Name: peering at brain polysomes with atomic force microscopy
Uploaded: 2016-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy at JoVE.com

This research was supported by the AXonomIX research project financed by the Provincia Autonoma di Trento, Italy.

Die Praktiken verwendet, um die Mausgewebe zu erhalten, wurden zum Schutz der Tiere nach der zugelassenen Stelle (OPBA) der Universität von Trento (Italien), Protokoll Nr. 04-2015, gemäß Art.31 Gesetzesverordnung Nr. 26/2014. Alle Mäuse wurden am Modellorganismus der Einrichtung des Zentrums für Integrative Biologie (CIBIO), Universität Trento, Italien gehalten. Achtung: Um eine RNA-Abbau der Proben zu vermeiden, bereiten alle Puffer DEPC-behandeltem Wasser zur Minimierung von RNase Kontamination mit. 1. Herstellung von Polysomen von Whole Brains <ol><li> Sammeln von Gehirngewebe (15 min) <ol><li> Euthanize Wildtyp - Maus - Stamm C57BL / 6 mit CO 2 Ersticken für 5 min 36. Sezieren vorsichtig das Gehirn aus dem Schädel 36, legen Sie das Gewebe in ein Röhrchen von 1,5 ml und es sofort in flüssigem Stickstoff statt. Bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li></ol></li><li> Herstellung von Lysat (30 min) <ol><li> Pulverisieren der gesamten Hirngewebe mitein Mörser und Stößel unter flüssigem Stickstoff. </li><li> Übertragen etwa 25 mg Pulver zu einem kalten Mikrozentrifugenröhrchen und sofort (das Auftauen des pulverisierten Gewebe zu vermeiden) in 0,8 ml Lysepuffer (siehe Tabelle 1) und stören die Zelle durch Auf- und Abpipettieren 25 - mal schneller. </li><li> Zentrifugiere die Röhrchen bei 12.000 × g für 1 min bei 4 ° C um Zelltrümmer zu pelletieren. </li><li> Den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und halten Sie die Röhrchen auf Eis für 15 min. </li><li> Zentrifugiere die Röhrchen bei 12.000 xg für 5 min bei 4 ° C Kerne und Mitochondrien zu pelletieren. </li><li> Den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Lagern Sie den Überstand bei -80 ° C für maximal 6 Monate oder es sofort ab. </li></ol></li><li> Saccharosegradienten Vorbereitung und Zentrifugation (2 h und 30 min) <ol><li> Wash Ultrazentrifuge Rohre ausgiebig mit RNase-freiem Wasser (Diethylpyrocarbonat behandeltem Wasser (DEPC-Wasser) oder kommerziell) eind 3% H 2 O 2 / DEPC H 2 O Lösung. </li><li> Setzen die Röhrchen auf Eis und fügen Sie 5,5 ml kalter 50% iger Saccharoselösung am Boden jedes Röhrchens (Tabelle 1 für Saccharoselösungen sehen). Sorgfältig in den der Inter um eine scharfe Interphase zu erhalten, die 15% Saccharose-Lösung tropfenweise Aufenthalt in der Nähe, bis das Rohr vollständig gefüllt ist. Wenn das Rohr vollständig gefüllt ist, schließen Sie ihn mit einem Gummistopfen in die Luft Blasenbildung zu vermeiden. </li><li> In einem kalten Raum lag sanft die Rohre horizontal nach unten und halten ihn in dieser Position für 2 Std. Nach dieser Zeit gerade langsam die Rohre zurück in die vertikale Position und legte sie auf Eis. Die Gradienten können jetzt verwendet werden. Alternativ bereiten die 15-50% Saccharose Gradientenformer einen herkömmlichen Gradienten. </li><li> In einem kalten Raum sorgfältig 1,0 ml von der Spitze des Gradienten zu entfernen und die Saccharose - Tropfen für Tropfen mit dem Cytosol - Lysat überlagern (dh der Überstand in Ste erhaltenp 1,2). </li><li> die Rohre in die Eimer Schwingbecherrotor vorsichtig absenken. Zentrifugation der Gradienten für 100 Minuten bei 180.000 × g bei 4 ° C eine Ultrazentrifuge. </li><li> Nach der Zentrifugation bei 4 ° C für 20 Minuten die Röhrchen in ihren Eimer verlassen die Gradienten zu lassen stabilisieren. </li></ol></li><li> Saccharosegradienten-Fraktionierung (2 h) <ol><li> Sorgfältig ein Ultrazentrifugenröhrchen aus der Ultrazentrifuge Rotor zu entfernen und sie auf der Sammelvorrichtung von einem Dichtegradienten Fraktionierungssystem montieren. Sammeln 1 ml Fraktionen Überwachen der Extinktion bei 260 nm mit einem UV / VIS - Detektor (siehe 1 oben). Halten Sie die gesammelten Fraktionen auf Eis. </li><li> Bereiten Sie Teilmengen von 30 bis 40 &amp; mgr; l der Fraktionen von Interesse, halten sie auf Eis, bevor sie bei -80 ° C bis Verwendung zu speichern. Nicht Aliquots oder Saccharose Fraktionen verwenden , die mehr als zwei Gefrier-Tau - Zyklen unterzogen (Abbildung 1 untere Tafel sehen). </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> 2. Probenvorbereitung für die Rasterkraftmikroskopie (3 Stunden) <ol><li> Mit Band, die Glimmerplättchen abziehen. </li><li> Waschen Sie die Glimmerplättchen 3-4 mal mit DEPC-Wasser und legen Sie sie in eine kleine Petrischale. Dann trocknen Sie die Oberfläche Luft. </li><li> Decken Sie den Glimmer mit 200 ul 1 mM NiSO 4 und Inkubation für 3 min bei RT. </li><li> Entfernen Sie die Nickellösung und dann trocknen Sie die Oberfläche Luft. Führen Sie alle weiteren Schritte bei 4 ° C durch die Petrischale platziert mit dem Glimmer auf Eis. </li><li> Tauwetter ein Aliquot in 1.4.2 auf Eis erhalten und sanft die gesamte Probe tropfen auf dem Glimmer hinzufügen. Mit einer 100-200 ul Spitze, verteilt die Probe auf die gesamte Oberfläche des Glimmer. Inkubieren