図1.、下のパネルを参照してください）画分＃10について分析しました。実験的分布は1.3リボソーム/ポリソームの標準偏差は、5.8リボソーム/ポリソームを中心としたガウス曲線（黒線）を取り付けました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53851/53851fig1.jpg" /> 全マウス脳のショ糖勾配沈降図1.代表的吸光度プロファイル。（上層panel）Aポリソーム細胞質溶解物）[w / vの] P27マウス脳から得られ、線形スクロース勾配上にロード（15から50パーセントスクロースました。 RiboNucleoParticlesの254 nmの（RNP）での吸光度に対応する明瞭なピーク、リボソームサブユニット（40Sおよび60S）、リボソーム（80S）とポリソームを観察することが可能です。繰り返しの凍結を回避し、雲母上のAFMの堆積前のサンプルのサイクルを解凍するためには、一定分量に分割するのが便利であるリボソーム画分と異なる転写産物あたりのリボソームの数（ すなわち、低、中、高とポリソーム画分（下のパネル）の両方-molecular量ポリソーム（それぞれLMW、MMWおよびHMW、））。アリコート限り二年として-80℃で保存することができます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53851/53851fig2.jpg" /> MMW脳ポリのAFM像のタッピングモード原子間力顕微鏡。（A）の例により図脳ポリソームの2画像をサムス雲母に吸収された後のリニアグレースケールを使用して。背景の0から0.5 nmのグレー、0.5〜2ナノメートル、およびリボソームのための2-10 nmの黄色：（B）（A）に示されているのと同じ画像がカラースケールのための異なるZ-範囲を使用して描かれています。この場合、より良好な視覚的コントラストが低く、高Z域オブジェクトの両方について得られます。 （C）断面プロファイル（点在白線）との典型的なMMWのポリソームの倍率。 （D）（C）の断面プロファイルで定義された2つのリボソームの高さプロファイルは、14ナノメートルのリボソームの高さを示しています。この値は、以前にポリソーム27中のヒトリボソームのためにAFMで観察されたものと互換性があります。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53851/53851fig3.jpg" /> MMW脳ポリソームでポリソームあたりのリボソームの数を数えるの図3の例。repre（A）AFM像ImageJのマクロ、RiboPickの入力をsents。 （B）手動ポリソームごとに各リボソームをピッキングした後、RiboPickは、画像内の各リボソーム（赤丸）の位置をマークします。 （C）ポリソーム当たりリボソームの取得数は、ガウス曲線を装着することができる分布としてプロットすることができます。この例において考慮ポリソームの数が9の独立した画像から得られた、164です。ガウス曲線とのフィッティングは、MMW画分（＃リボソーム/ポリソーム5.8±1.3、R 2 = 0.99）でポリソームの集団の平均値を返します。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> バッファ </td><td> 組成 </td><td> 応用 </td></tr><tr><td>溶解バッファー</td><td> 10mMのトリス-HCl、pH7.5で</td><td>溶解液の調製（1.1） </td></tr><tr><td></td><td> 10mMのNaClを</td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10のMgCl 2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1％のTriton-X100 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1％デオキシコール酸Na </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 0.4 U / mlのRNase阻害剤</td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1mMのDTT </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 0.2 mg / mlでシクロヘキシミド</td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5 U / mlのDNアーゼI </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50％スクロース溶液</td><td> 50％（w / v）のスクロースで</td><td>スクロース勾配製剤（1.2） </td></tr><tr><td></td><td> 100mMのNaCl </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10のMgCl 2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10 mMトリス/ HClをpHが7.5 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr> &lt;TR&gt; <td> 15％ショ糖溶液</td><td> 15％（w / v）のスクロースで</td><td>スクロース勾配製剤（1.2） </td></tr><tr><td></td><td> 100mMのNaCl </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10のMgCl 2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10 mMトリス/ HClをpHが7.5 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニッケル溶液</td><td> 1 mMののNiSO 4 </td><td> AFMのためのサンプル調製（2） </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>バッファ-AFM </td><td> 100mMのNaCl </td><td> AFMのためのサンプル調製（2） </td></tr><tr><td></td><td> 10のMgCl 2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 100μg/ mlのシクロヘキシミド</td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10mMのヘペス</td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="2"> 3％（w / v）のスクロースをpH = 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>洗浄液</td><td> DEPC - 水</td><td> AFMのためのサンプル調製（2） </td></tr><tr><td></td><td> 100μg/ mlのシクロヘキシミド</td><td></td></tr></tbody></table> 表1バッファ。

