Name: methods to investigate the regulatory role of small rnas and ribosomal occupancy of plasmodium falciparum
Uploaded: 2015-12-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
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This research was funded by Doris Duke Charitable Foundation, Burroughs Wellcome Fund, NIH R21DK080994, Duke Chancellor's pilot project fund, the Roche Foundation for Anemia Research and The Bill and Melinda Gates Foundation. G.L. is supported by Duke's UPGG and the NIH (Grant # 5R01AI090141-03) and K.A.W. by the NSF Graduate Research Fellowship Program.

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The authors have no competing financial interests to declare.

HbSを、それがPによって引き起こされる重症マラリアに対する保護を提供する主な理由、マラリア流行地域で最も一般的なヘモグロビン変異体の一つであります熱帯熱マラリア原虫 。 P.の遺伝子調節におけるヒトマイクロRNAの役割を特徴づけるために必要な技術熱帯熱マラリア原虫は、この原稿全体に詳述されています。すべての低分子RNAを含むような方法で総RNAを抽出し、かつ比較的簡単寄生虫溶解手順を実行することにより、これらの融合RNAは、独立した、種々の技術により同定することができました。 これらの手順は比較的簡単ですが、適切に従わない場合の問題、汚染に敏感です。寄生虫抽出中、ホスト赤血球を汚染除去するためのサポニンの溶解を行うことが重要です。これは、RNA単離のサポニン溶解工程中に特に当てはまります。宿主赤血球のmiRNAの成分は、大きさGの数オーダーでありますほとんどの赤血球が感染していないことに部分における寄生虫のよりreater、それは、できるだけ多くの赤血球汚染を除去することが重要です。 （感染サイクルの特定のポイントが必要な場合）には、正確なmiRNAプロファイルを得るために、健康な、適切な段階でマラリアの培養を維持することも重要です。同様に、フェノール - クロロホルム抽出の際には、水相がない場合は、残りの汚染を避けるために、フェノール - クロロホルム抽出を繰り返し、明確であると確認するために極めて重要です。 また、デスチオビオチン取り込み実験では、ビオチンの過剰で溶出して、適切な特定の溶出を確実にするように、ストレプトアビジンビーズの最小値を使用することが重要です。ビーズのビオチンとの競争ではなく、完全な変性そのものを介して結合されたRNAの溶出は、飛躍的背景のRNA濃縮を減らすのに役立ちました。最後に、デスチオビオチンの取り込み実験は、強調されましたこれらのmiRNAは、捕獲されたが、いくつかの他の技術はまた、ノーザンブロットおよびリボヌクレアーゼ保護アッセイ29としてこれらの融合RNAを、実証するために、以前の研究で使用されたかを実証するための一つの重要な方法をね。修正された転写物を取得するためにトランスフェクトされたマイクロRNAを用いてこのような方法は、トランスフェクトされたmiRNAの輸送およびプロセシングを媒介することができる結合タンパク質複合体の精製などの広い応用を有することができます。 様々なゲノムワイドなアプローチは、マラリアのプロテオームとトランスクリプトーム22-25を研究するために使用されてきたが、Pに翻訳制御を調べるグローバルにいくつかの方法があります21,26 熱帯熱マラリア原虫 。この方法論的制約は 、Pの並進規制のグローバルな分析を排除熱帯熱マラリア原虫 。翻訳調節を研究するための最も一般的な実験的アプローチの一つは、全体の翻訳を評価するポリソームプロファイリングであり、アル活動は、関心のある特定のmRNA上にロードされたリボソームに基づきます。この原稿で詳細は、感染赤血球と内寄生虫の両方を溶解するマラリア原虫での使用に最適化されたポリソームプロファイリング方法です。従来の方法は、ポリソームの大部分を回収し、マラリア原虫は、ポリソームの実質的な集団を持っていなかったかのようにそれが見えるまったく見られませんでした。無傷のポリソームの捕捉を可能にする膜結合リボソームを可溶化しながら、酢酸カリウムおよびマグネシウムの高濃度の溶解緩​​衝液を使用することは、赤血球および寄生虫の両方を溶解することが可能となります。 リボソーム精製およびプロファイリングのこの費用対効果の高い方法は、マラリアのトランスクリプトームとプロテオームの間の既存の知識のギャップを埋め、Pの翻訳状態のゲノムワイドな解析を可能にするのに役立ちます熱帯熱マラリア原虫 。このアプローチは、初期および後期段階bの変換状態を比較するために使用されていますloodステージはしっかり遺伝子発現を調整している28、寄生虫。転写物のリボソーム荷重のデータが容易に得られ、特定のmRNAにリボソームの濃度を決定するために分析することができます。ソルビトールの同期と組み合わせるとさらに、リボソーム密度の変化は、翻訳は、寄生虫のライフサイクル全体にわたって調節される方法を確立するために使用することができます。このアプローチを使用してリボソームの単離は、残念ながら、それは実行可能なマラリアのライフサイクルの各段階を制限する培養物を大量に必要とします。入力された大量の材料はまた、 熱帯熱マラリア原虫のインビトロ実験室株の両方の使用を制限し、他の感染性生物への適用性を制限することができます。この手順を使用して誰もがまた遺伝子調節の代替モードを反映して、リボソームに関連付けられていない特定の転写産物で、珍しい変換プロファイルを示す遺伝子をスクリーニングすることができるようになります。最後に、このアプローチは、新規抗マラリア薬は、タンパク質の翻訳にどのように影響するかを評価することを可能にし、薬剤耐性の翻訳ベースのメ​​カニズムを識別するために。このパイプラインは、多くの実験系での転写後調節を特定し、決定する際に大きな有用性を有します。