Sie die Probe auf Eis für 3 min. </li><li> Bedecken Sie den Glimmerplättchen tropfenweise mit 200 ul kaltem Puffer-AFM (siehe Tabelle 1) und Inkubation für 1 Stunde auf Eis. </li><li> Imaging in Flüssigkeit <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig den Buffer-AFM und waschen Sie die Glimmerplättchen 3-4 Mals mit 200 ul kaltem Puffer-AFM zur Entfernung von überschüssigem Saccharose. Dann waschen Sie die Glimmerplättchen 3 mal mit kaltem Waschlösung (siehe Tabelle 1), die Glimmeroberfläche von einigen Mikroliter Lösung bedeckt bleibt. </li><li> Zum 3 (Bildaufnahme) zu verweisen. </li></ol></li><li> Imaging in der Luft <ol><li> Vorsichtig die Buffer-AFM entfernen und den Glimmer 3-4 mal mit 200 ul kaltem Puffer-AFM waschen Sie die überschüssige Saccharose zu entfernen. Dann waschen Sie die Glimmer 3 mal mit kaltem Waschlösung (siehe Tabelle 1) und lassen Sie das überschüssige Wasser Papier. </li><li> Lassen Sie die Probe unter der chemischen Haube teilweise offen mit der Spitze der Petrischale zu trocknen. Nach 2 Stunden, schließen Sie die Petrischale und lagern bei RT. Messen Sie die Probe nach 2-3 Stunden, da sie seit Jahren stabil sind. </li></ol></li></ol> 3. Bildaufnahme (15 min pro Bild nach der thermischen Stabilisierung) Anmerkung: Polysomen an immobilisierte Glimmer kann in Luft oder in flüssiger abgebildet werden, AC-Modus. <ol><li> Bringen Sie den Glimmer an den Probenhalter mit doppelseitigem Klebeband. </li><li> Setzen Sie den Probenhalter in der AFM-Bühne Richtungen folgenden Hersteller. Wenn Bildgebung in Flüssigkeit, wenn möglich, versuchen, die Probe bei einer Temperatur unter 25 ° C zu halten Polysomen-Stabilität mit der Zeit zu erhöhen. </li><li> Wählen Sie einen Ausleger geeignet für AC-Bildgebung und montieren Sie ihn an der Spitze des Inhabers Richtungen folgenden Hersteller. Hierbei kann die Verwendung Auslegern mit Kraftkonstante zwischen 2-20 N / m für Luft-Bildgebung und etwa 0,1 N / m für flüssige Bildgebung. </li><li> Stellen Sie den Laserpunkt auf dem Ausleger und Null die Quadranten Detektorsignale. </li><li> Wählen Sie ein opportun Ansteuerfrequenz und Antrieb des Auslegers mit einer Amplitude von 10-20 nm. </li><li> Nähern Sie sich die Probe, bis die Spitze die Oberfläche angreift. </li><li> Wählen Sie einen Scanbereich von 2x2 um, erwerben mindestens 512x512 Pixel-Bilder (Pixelbreite &lt;4 nm), wählen Sie eine Live-Untergrundsubtraktion-Modus und eine Z-Skala von 20 bis 25 nm. </li><li> Überprüfen Sie ter betrachtet für das Vorhandensein von runden Objekten durch die Höhe charakterisiert zwischen 10 und 15 nm, wenn in Luft und 25 und 30 nm, wenn sie in Flüssigkeit und der Breite im Bereich von 25-30 nm zu erwerben. Passen Sie die Soll- und Istwert Parameter bis scharfe Gegenstände sichtbar gemacht werden. Der Hintergrund sollte relativ flach erscheinen in guten Proben, mit einigen 2-4 nm Höhe Objekten (siehe 2A und B). </li><li> Wenn das Bild gut aussieht (wie bei Punkt 3.8 angegeben), erwerben mehrere (mindestens zehn) 2x2 Mikron-Scans an unterschiedlichen Probenbereiche. </li><li> (Optional). Falls erforderlich, hochauflösende Bilder von ausgewählten Polysomen erwerben (siehe Abbildung 2C). </li><li> Anwenden Softwarekorrekturen (Ebene Subtraktion und line-by-line Korrekturalgorithmen) die AFM-Bilder zu entfernen beliebige Neigung und driften Effekte zu korrigieren. </li></ol> 4. Datenanalyse (30 min pro Bild) <ol><li> Export von Bildern in ImageJ (optional: Anwendung eines Skalierungsfaktors) preferentmathematisch eine verlustfreie Komprimierung Format, zB das TIFF - Format (siehe 3A). </li><li> Verwenden Sie das ImageJ Makro Toolset RiboPick.ijm (in der ImageJ Makro / Toolset Unterverzeichnis kopiert werden) an Ribosomen in Polysomen (siehe Abbildung 3B) und berechnen statistische Eigenschaften der Probe zählen (siehe Abbildung 3C). <ol><li> Starten Sie ein Bild Laden mit dem &lt;lesen image&gt; Werkzeug, das das Programm initialisiert. </li><li> Wählen Sie die Ribosomen-Zentren mit dem Standard ImageJ &lt;Punkt Auswahl&gt; Werkzeug (Shift + Linksklick ermöglicht die Multiselektion von Ribosomen). Markieren Sie die ausgewählten Ribosomen mit dem &lt;Mark Ribosomen&gt; Werkzeug. Ribosome Koordinaten werden in einem benutzerdefinierten Textfenster angezeigt. </li><li> Fügen Sie mehr Ribosomen an die gleiche Polysoms Wiederholung des Verfahrens an dem Punkt 4.2.2 angegeben. </li><li> Entfernen Sie falsch markierte Ribosomen mit der &lt;Undo letzte Pick&gt; Werkzeug (beginnt mit dem zuletzt hinzugefügten Ribosom zum ersten Entfernen212; im aktuellen Polysoms nur). </li><li> Wenn die Polysoms abgeschlossen ist, verwenden Sie die &lt;New Polysoms&gt; Werkzeug. Da die Polysomen-Nummer als Overlay zu dem Bild hinzugefügt wird, wird das Textfenster aktualisiert. </li><li> Mit &lt;Ergebnisse speichern und schließen&gt; das Ribosom-Koordinaten-Datei zu schreiben (die Standardeinheiten des Bildes verwendet werden) und ein PNG-Bild, das das aufgenommene Ribosomen und Polysomen zusammenfasst. Das Originalbild wird geschlossen, ohne gespeichert zu werden. </li></ol></li></ol>

