NSF-MRIプログラム（CHE：1229103）新しい制御電子機器、ソフトウェア、液体セル、およびデュアルAFM / STMを組み立てるために必要な他の機器の購入資金を提供するために認められている。私たちは、AFM計測機器、トレーニング、およびイメージングの支援のためにシカゴ大学のNSF-MRSECプログラム（DMR-0820054）で共用設備を認識し、機器の時間のための材料研究施設ネットワーク（DMR-0820054）によって使用可能になった。私たちは、特に私たちのキャンパスに必要な器具類をもたらしたNSF-MRI提案の資金調達の前に生徒たちを歓迎するために博士Qiti郭博士ジャスティンJureller、教授のKa·イー·リーに感謝します。学生や教職員だけでなく、消耗品のためのサポートのための夏の研究奨学金を提供したノースイースタンイリノイ大学に授与：私たちは、タイトルIII STEM補助金（P031C110157 ID）から資金提供を認める。最後に、継続的なインストゥルメンタルサポートのためにとrに許可をブルカー·ナノ·インクを認めるPeakForce QNMのメカニズムを示すプロットをeproduceと自動化されたソフトウェアを記述するために単語ScanAsystを使用する。

1コンピュータおよび顕微鏡のセットアップ<ol><li> N 2気筒のバルブを開き、エアテーブルはフローティングとレベルされていることを確認するためにノブを調整します。 </li><li>このために、コンピュータ、コントローラ、および光ファイバーライトをオンにします。 </li><li> AFM / LFMモードにスキャナを設定し、AFMの頭の上にカメラを中心に。 </li><li>オープンソフトウェア。実験の下で、実験グループの下に実験カテゴリ「ナノメカニカルプロパティ」、「定量的ナノメカニカルマッピング」を選択し、「流体中PeakForce QNM」。負荷実験と[設定]をクリックします。 </li><li>ステージの表面を見るために、Z対物レンズを用いて、カメラをフォーカスします。ピエゾを粗いアップ/ダウン使用すると、約1mmのAFMヘッド開口部の表面の下にステージを移動します。 </li></ol>雲母表面の調製<ol><li>きれいなサンプル支持ディスク（直径15mm、厚さ0.8mm）の表面上に接着剤のステッカーを押します。マイカV-4を押してください接着剤へのグレードのディスク（25×25×26ミリメートル）がしっかりと取り付けまで。 </li><li>それは完全に無に気泡が付着しているの確保マイカ上に透明なテープ片をこする。均等に切断するように一方の側からマイカオフテープを引き出します。雲母が平らであることを保証するために、必要に応じて繰り返します。 </li><li>グリップ支持ディスク、円形ピンセット（ディスクグリッパー）一対のクリーンアップマイカ側、およびスキャナの上に置きます。マイカは、AFMヘッド開口のレベル以下である必要があります。 </li></ol>雲母表面の3流体セル組立·イメージング<ol><li>流体セル、O-リング、シリンジアダプタ、ホースアダプター、および100％エタノールにおける吐出ホースをすすぐ。 DI水中で流体セルをすすぐ。すべての部分が空気を完全に乾燥させます。 </li><li>きれいな流体セルのポートにホースアダプターを押し込みます。静かに平らな頭ピンセットを用いて流体セルの中心くぼみにOリングを押してください。 </li><li>プローブ保持クリップを軽く春を押して、GROOVから離れてそれを回す先端の電子。 </li><li>フラット頭ピンセットでアウェイチップからの長い先端に探針をつかみ。セルの中心に面した先端の溝にプローブを配置します。春を押して（ 図1B）、それを確保するために、プローブを介して保持クリップを調整します。 </li><li>それは完全に（ 図1C）に後退されていることを確認するために、AFMのクランプを確認してください。 </li><li>流体セル、Oリングを置き、マイカサンプルの上に、下に向けてプローブ。流体セルは、AFMのスタッド上に休息できるようにします。ステージ上で流体セルを安定させるためにクランプを下げます。目視検査がしっかりと支持円板と流体セルとの間で圧縮Oリングを示すまで、顕微鏡でのダウンスイッチを押します。 </li><li>モニターを見ながら、画面上の流体セルの上部を可視化するための粗調整ノブを当てる。 </li><li> X / Y調整ノブとZ対物レンズを用いて先端の鮮明な画像があるまで顕微鏡を移動します。先端はAPPますメタリック、黄金の三角形のような耳。顕微鏡でのダウンピエゾレバーを使用して試料表面に近い先端を移動します。先端の反射に焦点を当てています。その反射の関係で実際のカンチレバーのないことを確認してください。この段階では、それらが密接に合致するが、完全にオーバーラップしないべきである。 </li><li>無菌1mlシリンジにシリンジアダプタを取り付けます。シリンジアダプタに噴射ホースの一端を取り付け、緩衝液容器内のホースのもう一方の端を置きます。完全にシリンジのプランジャーを拡張します。 </li><li>流体セル上のホースアダプターにホースを取り付けます。流体が完全に中央チャンバーを満たすまで、慎重プランジャーを押してください。気泡が存在しない保証するためにセルをチェックします。顕微鏡上に流体セルからこぼれる流体が存在しないか確認してください。隆起した固体支持体上に注射器を置きます。 </li><li>画面上のレーザー（拡散赤い点）を見つけるために、カメラフィード、X / Yは、翻訳のノブを使用してください。レーザーMOVEMの使い方ENTコントロールノブは、先端にレーザーを移動します。 </li><li>顕微鏡上に表示される和信号が最大になるまで細かく（ - 6値= 4）、レーザーとミラーを調整します。 </li><li> （±0.1）を限りなくゼロに近づけて顕微鏡に表示されて垂直方向と水平方向の偏向を低下させるために左後方側のノブやスキャンヘッドの左上側を使用して象限ダイオードの角度を調整します。 </li><li>ソフトウェアでは、取得のオプションを選択します。最低でも、選択の高さ（トレースとリトレース）、ピーク力誤差、および変形。他のオプションはユーザ依存し、実験者が所望する特定の情報に基づいて調整することができる。 </li><li>各取得ウィンドウにおけるRT飛行機フィットのための「行」を選択します。高さの窓でのOT飛行機フィットのための &quot;none&quot;を選択します。まだ行っていない場合は、ゼロにXとYオフセットと走査角度を設定します。 </li><li> 1ヘルツ、256行あたりのサンプル、ScanAsyst自動制御にスキャンレートを設定してください個人、そしてオフにScanAsystオートZ限界に。 500nmのZ制限を変更します。 1μmのスキャンサイズを設定します。 </li><li>従事クリックしてください。この時点で、先端が表面に近づく。先端が近づいている間に、画面の左下隅にZピエゾ電圧変化を観察する。先端が範囲外になった場合、チップと再アプローチを撤回。これが失敗した場合、先端が成功したアプローチを有するために変更する必要があります。先端が係合されると、ラインがイメージを構成します取得の各ウィンドウに表示されるように開始します。 </li><li> 1×1μmとマイカの画像を取り、雲母表面がきれいで平らであることを保証するために、ゆっくりと拡大表示します。が表示されたら、画像を保存するための連続キャプチャをクリックします。ズームインし、必要に応じて表面を動き回る。 </li></ol> 4。タンパク質の沈着とイメージングのための試料の調製<ol><li>精製されたタンパク質試料38を入手し、氷上に保つ。冷凍庫で保存する場合は、上のサンプルを解凍する5分間氷。 </li><li>冷蔵イメージング緩衝液を用いて溶解0.0010ミリグラム/にタンパク質を希釈する。ここで使用される画像バッファは15 mMトリス塩酸（pH = 8.0）、150mMのNaCl、および15mMのMgCl 2である。 </li><li>冷蔵イメージング緩衝液で4室（100×15 mm）のペトリ皿を埋める。溶液の少なくとも5mlで各チャンバーを埋める。静かにピペットに取り付けられた先端を希釈したタンパク質溶液を混合する。 </li><li>すでに準備雲母の表面に希釈したタンパク質溶液200μlを適用します。 30秒後に、円形ピンセット（ディスクグリッパー）を有するタンパク質/雲母表面を拾う。実験台にサンプルを平行に保持します。 </li><li>試料を保持しながら、直ちに試料をペトリ皿の流域に平行であることを保証しながらペトリ皿（ ステップ4.2）の第一象限に含まれる緩衝液中に試料を浸す。 1秒後、サンプルを削除します。 </li><li>流域にサンプルと平行に保持するために継続ペトリ皿の、残りの3つの象限のためのステップ4.5を繰り返します。 </li><li>余分な水分を吸収し、顕微鏡のステージ上にディスクを転送するために乾いたほこりのない布でディスクを置きます。布で実際の表面に触れないでください。サンプルを乾燥させないようにしてください。 </li><li> 3.16 -を繰り返して、3.6を繰り返します 。 </li></ol>マイカ上の5。イメージングタンパク質<ol><li>画面の左側にあるチェック·パラメータ·ボックスをクリックしてください。ばねの大きさと先端半径は、使用されているチップに基づいて設定されるべきである。 </li><li>従事クリックしてください。同様にマイカ撮像処理（ ステップ3.17）に、先端的なアプローチとしてのzピエゾウィンドウを観察します。 </li><li>イメージスキャナの少なくとも2つの連続パスのための同じ領域を許可します。収集された各画像を保存するための連続キャプチャをクリックします。 </li><li>新しい領域にスキャナを移動、および/または必要に応じて画像サイズを変更します。 </li><li>自動化されたソフトウェアは、調整が終了した後特定の画像サイズのスキャンパラメータは、ソフトウェアをオフにします。 </li><li>手動で微調整するために画像の焦点を走査速度、zは限界、行数、および電圧を調整する。画像の焦点が合って遠くなった場合は、元の開始位置を返すように背面のソフトウェアをオンにします。タンパク質上で拡大しながら画像の解像度を高めるために、走査速度を減少させ、比例ラインの数を増やす。 </li><li>実験後、100％エタノールによる液細胞をきれいにし、DI H 2 Oですすぎ液体セルが完全に乾燥することができます。 </li><li>生データ画像を処理するためのデータ·ソフトウェアを開きます。まず、平坦化アイコンをクリックして画像を平坦。ゼロ番目の順序を選択して実行]をクリックします。画像によっては、平面適合は適切に平坦な画像を得ることが必要であり得る。この場合、平面フィットアイコンを選択し、カーソルを使用して、画像の平坦な領域の平面を描く。実行]をクリックします。必要に応じて繰り返し</li><li> SELタンパク質の寸法を測定するための電気ショック療法の断面]タブをクリックします。カーソルで線を引く、分析する分子または領域の上に移動します。複数のエリアについて、この手順を繰り返し、ソフトウェアがオーバーレイを生成します。画像やその他のソフトウェアおよび描画プログラムに互換性のある形式で画像を生成するために使用されるデータをエクスポートします。 </li></ol>