属マラリア原虫のアピコンプレクサ寄生虫によって引き起こされるマラリアは、世界的に毎年約200万人が感染し、約60万死亡1を引き起こし 、最も一般的な人間の寄生虫疾患です。ヒトに感染するマラリア原虫 5 種のうち、ヒトの疾患に最も関連があるP.熱帯熱マラリア原虫と P.彼らの広範囲の分布および重症マラリアの合併症の可能性のために三日熱マラリア原虫 、。マラリア原虫のライフサイクルは蚊と人間の両方の感染を必要とします。感染した蚊が人間をかむときに、寄生虫は複製の最初のラウンドが発生し、肝臓への血流を通って移動します。ホスト肝細胞からのメロゾイトが破裂した後、彼らは無性や性的いずれかの複製を開始し、近くの赤血球に感染します。 Pに 48時間持続する複製の無性段階、それはほとんどの発作の原因でもあるので、 熱帯熱マラリア原虫は 、この研究の焦点でありますアリアの症状とは、簡単に、in vitroで再現されています。 改善された抗マラリア治療を含む公衆衛生の取り組みの数は、多少グローバルマラリアの負担を低減しているが、薬剤耐性寄生虫の継続的な出現は、マラリア対策への取り組みのための問題を提起します。新しい治療法を提案することができる1つの領域は、遺伝的変異がマラリアに対する耐性を付与する方法、各種の研究です。マラリア流行地域では、赤血球の多型の様々な2,3非常に一般的です。これらの変異は、鎌状赤血球は、おそらく最も顕著であることと、多くの場合、症候性マラリア感染4の発症に対する実質的な抵抗と関連しています。これらはマラリア感染に抵抗するために、赤血球を引き起こすことにより、基礎となるメカニズムは完全には理解されています。ヘモグロビン変異を有する寄生赤血球は、強化された細胞の剛性との脱水反応によってどの強化食作用の対象となりますP.減少侵入に関連しています熱帯熱マラリア原虫 5。 HBCアレルまた、寄生虫の開発6,7を阻害 、赤血球表面および細胞骨格のリモデリングにタンパク質の発現に影響を与えます。最後に、P。熱帯熱マラリア原虫は、（HBSS）ホモ接合鎌内不十分成長マラリア耐性の固有赤血球要因を示唆し、in vitroで 8,9を赤血球。これらのメカニズムのすべてが役割を果たしているように見えるがしかし、それらは完全にマラリアに鎌状赤血球性の背後にあるメカニズムを説明していません。 よくわかっていないまま赤血球要因の一つの潜在的なセットは、成熟赤血球内に存在するmiRNAの大きなプールです。マイクロRNAは、3 &#39;UTR内の塩基対形成による翻訳および/または標的mRNAの安定性を仲介するサイズの小さな非コードRNA、19-25 ntのです。それらは、抑制Oを含む、哺乳動物の免疫応答の制御に関与していますFウイルス複製10、及び植物中で、ウイルスに対する抵抗性を付与することが示されたが、それらはまた、赤血球11,12と鉄代謝13を含むいくつかの赤血球のプロセスを調節することが示されています。以前の研究では、表情劇的HBSS赤血球14,15に変更された赤血球のmiRNAの豊富で多様な集団を同定しました。成熟赤血球が活性転写および翻訳を欠いているので、これらの赤血球のmiRNAの機能的役割は不明なままです。重要な物質交換は、宿主細胞との間で発生するようにP.赤血球内発育サイクル（IDC）16時の熱帯熱マラリア原虫は 、それがのHBs赤血球内の変更されたmiRNAプロファイルは、直接細胞固有のマラリア耐性に寄与する可能性があることが推測されました。 これらの研究は、最終的には、単離し同定および機能m以内のヒトmiRNAの役割を研究するためにパイプラインの開発につながっalaria寄生虫、P。これらのホスト/ヒトmiRNAは、最終的に共有結合ヒューズ、その後翻訳寄生虫mRNA転写物17を抑制することが示された熱帯熱マラリア原虫 、。これは、トランススプライシングにより形成された第1の交差種のキメラ転写物の例を提供し、このmiRNAをmRNAの融合は、他の寄生虫を含む他の種で発生することができることを含意します。すべてのトリパノソーマmRNAはポリシストロン性転写物18の分離を調節するためにスプライスリーダー（SL）とトランス-スプライスされています。 P.ので、 熱帯熱マラリア原虫は、ダイサー/アゴー19,20のためのオルソログを欠いている、それは赤血球のmiRNAがPに類似したSLの機械をハイジャックすることが可能です熱帯熱マラリア原虫は、標的遺伝子に統合します。 P.における最近の研究熱帯熱マラリア原虫は、実際には 5 &#39;スプライスリーダー配列21の存在を示しています。本研究では、トランスクリプトームとtranslaの両方を含む、人間の寄生虫のmiRNAのmRNA融合転写物の発見につながった方法を詳述的な制御技術。これらの方法の全体的な目標は、Pの遺伝子調節、表現型と翻訳電位の低分子RNAの効果を調査するためにあります熱帯熱マラリア原虫の転写産物。 人間寄生虫キメラ転写物の最初の同定は、リアルタイムPCR、トランスクリプトーム配列決定およびESTライブラリ合計と小の両方のRNAを含まキャプチャ、だけではなく、小さなRNAを単離した技術を使用してのようなRNA解析技術の利用に依存。むしろ別々にするよりも、一つの大きなプールで一緒にすべてのRNAを単離する、より大きな配列の一部として、寄生虫の両方に転位し、人間の小さなRNAだけでなく、これらの小さなRNA配列の存在の同定を可能にしました。これは、これら融合体の機能的結果を決定するために、これらの融合mRNAの翻訳状態の分析を必要としました。 寄生虫のゲノムANの特性に関する広範な取り組みながらDのトランスクリプトームは、はるかに少ないPのライフサイクル全体でのmRNAトランスクリプトームの翻訳調節についてはほとんど知られていない、寄生虫の生物学22-25の理解に追加しました熱帯熱マラリア原虫 26。寄生虫のプロテオームのこの限られた理解は寄生虫の生物学の理解と抗マラリア治療薬の次の世代のための新たな標的を同定する能力の両方を妨げてきました。寄生虫の細胞生物学の理解のこのギャップは 、Pの並進規制を調査するために十分な技術の不足によるところが大きい続いています熱帯熱マラリア原虫 。一つの最近の論文ではPのリボソームフットプリントを使用することを記載して熱帯熱マラリア原虫は、グローバル翻訳ステータス21を決定します 。転写物の翻訳可能性の1つのよく確立された測定値は、ポリソームプロファイリングによって決定関連するリボソームの数です。しかし、この技術は、Pに印加されたとき熱帯熱マラリア原虫&lt;/ em&gt;の、それはほとんどのポリソームを回復することができず、主にモノソームをキャプチャします。最近、いくつかのグループ27,28は、P を最適化しましたポリソームを維持し、ホスト赤血球28での無性開発中にこれらのマラリア原虫のリボソーム占有および翻訳可能性を特徴づけるために、同時に赤血球および寄生虫を溶解することにより熱帯熱マラリア原虫ポリソーム技術。 まとめると、これらの方法は、ヒトmiRNAおよび寄生虫mRNAの観察された融合が以前に報告された方法27を使用して実証されたものを融合するmRNAの寄生虫タンパク質翻訳を調節する、およびHBAでマラリア抵抗性の主要な決定要因であるとHBSSは17赤血球ことを示しています。これらのメソッドは、それらの融合RNAは、P内にあるかどうかを識別し、機能的RNAスプライシング事象を探求しようとして任意のシステムにおいて有用であろう熱帯熱マラリア原虫または他の真核生物系。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;REAGENTS-All reagents must be RNAse-free.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>DEPC</td></tr><tr><td>DEPC-treated water (see REAGENT SETUP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yoyo-1 DNA fluorescent dye</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser II electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 cm Electroporation cuvettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 M potassium acetate</td><td>Mallinckrodt</td><td>6700</td><td></td></tr><tr><td>2 M potassium HEPES</td><td>Sigma</td><td>H0527</td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td>1 M magnesium