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The authors have no competing financial interests in this paper and nothing to disclose.

Da die Struktur der DNA bewiesen wurde von größter Bedeutung sein, den Prozess der Transkription und die Organisation von Chromatin voran unser Verständnis der Transkriptionskontrolle der Genexpression zu beschreiben, ist es wichtig, die Organisation und Struktur der Polysomen zu analysieren, um die wahrheitsgemäße Verständnis zu verbessern der Übersetzung und deren Regulierung. Mit dem beschriebenen Protokoll wird eine optimale Dichte von Polysomen sanft auf eine flache Oberfläche immobilisiert, geeignet für die AFM-Bildgebung erhalten wird. Mit diesen Bedingungen mit gut vorbereiteten Proben, fast 50 Polysomen pro Stunde können für weitere Analysen und Charakterisierung erworben, bereit sein. Außerdem getrockneten Proben bei RT gelagert erwiesen für die Bildgebung nach mehr als einem Jahr geeignet ist. Um erfolgreich Polysoms Bilder mit unserem Protokoll erhalten, gibt es einige entscheidende Schritte: zu verwenden, Gewebe, die richtig schockgefroren unmittelbar nach DISSECTIO wurden und bei -80 ° C gelagert, um RNA-Abbau zu minimieren; die Lyse-Puffer mit Cycloheximid und RNase-Inhibitoren zu verwenden Ribosom Dissoziation von mRNA zu vermeiden; Alle Inkubationen auf Eis während der Probenabscheidung auf Glimmer auszuführen; und bei der Vorbereitung der Probe für die AFM-Bildgebung auf Luft, um ausgiebig die Probe auf dem Glimmer mit Puffern und RNase freiem Wasser in Gegenwart von Cycloheximid waschen. Der letzte Punkt ist besonders wichtig. Wenn das Bild auf glatten Oberflächen zu enthalten scheint ungefähr die richtige Höhe aber 100-1.000 nm breit, dies ein klarer Hinweis auf eine schlecht gewaschene Probe ist (oft Ribosomen / Polysomen noch als schwache, eingebettete Objekte beobachtet werden). Eine Methode, um dieses Problem zu lösen, ist das Waschverfahren zu wiederholen, aber dies in der Regel nicht das Problem auf eine bereits getrocknete Probe zu mildern. In diesem Fall ist es wert wieder mit einem neuen Aliquot beginnen. Aufgrund der Auflösung von AFM, ist diese Methode zur Untersuchung von Polysomen können die Struk nicht auflösenrellen Details der ribosomalen Schnittstellen in Polysomen. In der Tat ist AFM eine komplementäre und einfacheren Ansatz zu-EM Kryo, eine effektive und robuste Technik, was Tausende von Polysomen zu erwerben und zu analysieren und besser die gesamte Ribosom-Organisation in Polysomen verstehen. Wichtig ist , daß dieses Protokoll den einzigartigen Vorteil von 27 Fäden kompatibel mit RNA zu identifizieren. Das gleiche Verfahren kann für jede polysomaler Probe von einem beliebigen biologischen Gewebe oder Zelllinie erhalten wird, verwendet werden. Noch wichtiger ist es auch vor kurzem transcript spezifischen Informationen unter Verwendung der in vitro Translationssystemen zu erhalten, erfolgreich eingesetzt werden kann , wie durch 35 Lauria und Mitarbeiter demonstriert. Diese Methodik wird den Weg für mehrere Experimente, ebnen Verständnis der Kinetik der Polysoms Bildung oder Änderungen in Polysoms Organisation unter verschiedenen Zell- oder Gewebebedingungen zu gewinnen.