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U S A. 107, 9170-9175 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pymol+Molecular+Graphic+System+v.1.5.0.1.">The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1.</a> , .</li><li>Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=structure+of+the+chromophore+binding+domain+of+an+unusual+bacteriophytochrome,+RpBphP3,+reveals+residues+that+modulate+photoconversion.">structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).</li><li>Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+Pseudomonas+aeruginosa+bacteriophytochrome:+photoconversion+and+signal+transduction.">Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).</li><li>Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+X-ray+Crystallographic+and+Structural+Analyses+of+a+Bacteriophytochrome+from+Stigmatella+aurantiaca.">Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca.</a> The FASEB Journal. 25, 928 (2011).</li><li>Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+structure+of+Deinococcus+bacteriophytochrome+yields+new+insights+into+phytochrome+architecture+and+evolution.">High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution.</a> J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).</li><li>Wagner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+Deinococcus+radiodurans+bacteriophytochrome+reveals+key+amino+acids+necessary+for+the+photochromicity+and+proton+exchange+cycle+of+phytochromes.">Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes.</a> J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).</li></ol>

There are no competing financial interests or conflicts of interest.

AFMは、生理学的に関連する条件下でタンパク質および他の生物学的巨大分子を画像化する十分な能力、走査型プローブ顕微鏡法である。 X線結晶学およびNMRと比較して、AFMの一つの制限は、同じ解像度、特に横方向の解像度を達成することができないことである。任意の表面上の分子を分析するためにAFMを使用する場合、データが分析されるとき、分子の画像上表面とプローブの影響も考慮?...