acetate</td><td>Sigma</td><td>M-2545</td><td></td></tr><tr><td>1 M dithiothreitol</td><td>Research Products International</td><td>D11000</td><td>DTT</td></tr><tr><td>100 mM phenylmethylsulfonate fluoride</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>PMSF, dissolved in isopropanol</td></tr><tr><td>10% (v/v) Igepal CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3021</td><td></td></tr><tr><td>10% (w/v) sodium deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D-6750</td><td>DOC</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>C-7698</td><td>CHX</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Mallinckrodt</td><td>8360-04</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT (Invitrogen, cat. no. 100000840)</td><td>Invitrogen</td><td>100000840</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 w/ L-glutamine</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10% AlbuMAX I</td><td>Invitrogen</td><td>11020-039</td><td>w/v in sterile water</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>HT supplement (100x) (Invitrogen, cat. no. 11067030)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>45% (w/v) sucrose (Sigma, cat no. G8769)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES buffer (Gibco, cat. no. 15630-080)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x phosphate buffered saline (PBS; Cellgro, cat. no. 2109310CV)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning 500 ml vacuum filter flask (VWR, cat. no. 430769)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass slides (VWR, cat. no. 48311-702)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa stain (50X) (VWR, cat no. m708-01)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA isolation kit (Ambion, ThermoFisher Scientific).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&#039; Biotin conjugated mature miRNA (sequence varies by miRNA of interest) (Dharmacon)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin powder (Sigma-Aldrich)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M Potassium Chloride</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Sepharose High Performance Beads (GE Healthcare)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ribosome resuspension buffer (see REAGENT SETUP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lysis buffer (see REAGENT SETUP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 M sucrose cushion (see REAGENT SETUP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60% (w/v) sucrose chase solution (see REAGENT SETUP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmodium cell culture media (see REAGENT SETUP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA capture Wash Buffer (see REAGENT SETUP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA Elution Buffer (see REAGENT SETUP)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;REAGENT SETUP&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasmodium cell culture media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 ml RPMI-1640 w/ L-glutamine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml gentamicin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml HT supplement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.5 ml 45% glucose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 ml 10% AlbuMAX I</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12.5 ml 1 M HEPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile filter with 0.2 mm vacuum filter flask.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasmodium cell culture media containing 10x CHX&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Same recipe as Plasmodium cell culture media above, with the addition of:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mM cycloheximide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Media is prepared as normal, then add CHX to a final concentration of 2 mM and filter.