Die Synthese von Protein ist der energieverbrauchenden Prozess in Zellen 1,2. Daher ist es nicht verwunderlich , dass Protein Abundanzen vor allem auf der Translations gesteuert werden , anstatt Transkriptionsebene 3,4,5. Die Polysoms ist die grundlegende Komponente, die die hochmolekularen mRNA Information in funktionelle proteinöse Ablesungen umwandelt. Polysomen werden so weit als makromolekulare Komplexe erkannt , wo mehrere Translations Kontrollen 13.06 konvergieren. Trotz Hunderten von Studien über die Ribosomenstruktur 14- 16, die detaillierte molekulare Einblicke in die Dynamik der Übersetzung und die Topologie von Polysomen hat ein begrenztes Interesse gestoßen. Als Folge davon sind die Organisation des nativen polysomaler Ribonukleoproteinkomplex und seine möglichen Auswirkungen auf die Übersetzung noch ziemlich unklar Fragen. Polysomen kann noch unbekannt bestellt und funktionale Organisationen verbergen, potenziell Spiegelung was Nukleosomen und epigenetische controls haben für die Transkription Feld dargestellt. Tatsächlich erfordert die Untersuchung dieser faszinierenden Hypothese zusätzliche Studien und neue technische Ansätze. In dieser Zeile können zusammenarbeiten , um Strukturtechniken und Rasterkraftmikroskopie fruchtbarer neue Mechanismen entwirren für die Genexpression steuern, ähnlich zu dem, was für die Nukleosomen 17,18 erreicht. Seit der Entdeckung des Ribosoms 14-16 hat seine Struktur wurde in Prokaryoten 19,20, Hefe 21 und in jüngerer Zeit in der Human 22, die Bereitstellung der molekulare Beschreibung der Mechanismen an der Basis der Proteinsynthese umfassend charakterisiert. Polysomen wurden zunächst auf die Membran des endoplasmatischen Retikulums erkannt, typische 2D geometrische Organisationen 14 bilden. Wie bereits erwähnt, hat Polysoms Montage Gegenstand ständiger Interesse, wie die Ribosomenstruktur nicht gewesen. In der Vergangenheit Polysomen wurden im wesentlichen durch tr studiertansmission EM-basierte Techniken. Erst vor kurzem freigegeben Kryo-EM - Techniken , um die 3D - Rekonstruktion von gereinigtem Polysomen von in - vitro - Translationssysteme 23-26, menschliche Zellysaten 27 oder in den Zellen 28. Diese Techniken angeboten verfeinerte Information über das Ribosom-Ribosomen Organisation in Polysomen 23, 26-28 und eine vorläufige molekulare Beschreibung der Kontaktflächen benachbarter Ribosomen in Weizenkeim Polysomen 24. Somit ermöglicht Kryo-EM-Tomographie die Offenlegung von Ribosomen Ribosomen Wechselwirkungen mit molekularen Detail, aber es ist durch umfangreiche Nachbearbeitung belastet und Rekonstruktion Analysen, erfordern schwere Rechenressourcen für die Datenverarbeitung. Darüber hinaus wird die molekulare Detail von Ribosomen Ribosomen Wechselwirkungen, eine hochaufgelöste Karte des Ribosoms zu erhalten erforderlich, und diese Art von Referenz Ribosom ist nur für wenige Arten. Wichtig ist, dass Kryo-EM-Tomographie freie RNA nachzuweisen nicht in der Lage. d daherErz, werden neue Techniken benötigt, um vollständig die Organisation der Translationsmaschinerie zu verstehen. Neben Kryo-EM wurde AFM auch als ein nützliches Werkzeug für die direkte Abbildung von Polysomen in niederen Eukaryoten 29-33 und Menschen 27 eingesetzt. Im Vergleich zu EM, erfordert AFM keine Probe Fixierung oder Kennzeichnung. Darüber hinaus können Messungen in der Nähe von physiologischen Bedingungen durchgeführt werden und mit der einzigartigen Möglichkeit , beide Ribosomen und nackter RNA - Stränge 27 eindeutig zu identifizieren. Abbildung einzelner Polysomen kann relativ schnell durchgeführt werden, Tausende von Bildern auf der nano-Auflösung mit wenig Nachbearbeitung Aufwand im Vergleich zu der umfangreichen und schweren Nachbearbeitung Erhalt und Wiederaufbau Analysen durch Kryo-EM-Mikroskopie erforderlich. Folglich stellt AFM Datenverarbeitung und Analyse nicht teuer Workstations benötigen und eine hohe Rechenleistung. Als solches sammelt sich diese Technik Informationen über polysomaler Formen, morphologischen Eigenschaften (wieHöhe, Länge und Breite), Ribosom Dichten, das Vorhandensein von freien RNA und die Anzahl der Ribosomen pro Polysomen 27 mit einem höheren Durchsatz als Kryo-EM. In einer solchen Weise stellt AFM eine leistungsfähige und komplementären Ansatz Techniken zur EM Polysomen zu porträtieren 27. Hier präsentieren wir eine komplette Pipeline von der Reinigung bis zur Datenanalyse in dem AFM Bild angewendet wird und Mausgehirn Polysomen analysieren. Das vorgeschlagene Protokoll konzentriert sich auf die Reinigung Fragen und auf die genaue Ablagerung von Polysomen auf Glimmersubstraten, die für AFM-Bildgebung verwendet werden. Zusätzlich zu den herkömmlichen Partikelanalyse , die leicht mit gängigen Software ausgeführt werden können , von der AFM - Gemeinschaft verwendet wird , ein ImageJ 34 - Plugin, genannt RiboPick wird zum Zählen der Anzahl von Ribosomen pro Polysoms 27 präsentiert, 35.