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Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

原子間力顕微鏡で脳ポリソームでピアリング

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K ビュー.  Fondazione Bruno Kessler. While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid. 

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Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

原子間力顕微鏡を用いて組換えDNAとタンパク質の複合体の可視化

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

生物工学

Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be measured to ~10 pN by a laser and sectored detector, which can be converted to image topography. Amplitude modulation or &#8220;tapping mode&#8221; AFM involves the probe making intermittent contact with the surface while oscillating at its resonant frequency to produce an image. Used in conjunction with a fluid cell, tapping-mode AFM enables the imaging of biological macromolecules such as proteins in physiologically relevant conditions. Tapping-mode AFM requires manual tuning of the probe and frequent adjustments of a multitude of scanning parameters which can be challenging for inexperienced users. To obtain high-quality images, these adjustments are the most time consuming.
PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) produces an image by measuring a force response curve for every point of contact with the sample. With ScanAsyst software, PF-QNM can be automated. This software adjusts the set-point, drive frequency, scan rate, gains, and other important scanning parameters automatically for a given sample. Not only does this process protect both fragile probes and samples, it significantly reduces the time required to obtain high resolution images. PF-QNM is compatible for AFM imaging in fluid; therefore, it has extensive application for imaging biologically relevant materials.
The method presented in this paper describes the application of PF-QNM to obtain images of a bacterial red-light photoreceptor, RpBphP3 (P3), from photosynthetic R. palustris in its light-adapted state. Using this method, individual protein dimers of P3 and aggregates of dimers have been observed on a mica surface in the presence of an imaging buffer. With appropriate adjustments to surface and/or solution concentration, this method may be generally applied to other biologically relevant macromolecules and soft materials.

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

PeakForce定量的ナノメカニカルプロパティマッピングを使用した赤色光光受容体の原子間力顕微鏡

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

工学

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子の力分光法

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

生化学

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user's specific system.

We present a method for achieving sub-nanometer resolution images with amplitude-modulation (tapping mode) atomic force microscopy in liquid. The method is demonstrated on commercial atomic force microscopes. We explain the rationale behind our choices of parameters and suggest strategies for resolution optimization.

液体中の振幅変調原子間力顕微鏡でのサブナノメートル分解能イメージング

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription to take place in eukaryotic cells. The dynamics of nucleosomes provides access to the DNA by replication and transcription machineries, and critically contributes to the molecular mechanisms underlying chromatin functions. Single-molecule studies such as atomic force microscopy (AFM) imaging have contributed significantly to our current understanding of the role of nucleosome structure and dynamics. The current protocol describes the steps enabling high-resolution AFM imaging techniques to study the structural and dynamic properties of nucleosomes. The protocol is illustrated by AFM data obtained for the centromere nucleosomes in which H3 histone is replaced with its counterpart centromere protein A (CENP-A). The protocol starts with the assembly of mono-nucleosomes using a continuous dilution method. The preparation of the mica substrate functionalized with aminopropyl silatrane (APS-mica) that is used for the nucleosome imaging is critical for the AFM visualization of nucleosomes described and the procedure to prepare the substrate is provided. Nucleosomes deposited on the APS-mica surface are first imaged using static AFM, which captures a snapshot of the nucleosome population. From analyses of these images, such parameters as the size of DNA wrapped around the nucleosomes can be measured and this process is also detailed. The time-lapse AFM imaging procedure in the liquid is described for the high-speed time-lapse AFM that can capture several frames of nucleosome dynamics per second. Finally, the analysis of nucleosome dynamics enabling the quantitative characterization of the dynamic processes is described and illustrated.