&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;1x PBS containing cycloheximide&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide is added fresh to 1x PBS to a final concentration of 200 mM, and kept at 4 &lt;sup&gt;O&lt;/sup&gt;C until use.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Ribosome resuspension buffer&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>400 mM potassium acetate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 mM potassium HEPES, pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mM magnesium acetate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mM cycloheximide (add fresh)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM DTT (add fresh)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM PMSF (add fresh)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 U/ml RNaseOUT (add fresh)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Lysis buffer&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% (v/v) Igepal CA-630</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5% (w/v) DOC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sucrose solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of varying amounts of sucrose:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15% (w/v) sucrose to make 15% sucrose gradient solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% (w/v) sucrose to make 50% sucrose gradient solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 M sucrose to make 0.5 M sucrose cushion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>As above, cycloheximide, DTT, PMSF, and RNaseOUT must be added fresh.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>The 60% sucrose chase solution requires only sucrose and water, no other components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60% (w/v) sucrose in DEPC-treated water to make 60% sucrose chase solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNA Capture Wash Buffer&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 mM&amp;nbsp; KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 unit/ml Rnase Out (Invitrogen)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNA Capture Elution Buffer&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Same recipe as RNA Capture Wash Buffer, with the addition of:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mM Biotin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW55 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 342194)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW41 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 331362)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; &amp;frac12; x 2 in (13 x 51 mm) ultracentrifuge tubes for the SW55 (Beckman, cat. no. 344057)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyallomer 9/16 x 3 &amp;frac12; in (14 x 89 mm) ultracentrifuge tubes for the SW41 (Beckman, cat. no. 331372)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L8-80M ultracentrifuge (Beckman)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steel blunt syringe needle, 4 inch, 16 G (Aldrich, cat. no. Z261378)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringe with 27 G&amp;frac12; needle (Becton Dickinson, cat no. 309623)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml syringe (Becton Dickinson, cat. no. 309646)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube rotator, end-over-end</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge, refrigerated</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Density gradient fractionation system (Teledyne Isco, cat. no. 69-3873-179)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TracerDAQ (Measurement Computing)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf A-4-81 rotor (Eppendorf, cat. no. 022638807)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methods to investigate the regulatory role of small rnas and ribosomal occupancy of plasmodium falciparum