<table><tbody><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>01810</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>DNAseI</td><td>Thermo Scientific</td><td>89836</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>RiboLock RNAse Inhibitor</td><td>Life technologies</td><td>EO-0381</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>40718</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8532</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Microcentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S5016</td><td>Sucrose gradient preparation</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima LE-80K</td><td>Sucrose gradient centrifugation</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW 41 Ti</td><td>Sucrose gradient centrifugation</td></tr><tr><td>Polyallomer tube</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td>Sucrose gradient centrifugation</td></tr><tr><td>Density Gradient Fractionation System&amp;nbsp;</td><td>Teledyne Isco</td><td>67-9000-176</td><td>Sucrose gradient fractionation</td></tr><tr><td>AFM</td><td>Asylum Research</td><td>Cypher</td><td>Polysome visualization</td></tr></tbody></table>

peering at brain polysomes with atomic force microscopy

Die Translationsmaschinerie, dh die Polysoms oder Polyribosom, ist eines der größten und komplexesten Cytoplasma - Maschinen in den Zellen. Polysomen, von Ribosomen gebildet, mRNAs, mehrere Proteine ​​und nicht-kodierenden RNAs repräsentieren Plattformen integriert die translationale Kontrollen stattfinden. Während jedoch das Ribosom wurde weitgehend untersucht, die Organisation von Polysomen noch fehlt umfassendes Verständnis. So viel Aufwand ist erforderlich, um Polysoms Organisation und jede neuen Mechanismus der Translationskontrolle aufzuklären, die eingebettet werden können. Rasterkraftmikroskopie (AFM) ist eine Art von Rastersondenmikroskopie, welche die Erfassung von 3D-Bildern in nanoskaliger Auflösung ermöglicht. Im Vergleich zu der Elektronenmikroskopie (EM) Techniken, einer der wichtigsten Vorteile von AFM ist, dass es Tausende von Bildern sowohl in der Luft als auch in Lösung zu erwerben, so dass die Probe aufrecht erhalten werden unter nahezu physiologischen Bedingungen, ohne dass für die Färbung und Fixierung Proverfahren. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die genaue Reinigung von Polysomen aus Gehirn der Maus und ihre Abscheidung auf Glimmersubstraten beschrieben. Dieses Protokoll ermöglicht Polysomen-Bildgebung in Luft und Flüssigkeit mit AFM und deren Rekonstruktion dreidimensionaler Objekte. Ergänzend zur Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) kann das vorgeschlagene Verfahren günstig für die systematische Analyse Polysomen verwendet werden, und ihre Organisation zu studieren.