Here, we present a protocol to characterize nucleosome particles at the single-molecule level using static and time-lapse atomic force microscopy (AFM) imaging techniques. The surface functionalization method described allows for the capture of the structure and dynamics of nucleosomes in high-resolution at the nanoscale.

構造と原子間力顕微鏡イメージングによるヌクレオソームのダイナミクスを調べる

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

数百個の C.アルビカン 細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Static Atomic Force Microscopy to Visualize and Characterize Assembled Nucleosomes

Source: Stormberg, T., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58820">Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging.</a> J. Vis. Exp.(2019)
In this video, we demonstrate static atomic force microscopy to visualize assembled nucleosomes. This high-resolution imaging technique allows the study of the nucleosome structure.

アセンブルされたヌクレオソームを可視化し、特性評価するための静的原子間力顕微鏡

Source: Stormberg, T., et al. Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging. J. Vis. Exp.(2019)
In this video, ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

生物学的手法

顕微鏡技術

Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that can analyze topographic details of various specimens like ceramics, glass, polymers, and biological samples. AFM offers over 1000 times more resolution than the optical imaging system. Images generated from AFM are three-dimensional surface profiles, offering an advantage over the flat, two-dimensional images from other imaging techniques.
The AFM Probe
The probe is regarded as the heart of any AFM setup and comprises the cantilever and tip assembly. Probes are the most commonly replaced part on this type of microscope because&#160; the constant interaction with the samples wears down the tip. Therefore, the choice of material for the probe depends on the properties of the sample. Silicon probes, used to analyze hard samples, are stiffer and sharper than silicon nitride probes, which are better suited to scan softer samples. These sharp tips are produced using electrochemical etching or carbon nanotubes for higher accuracy analysis.
Imaging Modes of AFM
In AFM, surface topography is studied using the interaction between the probe tip and the sample surface. There are two main imaging modes &#8212; a static mode, also referred to as the contact mode, and a dynamic mode.
In the static or contact mode, the tip of the probe is in continuous contact with the sample surface. As the tip drags over the surface, repulsive forces between the sample and the tip result in the cantilever bending, which is recorded. The entire specimen surface is scanned back and forth in both x- and y-axes, called raster scanning, while the vertical movement of the cantilever records the z-axis, thus generating a 3D image.
In the dynamic mode, the probe oscillates just above the sample surface, coming close to, but not touching the surface. Attractive and repulsive forces determine the variation in distance between the tip and the sample, affecting the amplitude of cantilever oscillation. This feedback is recorded to construct the surface topography of the sample.

原子間力顕微鏡

Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that can analyze topographic details of various specimens like ceramics, glass, ...

原子間力顕微鏡で脳ポリソームでピアリング

要約

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原子間力顕微鏡を用いて組換えDNAとタンパク質の複合体の可視化

PeakForce定量的ナノメカニカルプロパティマッピングを使用した赤色光光受容体の原子間力顕微鏡

原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子の力分光法

原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

液体中の振幅変調原子間力顕微鏡でのサブナノメートル分解能イメージング

構造と原子間力顕微鏡イメージングによるヌクレオソームのダイナミクスを調べる

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

数百個の C.アルビカン細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

アセンブルされたヌクレオソームを可視化し、特性評価するための静的原子間力顕微鏡

原子間力顕微鏡

原子間力顕微鏡で脳ポリソームでピアリング

要約

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原子間力顕微鏡を用いて組換えDNAとタンパク質の複合体の可視化

PeakForce定量的ナノメカニカルプロパティマッピングを使用した赤色光光受容体の原子間力顕微鏡

原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子の力分光法

原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

液体中の振幅変調原子間力顕微鏡でのサブナノメートル分解能イメージング

構造と原子間力顕微鏡イメージングによるヌクレオソームのダイナミクスを調べる

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

数百個の C.アルビカン 細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

アセンブルされたヌクレオソームを可視化し、特性評価するための静的原子間力顕微鏡

原子間力顕微鏡

数百個の C.アルビカン細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化