鎌状赤血球対立遺伝子（HBS）を担当する遺伝的変異は 、P、マラリア原虫による感染に抵抗するために赤血球を可能にします熱帯熱マラリア原虫 。多因子性であることが知られており、この抵抗の分子的基礎は、完全には理解されたままです。最近の研究では、遺伝子調節や寄生虫の成長の両方に影響を与え、一度マラリア原虫に転位、赤血球マイクロRNAの発現差異ことがわかりました。これらのmiRNAは、後寄生虫mRNAの控えめなサブセットと5 &#39;RNAの融合を介してキメラRNA転写物を形成することによりmRNAの翻訳を阻害することが示されました。ここで、技術はPの遺伝子調節および翻訳可能性に赤血球マイクロRNAの基礎となる機能的役割と推定されるメカニズムを研究するために使用されたこと熱帯熱マラリア原虫 、宿主赤血球に変性合成マイクロRNAのトランスフェクションを含め、詳細に説明します。最後に、ポリソーム勾配法は、TRAの程度を決定するために使用されますこれらの転写物のnslation。一緒に、これらの技術は、私たちは赤血球マイクロRNAの調節不全のレベルは鎌状赤血球の細胞固有のマラリア耐性に寄与することを実証することができました。

P.中のヒトマイクロRNAのグローバルプロファイリング熱帯熱マラリア原虫 ここに提示された技術は、様々な条件に寄生虫からマイクロRNAを抽出するために使用されました。もう一つ注意すべきは、多くの場合、この記事を最初の研究29の双方に提示マイクロRNAデータの基準点を務め32に示すように、非感染赤血球のためのRNA抽出を行ったということです。これらの以前の研究はまた、HBSS赤血球は、特に、特定のmiRNAのはるかに高いレベルを有したmiR-451ことを実証しました。上に示された技術は、HbSを（のHBAまたはHBSS）感染寄生虫におけるmiRNA豊富の変化を実証するのに十分でした。上に示さおよび18SのrRNAに対して標準としてRNAサンプルを抽出しました。 HBSS赤血球の寄生虫のサンプルは、例えば、のmiR-451（ 図1）を含むいくつかのマイクロRNAのレベルの有意な増加を示さありません。ホストerythrからのmiRNAの取り込みocyteも以前の研究34,35と一致しています。 miR-451とHbAA赤血球のトランスフェクションは、HBSS赤血球（ 図1）と同様のレベルにHbAAのmiR-451を増加させました。フローサイトメトリーは、その後、寄生虫の成長の際に転位のmiRNAの効果を評価するために、寄生虫感染を測定しました。それに基づいて、のmiR-451、のmiR-223及びmiR-181Aを用いてトランスフェクトHbAA赤血球は、一本鎖DNAオリゴとともに、寄生虫の成長時にマイクロRNAの効果を調べました。のみによって軽減することができたのmiR-451著しく減少寄生虫、とトランスフェクションアンチセンスのmiR-451オリゴを共トランスフェクトしながら- （D図2A）のssDNA又はmiR-181Aのトランスフェクションは、寄生虫に何ら影響を及ぼさありませんでした。 2&#39;-O-MeのアンチセンスマイクロRNAのトランスフェクションによるマイクロRNAのブロッキングは、相反効果を示しました。 HBSS赤血球は、自然に高いのmiR-451のレベルで、トランスフェクトしました<html>アンチセンスのmiR-451または2&#39;-O-メチルオリゴヌクレオチド（ 図3）を有します。 miR-451の阻害は、両方のHBSS赤血球（ - F図3C）で寄生虫の増殖を増加させました。寄生虫の割合を平均し、HBSS成長（ 図3F）に倍数変化の相対パスとして提示した後、少なくとも3つの独立したトランスフェクションから計算しました。 ビオチン捕獲アッセイによりmiRNAをmRNAの融合RNAのキャプチャー方法の項5に示すように、5&#39;-デスチオ-のmiR-451（5&#39;Db-のmiR-451）と5&#39;Db-のmiR-181のトランスフェクションの後、それが観測されたmiRNA配列は、ヒトのマイクロRNAと発信することを決定しました。定量RT-PCR分析は5&#39;Db-のmiR-451のトランスフェクションは、PKA-R融合転写物の豊富化（ 図4）をもたらしたことを示しました。 Pのリボソーム占有率を決定するためにポリソームの分離熱帯熱マラリア原虫 10トン&quot;&gt;典型的な254トレースは最初のA 254。端数密度はグラフ（左へすなわち軽い画分）に左から右に増加すると、（ 図5BでのrRNAのコンテンツの北の確認と）、図5（a）に示されています初期の画分中のヘモグロビンによる吸光度に非常に高いですが、すぐにベースラインに低下します。