Saccharosegradienten polysomaler Profilierung der gesamten Gehirn der Maus Es ist möglich, Polysomen aus einem zellulären Lysat durch polysomaler Profilierung zu reinigen, die Makromoleküle entsprechend ihrem Gewicht und Größe trennt. Mit polysomaler Profilierung zytoplasmatischen Lysate aus kultivierten Zellen oder Geweben erhalten werden, wie in diesem Beispiel, werden auf einem linearen Sucrose-Gradienten geladen und verarbeitet durch Ultrazentrifugation freie RNA von 40S und 60S-Untereinheiten 80S Ribosomen und Polysomen entsprechend ihrer Sedimentationskoeffizienten zu trennen ( Abbildung 1 oben). Die Extinktion der Probe bei 254 nm und die Fraktionssammlung ermöglichen die Isolierung der Saccharose angereicherte Fraktion in Ribosomen oder Polysomen mit unterschiedlicher Anzahl von Ribosomen pro Transkript. Die Fraktionen können bei -80 ° C (Abbildung 1 gesammelt, aliquotiert für AFM - Bildgebung und gespeichert werdenunteres Bild). Einheimische Polysomen aus Mäusehirn von AFM in Luft beobachtet offenbaren engen Ribosom Wechselwirkungen Die Bildaufnahme erfolgt AC-Modus (auch als Tapping-Modus bekannt). Diese Modalität ist besonders geeignet zum Abbilden weichen Proben (wie die Polysomen), weil die Spitzen-Proben-Wechselwirkung und die entsprechenden Scherkräfte stark reduziert werden. Auf diese Weise wird sowohl der Spitze und der Probe werden erhalten. AFM-Bildgebung ermöglicht die Übernahme von Daten mit hoher Auflösung, mit genauen Werten, die, wie die Messbedingungen von verschiedenen Faktoren abhängen, die Art der Spitze, und die Eigenschaften der Probe. Bei den in diesem Dokument beschriebenen Bedingungen eine laterale Auflösung von etwa 4-6 nm und eine vertikale Auflösung von 0,1-0,2 nm erreichbar sind. Nach der Abscheidung von Saccharose Aliquots von Glimmer, liefert AFM Beschreibungen einzelner Polysomen dasserscheinen als Cluster von dicht gepackten Ribosomen (2A, C und C). Durch Querschnittsanalyse (2D) ist die Höhe der ribosomalen Peaks etwa 14 nm nach dem , was früher für menschliche Ribosomen in Polysomen nach dem Lufttrocknen 27 beobachtet wurde. Der Mittenabstand von der Linienprofil identifiziert Ribosomen ist 23 nm, die mit der Dimension von Ribosomen in Lösung 37 in Übereinstimmung ist, 38. Die Anzahl der Ribosomen pro Polysomen aus einer einzigen Fraktion zeigt eine monodisperse Verteilung 3A meldet einen typischen AFM Bild erhalten , indem eine Probe aus einer Fraktion des Sucrose - Gradienten auf Glimmer absorbiert erwerben. Der Einschub zeigt einen digitalen Zoom eines einzelnen Polysoms, mit einem Vergrößerungsfaktor geeignet für die Identifizierung von ribosomes im Polysoms. Panel B zeigt das gleiche Bild nach dem Ribosom Identifikation mit dem RiboPick Makro. Rote Kreise (siehe kleines Bild) markieren die Ribosomen und eine fortlaufende Nummer (Cyan) verwendet wird, der Verband des Ribosoms zu helfen, mit einem bestimmten Polysoms koordiniert. Die Häufigkeitsverteilung der Anzahl der Ribosomen pro Polysoms wurde Fraktion # 10 (siehe Abbildung 1 , untere Platte, entsprechend mittleren Molekulargewicht Polysomen (MMW)) analysiert, was eindeutig zeigt einen einzelnen Peak (Tafel C, graue Balken). Die experimentelle Verteilung wurde mit einer Gauß-Kurve (schwarze Linie) ausgestattet, die bei 5,8 Ribosomen / Polysomen, mit einer Standardabweichung von 1,3 Ribosomen / Polysomen zentriert wurde. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53851/53851fig1.jpg" /> Abbildung 1. Repräsentative Absorptionsprofil für Saccharosegradienten Sedimentation von ganzen Gehirn der Maus. (Obere panel) Ein polysomaler zytoplasmatischen Lysat wurde von P27 Gehirn der Maus und auf eine lineare Sucrosegradienten (15-50% Saccharose [w / v]) erhalten. Es ist möglich, klare Spitzen zu beobachten, um die Absorption bei 254 nm von RiboNucleoParticles (RNP), ribosomalen Untereinheiten entsprechen (40S und 60S), Ribosomen (80S) und Polysomen. Zur Wiederholtes Einfrieren zu vermeiden und Auftau - Zyklen der Proben vor der AFM - Abscheidung auf Glimmer, ist es zweckmäßig , in Aliquote aufgeteilt beide Ribosomenfraktion und polysomaler Fraktionen (unteres Bild) mit einer unterschiedlichen Anzahl von Ribosomen pro Transkript (dh niedriger, mittlerer und hoher -Molekular-weight Polysomen (LMW, MMW und HMW, beziehungsweise)). Die Aliquots können so lange wie zwei Jahre bei -80 ° C gelagert werden. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53851/53851fig2.jpg" /> Abbildung 2. Bilder von Gehirn Polysomen durch Tapping-Modus Rasterkraftmikroskopie. (A) Beispiel für AFM - Bild von MMW Gehirn Polysomes nach der Absorption von Glimmer mit einer linearen grauen Farbskala verwenden. (B) Das gleiche Bild in (A) gezeigt , dargestellt für die Farbskala eine andere Z-Bereiche mit: 0-0,5 nm grau für den Hintergrund, 0,5-2 nm und 2-10 nm gelb für Ribosomen. In diesem Fall ist eine bessere visuelle Kontrast für niedrige und hohe Z-Bereich Objekte erhalten. (C) Vergrößerung eines typischen MMW Polysoms mit Querschnittsprofil (gestrichelte weiße Linie). (D) Höhenprofil von zwei definierten Ribosomen durch Querschnittsprofil in (C) zeigt Ribosomenhöhe von 14 nm. Dieser Wert ist kompatibel mit dem, was für die menschliche Ribosomen in Polysomen 27 in AFM zuvor beobachtet. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53851/53851fig3.jpg" /> Abbildung 3. Beispiel die Anzahl der Ribosomen pro Polysoms in MMW Gehirn Polysomen zu zählen. (A) AFM - Bild , das REPRESENTS den Eingang des ImageJ Makro, RiboPick. (B) Nach dem manuellen jeweils Ribosomen pro Polysoms, RiboPick Markierungen im Bild Kommissionierung wird die Position jedes Ribosom (rote Kreise). (C) Die erhaltene Anzahl der Ribosomen pro Polysomen kann als Verteilung dargestellt werden , die mit einem Gauß - Kurve eingepasst werden kann. Die Anzahl der Polysomen in diesem Beispiel als 164 ist, von 9 unabhängigen Bilder erhalten. Der Beschlag mit der Gauß - Kurve gibt den Mittelwert der Population von Polysomen in der MMW - Fraktion (# Ribosomen / Polysomen 5,8 ± 1,3, R 2 = 0,99). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Puffer </td><td> Zusammensetzung </td><td> Anwendung </td></tr><tr><td> Lysis Buffer </td><td> 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 </td><td> Herstellung des Lysats (1.1) </td></tr><tr><td></td><td> 10 mM NaCl </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10 mM MgCl 2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1% Triton-X100 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1% Na-Desoxycholat </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 0,4 U / ml RNase-Inhibitor </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1 mM DTT </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mg / ml Cycloheximid </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5 U / ml DNase I </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50% Sucroselösung </td><td> 50% (w / v) Saccharose in </td><td> Sucrosegradienten Präparation (1.2) </td></tr><tr><td></td><td> 100 mM NaCl </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10 mM MgCl 2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10 mM Tris / HCl pH 7,5 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> 15% Sucroselösung </td><td> 15% (w / v) Saccharose in </td><td> Sucrosegradienten Präparation (1.2) </td></tr><tr><td></td><td> 100 mM NaCl </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10 mM MgCl 2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10 mM Tris / HCl pH 7,5 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> nickel~~POS=TRUNC </td><td> 1 mM NiSO 4 </td><td> Probenvorbereitung für die AFM (2) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Buffer-AFM </td><td> 100 mM NaCl </td><td> Probenvorbereitung für die AFM (2) </td></tr><tr><td></td><td> 10 mM MgCl 2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 100 &amp; mgr; g / ml Cycloheximid </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10 mM Hepes </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="2"> 3% (w / v) Saccharose, pH = 7,4 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Waschlösung </td><td> DEPC-Wasser </td><td> Probenvorbereitung für die AFM (2) </td></tr><tr><td></td><td> 100 &amp; mgr; g / ml Cycloheximid </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Puffer.