原子間力顕微鏡（AFM）は、1986年の発明（ 図1）ので、表面、薄膜、単分子の構造的および機械的特性を調査するために非常に重要なツールとなっている。1-3液晶セルを使用して、方法が有している生体高分子の研究や生理学的に関連する環境下であっても、生きている細胞で特に有効になる。非接触モードAFMによる一般的に不適切であることから4-10タッピングモードAFMは、伝統的に、表面に軟質材料または緩く結合した分子を画像化するために使用されている横方向の力による被害にカンチレバーことにより、試料に加わる。11タッピング·モードAFMは、実質的に先端が断続的に表面に触れたのではなく、一定の接触することによってこれらの力を低減します。このモードでは、カンチレバーが表面に垂直なその共振周波数で又はその付近で振動される。同様に、AFMモードに連絡することを、トポグラフィーは肛門ですのxy（距離）の関数としてのzピエゾの動きをプロットすることによってyzed。 カンチレバーダイナミクスは時や共振の近くで非常に不安定になることができます。従って、それらは、「定常状態」状況の外側を自動化することは非常に挑戦的である。具体的には、これらのダイナミクスは、サンプルの特性および走査環境の両方に依存します。 （より）硬い表面に吸着柔らかい分子の場合、分子に適切にチューニングされたフィードバック·ループは、表面のための帰還発振につながる可能性があります。さらに流体中の動作は、カンチレバーのチューニングが複雑になる。温度の変化又は流体レベルが一定の設定点の再調整、ゲイン、および他の撮像パラメータを必要とする。これらの調整は非常に時間がかかり、ユーザにとって困難である傾向がある。 ピークフォース定量的ナノメカニカルプロパティのマッピング（PF-QNM）は、タッピングモードAFMのように、断続的にサンプル（ 図2）と接触させることにより横方向の相互作用を避けることができます。12-15 &lt;/ SUP&gt;しかし、PF-QNMは、非共振モードとタッピングモードAFMよりもはるかに低い周波数で動作します。これは、タッピングモードAFM、流体の存在によって悪化特にチューニングの課題を排除します。 PF-QNMで、画像は、接点の全ての点において力応答曲線を取ることによって収集される。 ScanAsystソフトウェアの追加により、スキャンパラメータの15調整が自動化することができ、高解像度の画像であっても、経験の浅いユーザーがほんの数分で得られる。ユーザはAFM​​に慣れになると、自動化されたパラメータのいずれかまたは全てが、画像品質を手動で微調整するために実験者を許可し、いつでも無効にすることができる。創業以来、PF-QNMは。分子下レベルでのバクテリオロドプシン、膜タンパク質、および他の天然タンパク質をマッピングするために適用されたバクテリオロドプシンのために16-18、タンパク質の柔軟性とX線結晶構造の間の直接的な相関関係があります。12 PF -qnMは、高解像度の生細胞を研究するために利用されている。19,20さらに、PF-QNMデータは、細胞の整合性と機能に重要である赤血球膜内の構造と力学の間の重要な接続を明らかにしています。21 私たちは、22 bacteriophytochromes（BphPs）と呼ばれる赤色光の光受容体の構造を調べるためにAFM、23を含む、走査型プローブ顕微鏡（SPM）の方法を使用している。24,25彼らが共有シグナリングエフェクターモジュールなどにに連結された光検出モジュールから構成されヒスチジンキナーゼ（HK）として。26光センシングモジュールは、一般的に構造変化のシグナル伝達エフェクターモジュールに達し、全体のタンパク質の全体的な変革につながる一連の光子を吸収すると構造変化を受け、ビリン発色団が含まれていますこの変換に基づく24,27-29、二つの異なる光吸収のあるBphPs、赤と遠赤色光吸収状態のtatesは、​​Pr及びPfrのと表記。 PrはほとんどBphPsため、熱的に安定な、暗順応状態である。のPr /のPfR光変換の分子基盤は完全に起因するこれらのタンパク質の限定された構造の知識に理解されていない28。 Dから一つの構造を除いてデュランスは 、これらのタンパク質の30すべての公開X線結晶構造は、暗順応状態にあり、エフェクタードメインを欠いている。無傷BphPs効果的核磁気共鳴（NMR）によって研究することが大きすぎると、X線結晶学のために（特に、明順応状態で）、その完全な形で結晶化することが困難なことで有名である。 BphPsは最近、赤外蛍光タンパク質マーカー（IFPの）ように操作されている。これらのタンパク質の31構造解析が有効IFP設計で支援を促進することができます。32-36 この記事の焦点は、手順を提示することであるPF-QNMを介して液体セルAFMを用いBphPsの撮影。この方法は、光合成細菌RからbacteriophytochromeのRpBphP3（P3）の明順応状態の研究によって証明されるオオウズラタケ 。ここに提示AFM手順は、タンパク質の画像化のための便利で簡単な方法、ならびに他の生物学的巨大分子である。この方法では、個別の分子の構造の詳細は、上位理系実験セッションのような短時間で収集することができる。断面積を測定し、さらに次元解析を完了を通して、実験データは、有用な計算モデルと比較することができる。37-42