最初の小さなピークが小さいリボソームサブユニット（40S）に対応し、わずかに大きいと大に対応する第2のピークですぐに続きますリボソームサブユニット（60S）。一般的に熱帯熱マラリア原虫の最大である第3のピークは、モノソームピーク（80S）に対応しています。これにより、その高さに、80Sは、UV検出器の感度を調整するためのガイドとして使用してください60Sは60Sと80Sの両方の場合、モノソームピークの開始に「肩」のようにあいまいに知らせるために後続の実行（ステップ6.17）のために。また、原因80Sピークの大きさに、それが一般的です信号が大きいです。 モノソームピークに続いてポリソームに対応するピークです。連続する各ピークは、リボソームの徐々に大きく番号（2,3,4、 等）を表すポリソーム画分を表します。各ポリソームピークは各連続ポリソーム番号が2-3倍の高さに減少させること、また前のピークよりも小さくなります。典型的な実行は、出発物質の大規模な量のいくつかの実行で観察された9マーのポリソームまでのしかし解像度、5-7リボソームからなるポリソームの解像度を可能にします。高次ポリソームは、トレースの残りの部分を構成し、これらの勾配条件下では解決できません。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53214/53214fig1.jpg" /> 図1：MIR-451はHBSS赤血球において上昇する IntraparasiticのmiR-451のレベルを、リアルタイムPCRにより測定し、18S rRNAのに対して正規化として、示されているから分離された寄生虫から。赤血球タイプ。値は平均±SEです。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53214/53214fig2.jpg" /> 図2：通常の赤血球中のmiR-451の過剰発現は、寄生虫の増殖を阻害するには、（A - C）感染率を示す代表的FACSプロットは、合計RBCのパーセンテージとして、示さ赤血球タイプのために、M1で示されています。 （D）複合感染率FACSに由来し、トランスフェクションされていないHbAA赤血球に対して正規化。 Dは平均値±SEである一方で、パネルのACの値は、代表的なFACSプロットされています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53214/53214fig3.jpg" /> 図3：鎌状赤血球中のmiR-451の阻害は寄生虫の増殖を上昇させる（A - E）感染率を示す代表的FACSプロットは、総赤血球の割合として、示さERのために、M1で示されています。ythrocyteタイプ。 （F）複合感染率は、FACSに由来し、トランスフェクションされていないHbAA赤血球に対して正規化した値としてプロットしました。パネルA〜Eの値は、代表的なFACSプロットであり、Fは平均±SEです。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53214/53214fig4.jpg" /> 図4：のmiR-451のトランスフェクションは、PKA-R融合転写物について豊かと融合したmiRNAが起源で赤血球であることを示しているストレプトアビジンによって捕獲された示されたデスチオビオチンコンジュゲートのmiRNAのmRNA融合転写物の豊富化。値は、リアルタイムPCRを用いて測定し、非トランスフェクト寄生虫に対する相対値としてプロットしました。値は平均±SEです。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53214/53214fig5.jpg" /> 図5：寄生虫リボソームは、ショ糖勾配を経由して単離することができる（A - B）Examp。熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）から抽出されたポリソームプロファイルのル痕跡。 （関連するリボソームの数を示す#Sと）40S、60S、80Sおよびポリソームピークと熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）から抽出されたポリソームプロファイルの（A）トレース表示。 （B）、リボソーム画分全体の18Sおよび28S rRNAのノーザンブロット。値は平均±SEです。