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Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

Peering am Gehirn Polysomen mit Rasterkraftmikroskopie

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

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Universidad San Sebastian

Research

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Neuroscience

8.3K Aufrufe.  Fondazione Bruno Kessler. While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid. 

Serie: Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

Visualisierung von rekombinanten DNA-und Protein-Komplexe mit Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Forschung

Biotechnik

Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be measured to ~10 pN by a laser and sectored detector, which can be converted to image topography. Amplitude modulation or &#8220;tapping mode&#8221; AFM involves the probe making intermittent contact with the surface while oscillating at its resonant frequency to produce an image. Used in conjunction with a fluid cell, tapping-mode AFM enables the imaging of biological macromolecules such as proteins in physiologically relevant conditions. Tapping-mode AFM requires manual tuning of the probe and frequent adjustments of a multitude of scanning parameters which can be challenging for inexperienced users. To obtain high-quality images, these adjustments are the most time consuming.
PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) produces an image by measuring a force response curve for every point of contact with the sample. With ScanAsyst software, PF-QNM can be automated. This software adjusts the set-point, drive frequency, scan rate, gains, and other important scanning parameters automatically for a given sample. Not only does this process protect both fragile probes and samples, it significantly reduces the time required to obtain high resolution images. PF-QNM is compatible for AFM imaging in fluid; therefore, it has extensive application for imaging biologically relevant materials.
The method presented in this paper describes the application of PF-QNM to obtain images of a bacterial red-light photoreceptor, RpBphP3 (P3), from photosynthetic R. palustris in its light-adapted state. Using this method, individual protein dimers of P3 and aggregates of dimers have been observed on a mica surface in the presence of an imaging buffer. With appropriate adjustments to surface and/or solution concentration, this method may be generally applied to other biologically relevant macromolecules and soft materials.