<table><tbody><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4997-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Acros Organics</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Acros Organics</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Multimode 8 AFM</td><td>Bruker-Nano</td><td>492-008-011</td><td>equipped with Nanoscope V controller and J scanner</td></tr><tr><td>Probe</td><td>Bruker-Nano</td><td>SNL-10, ScanAsyst-Fluid+</td><td></td></tr><tr><td>Tapping Mode Fluid Cell</td><td>Bruker-Nano</td><td>MTFML</td><td></td></tr><tr><td>Mica V-4 Grade</td><td>SPI supplies</td><td>1150503</td><td>25 x 25 x .26 mm</td></tr><tr><td>Sample support disk</td><td>nanoSurf</td><td>BT02236</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Plasta-Medic, Inc.</td><td></td><td>100 mm x 15 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>micropipettors</td><td>Denville Scientific</td><td>XL 3000i</td><td></td></tr><tr><td>RpBphP3</td><td></td><td></td><td>Prepared according to cited references</td></tr><tr><td>Nanoscope software</td><td>Bruker-Nano</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiber Optic Light</td><td>Digital Instruments Inc.</td><td>F0-50</td><td></td></tr><tr><td>Pelco AFM Disc Gripper</td><td>Ted Pella Inc</td><td>1668</td><td>12 mm</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>McKesson</td><td>102-ST1C</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Denville Scientific</td><td>C2171</td><td></td></tr><tr><td>The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1</td><td>Schrodinger, LLC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

atomic force microscopy of red-light photoreceptors using peakforce quantitative nanomechanical property mapping

原子間力顕微鏡（AFM）は、表面の力応答を調べるために、カンチレバーに取り付けられたピラミッド型チップを使用しています。先端部の偏向は、画像地形に変換することができるレーザ及びセクタ化検出器での10〜pNで測定することができる。振幅変調または「タッピングモード」AFM画像を生成するためにその共振周波数で振動させながら表面に断続的に接触するプローブを含む。流体セルと組み合わせて使用​​し、タッピングモードAFMは、そのような生理学的に関連する条件の中のタンパク質などの生体高分子のイメージングを可能にします。タッピングモードAFMは、プローブと経験の浅いユーザーのために挑戦することができ、スキャンパラメータの多数の頻繁な調整を手動でチューニングする必要があります。高品質な画像を得るために、これらの調整は最も時間を消費である。 PeakForce定量的ナノメカニカルプロパティのマッピング（PF-QNM）は力responを測定することにより、画像を生成する試料との接触のすべてのポイントのためにそれ自体の曲線。 ScanAsystソフトウェアでは、PF-QNMを自動化することができる。このソフトウェアは、与えられたサンプルに対して自動的に設定点、駆動周波数、スキャン速度、ゲイン、およびその他の重要なスキャンパラメータを調整する。のみならず、このプロセスは壊れやすいプローブおよびサンプルの両方を保護しない、それは非常に高い解像度の画像を得るのに必要な時間を減少させる。 PF-QNMは、流体中のAFMイメージングのための互換性があります。したがって、それは生物学的に関連する材料を画像化するための広範な用途を有する。 本論文で提示した方法は、光合成Rから、細菌の赤色光感光体RpBphP3（P3）の画像を得るため、PF-QNMのアプリケーションについて説明しその明順応状態にあるオオウズラタケ 。この方法を使用して、個別のタンパク質P3の二量体および二量体の凝集体は、イメージング緩衝液の存在下で雲母表面上に観察されている。適切な表面の調整及び/又は溶液の濃度は、この方法に一般に、他の生物学的に関連する高分子および軟質材料に適用することができる。