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Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

小さなRNAおよびリボソームの占有の調節の役割を調査する方法<em&gt;熱帯熱マラリア原虫</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

8.8K ビュー.  Duke University School of Medicine. Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts. 

ビデオ: Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

急速な手法による新規RNA結合タンパク質の単離

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

遺伝学

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For a long time, the gene expression studies were dominated by research on the transcriptional level. However, the steady-state levels of mRNAs do not correlate well with protein production, and the translatability of mRNAs varies greatly depending on the conditions. In some organisms, like the parasite Leishmania, the protein expression is regulated mostly at the translational level. Recent studies demonstrated that protein translation dysregulation is associated with cancer, metabolic, neurodegenerative and other human diseases. Polysome profiling is a powerful method to study protein translation regulation. It allows to measure the translational status of individual mRNAs or examine translation on a genome-wide scale. The basis of this technique is the separation of polysomes, ribosomes, their subunits and free mRNAs during centrifugation of a cytoplasmic lysate through a sucrose gradient. Here, we present a universal polysome profiling protocol used on three different models - parasite Leishmania major, cultured human cells and animal tissues. Leishmania cells freely grow in suspension and cultured human cells grow in adherent monolayer, while mouse testis represents an animal tissue sample. Thus, the technique is adapted to all of these sources. The protocol for the analysis of polysomal fractions includes detection of individual mRNA levels by RT-qPCR, proteins by Western blot and analysis of ribosomal RNAs by electrophoresis. The method can be further extended by examination of mRNAs association with the ribosome on a transcriptome level by deep RNA-seq and analysis of ribosome-associated proteins by mass spectroscopy of the fractions. The method can be easily adjusted to other biological models.

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

The overall goal of polysome profiling technique is analysis of translational activity of individual mRNAs or transcriptome mRNAs during protein synthesis. The method is important for studies of protein synthesis regulation, translation activation and repression in health and multiple human diseases.

リーシュ マニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

生化学

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as plant microRNAs (miRNAs) carry a 2&#39;-O-methyl (2&#39;-OMe) modification at their 3&#39;&#160;terminal nucleotide. This modification adds another difficulty as it inhibits 3&#39;&#160;adapter ligation. We previously demonstrated that modified versions of the &#39;TruSeq (TS)&#39;&#160;protocol have less bias and an improved detection of 2&#39;-OMe RNAs. Here we describe in detail protocol &#39;TS5&#39;, which showed the best overall performance. TS5 can be followed either using homemade reagents or reagents from the TS kit, with equal performance.

We present a detailed small RNA library reparation protocol with less bias than standard methods and an increased sensitivity for 2&#39;-O-methyl RNAs. This protocol can be followed using homemade reagents to save cost or using kits for convenience.