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

Atomic Force Microscopy von Red-Light Photorezeptoren Mit Peakforce Quantitative Nanomechanische Eigenschaftenzuordnung

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

Ingenieurwesen

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

Kraft-Spektroskopie einzelner Proteinmoleküle, die mit einem Rasterkraftmikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Biochemie

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user's specific system.

We present a method for achieving sub-nanometer resolution images with amplitude-modulation (tapping mode) atomic force microscopy in liquid. The method is demonstrated on commercial atomic force microscopes. We explain the rationale behind our choices of parameters and suggest strategies for resolution optimization.

Sub-Nanometer Auflösung Belichtung mit Amplituden-Modulation der Rasterkraftmikroskopie in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription to take place in eukaryotic cells. The dynamics of nucleosomes provides access to the DNA by replication and transcription machineries, and critically contributes to the molecular mechanisms underlying chromatin functions. Single-molecule studies such as atomic force microscopy (AFM) imaging have contributed significantly to our current understanding of the role of nucleosome structure and dynamics. The current protocol describes the steps enabling high-resolution AFM imaging techniques to study the structural and dynamic properties of nucleosomes. The protocol is illustrated by AFM data obtained for the centromere nucleosomes in which H3 histone is replaced with its counterpart centromere protein A (CENP-A). The protocol starts with the assembly of mono-nucleosomes using a continuous dilution method. The preparation of the mica substrate functionalized with aminopropyl silatrane (APS-mica) that is used for the nucleosome imaging is critical for the AFM visualization of nucleosomes described and the procedure to prepare the substrate is provided. Nucleosomes deposited on the APS-mica surface are first imaged using static AFM, which captures a snapshot of the nucleosome population. From analyses of these images, such parameters as the size of DNA wrapped around the nucleosomes can be measured and this process is also detailed. The time-lapse AFM imaging procedure in the liquid is described for the high-speed time-lapse AFM that can capture several frames of nucleosome dynamics per second. Finally, the analysis of nucleosome dynamics enabling the quantitative characterization of the dynamic processes is described and illustrated.

Here, we present a protocol to characterize nucleosome particles at the single-molecule level using static and time-lapse atomic force microscopy (AFM) imaging techniques. The surface functionalization method described allows for the capture of the structure and dynamics of nucleosomes in high-resolution at the nanoscale.

Erforschung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen mit Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Automatisierung von Bio-Rasterkraftmikroskop-Messungen an Hunderten von C. albicans-Zellen

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Static Atomic Force Microscopy to Visualize and Characterize Assembled Nucleosomes

Source: Stormberg, T., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58820">Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging.</a> J. Vis. Exp.(2019)
In this video, we demonstrate static atomic force microscopy to visualize assembled nucleosomes. This high-resolution imaging technique allows the study of the nucleosome structure.

Statische Rasterkraftmikroskopie zur Visualisierung und Charakterisierung von zusammengesetzten Nukleosomen

Source: Stormberg, T., et al. Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging. J. Vis. Exp.(2019)
In this video, ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Microscopy Techniques

Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that can analyze topographic details of various specimens like ceramics, glass, polymers, and biological samples. AFM offers over 1000 times more resolution than the optical imaging system. Images generated from AFM are three-dimensional surface profiles, offering an advantage over the flat, two-dimensional images from other imaging techniques.
The AFM Probe
The probe is regarded as the heart of any AFM setup and comprises the cantilever and tip assembly. Probes are the most commonly replaced part on this type of microscope because&#160; the constant interaction with the samples wears down the tip. Therefore, the choice of material for the probe depends on the properties of the sample. Silicon probes, used to analyze hard samples, are stiffer and sharper than silicon nitride probes, which are better suited to scan softer samples. These sharp tips are produced using electrochemical etching or carbon nanotubes for higher accuracy analysis.
Imaging Modes of AFM
In AFM, surface topography is studied using the interaction between the probe tip and the sample surface. There are two main imaging modes &#8212; a static mode, also referred to as the contact mode, and a dynamic mode.
In the static or contact mode, the tip of the probe is in continuous contact with the sample surface. As the tip drags over the surface, repulsive forces between the sample and the tip result in the cantilever bending, which is recorded. The entire specimen surface is scanned back and forth in both x- and y-axes, called raster scanning, while the vertical movement of the cantilever records the z-axis, thus generating a 3D image.
In the dynamic mode, the probe oscillates just above the sample surface, coming close to, but not touching the surface. Attractive and repulsive forces determine the variation in distance between the tip and the sample, affecting the amplitude of cantilever oscillation. This feedback is recorded to construct the surface topography of the sample.

Rasterkraftmikroskopie

Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that can analyze topographic details of various specimens like ceramics, glass, ...