その明順応状態で感光体タンパク質の代表的なAFM画像を、P3は、 図3及び図4に示されている。新たに切断されたマイカ基板（ 図3A）は 、タンパク質吸着に適した、平坦面である。ネガティブコントロールとして、クリーン雲母の画像を収集することは、いくつかの理由のために重要である。まず、液晶セルは、清潔さを保証し、これまでの実験からの残?...

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Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

PeakForce定量的ナノメカニカルプロパティマッピングを使用した赤色光光受容体の原子間力顕微鏡

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Engineering

11.7K ビュー.  Northeastern Illinois University. A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface. 

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Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子の力分光法

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

生化学

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

生物工学

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

蛍光生体膜フォースプローブ：単一細胞上の受容体 - リガンド速度論の同時定量との結合によって誘導される細胞内シグナル伝達

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

マイクロポストアレイ上の簡単かつ正確なメカノプロファイリング

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

原子力LINCコンプレックス全体に機械的な力を測定するために、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）-forceのバイオセンサーを使用するためのプロトコル

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

光ピンセットを用いた閉じ込めにおける細胞下力学の直接力測定

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

発生生物学

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are therefore poised to be useful in the field of mechanobiology. Since the method commonly relies on image-based tracking of magnetic beads, the speed limit in recording and analyzing images, as well as the thermal fluctuations of the beads, has long hampered its application in observing small and fast structural changes in target molecules. This article describes detailed methods for the construction and operation of a high-resolution MT setup that can resolve nanoscale, millisecond dynamics of biomolecules and their complexes. As application examples, experiments with DNA hairpins and SNARE complexes (membrane-fusion machinery) are demonstrated, focusing on how their transient states and transitions can be detected in the presence of piconewton-scale forces. We expect that high-speed MTs will continue to enable high-precision nanomechanical measurements on molecules that sense, transmit, and generate forces in cells, and thereby deepen our molecular-level understanding of mechanobiology.

Here, we describe a high-speed magnetic tweezer setup that performs nanomechanical measurements on force-sensitive biomolecules at the maximum rate of 1.2 kHz. We introduce its application to DNA hairpins and SNARE complexes as model systems, but it will be also applicable to other molecules involved in mechanobiological events.

力に敏感な素子のナノメカニカル測定のための高速磁気ピンセット

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

蛍光技術の組み合わせを用いた生細胞内力感受性タンパク質ダイナミクスの測定

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

免疫学的単一細胞力分光法のための単一T細胞または単一粒子による原子間力顕微鏡片持ちの機能化

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...

免疫・感染学

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction forces have been well-characterized, but there is a lack of techniques allowing the measurement of the protrusion forces exerted by cells orthogonally to their substrate. We designed an experimental setup to measure the protrusion forces exerted by adherent cells on their substrate. Cells plated on a compliant Formvar sheet deform this substrate and the resulting topography is mapped by atomic force microscopy (AFM) at the nanometer scale. Force values are then extracted from an analysis of the deformation profile based on the geometry of the protrusive cellular structures. Hence, the forces exerted by the individual protruding units of a living cell can be measured over time. This technique will enable the study of force generation and its regulation in the many cellular processes involving protrusion. Here, we describe its application to measure the protrusive forces generated by podosomes formed by human macrophages.

Here, we detail the experimental techniques used to evaluate the protrusion forces that podosomes apply on a compliant film, from the preparation of the film to the automated analysis of topographical images.

突起力顕微鏡: 細胞突起が開発した力を定量化する方法

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...