小型RNA-seqの改善:バイアスの減少と2'-O-メチルRNAの検出の改善

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral RNAs. When bound to viral double-stranded RNAs (dsRNAs), PKR undergoes dimerization and subsequent autophosphorylation. Phosphorylated PKR (pPKR) becomes active and induces phosphorylation of the alpha subunit of eukaryotic initiation factor 2 (eIF2&#945;) to suppress global translation. Increasing evidence suggests that PKR can be activated under physiological conditions such as during the cell cycle or under various stress conditions without infection. However, our understanding of the RNA activators of PKR is limited due to the lack of a standardized experimental method to capture and analyze PKR-interacting dsRNAs. Here, we present an experimental protocol to specifically enrich and analyze PKR bound RNAs during the cell cycle using HeLa cells. We utilize the efficient crosslinking activity of formaldehyde to fix PKR-RNA complexes and isolate them via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs can then be further processed to generate a high-throughput sequencing library. One major class of PKR-interacting cellular dsRNAs is mitochondrial RNAs (mtRNAs), which can exist as intermolecular dsRNAs through complementary interaction between the heavy-strand and the light-strand RNAs. To study the strandedness of these duplex mtRNAs, we also present a protocol for strand-specific qRT-PCR. Our protocol is optimized for the analysis of PKR-bound RNAs, but it can be easily modified to study cellular dsRNAs or RNA-interactors of other dsRNA binding proteins.

We present experimental approaches for studying RNA-interactors of double-stranded RNA binding protein kinase RNA-activated (PKR) during the mammalian cell cycle using HeLa cells. This method utilizes formaldehyde to crosslink RNA-PKR complexes and immunoprecipitation to enrich PKR-bound RNAs. These RNAs can be further analyzed through high-throughput sequencing or qRT-PCR.

哺乳類の細胞周期中に RNA 活性化蛋白質キナーゼの RNA インターアクターを勉強

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized notably due to the difficulty of identifying their mRNA targets. Here, we described a modified protocol of the MS2-Affinity Purification coupled with RNA Sequencing (MAPS) technology, aiming to reveal all RNA partners of a specific sRNA in vivo. Broadly, the MS2 aptamer is fused to the 5&#8217; extremity of the sRNA of interest. This construct is then expressed in vivo, allowing the MS2-sRNA to interact with its cellular partners. After bacterial harvesting, cells are mechanically lysed. The crude extract is loaded into an amylose-based chromatography column previously coated with the MS2 protein fused to the maltose binding protein. This enables the specific capture of MS2-sRNA and interacting RNAs. After elution, co-purified RNAs are identified by high-throughput RNA sequencing and subsequent bioinformatic analysis. The following protocol has been implemented in the Gram-positive human pathogen Staphylococcus aureus and is, in principle, transposable to any Gram-positive bacteria. To sum up, MAPS technology constitutes an efficient method to deeply explore the regulatory network of a particular sRNA, offering a snapshot of its whole targetome. However, it is important to keep in mind that putative targets identified by MAPS still need to be validated by complementary experimental approaches.

MAPS technology has been developed to scrutinize the targetome of a specific regulatory RNA in vivo. The sRNA of interest is tagged with a MS2 aptamer enabling the co-purification of its RNA partners and their identification by RNA sequencing. This modified protocol is particularly suited for Gram-positive bacteria.&#160;

グラム陽性菌におけるRNAシーケンシングと結合したMS2-アフィニティ精製

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and understanding the biological properties of viruses. There are several mechanisms for regulating viral tropism, however they tend to be virus class specific and many result in virus attenuation. Additionally, many viruses, including picornaviruses, exhibit size constraints that do not allow for incorporation of large amounts of foreign genetic material required for some targeting methods. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotic cells by binding complementary target sequences in messenger RNAs, preventing their translation or accelerating their degradation. Different cells exhibit distinct microRNA signatures and many microRNAs serve as biomarkers. These differential expression patterns can be exploited for restricting gene expression in cells that express specific microRNAs while maintaining expression in cells that do not. In regards to regulating viral tropism, sequences complementary to specific microRNAs are incorporated into the viral genome, generally in the 3' non-coding regions, targeting them for destruction in the presence of the cognate microRNAs thus preventing viral gene expression and/or replication. MicroRNA-targeting is a technique that theoretically can be applied to all viral vectors without altering the potency of the virus in the absence of the corresponding microRNAs. Here we describe experimental methods associated with generating a microRNA-targeted picornavirus and evaluating the efficacy and specificity of that targeting in vitro. This protocol is designed for a rapidly replicating virus with a lytic replication cycle, however, modification of the time points analyzed and the specific virus titration readouts used will aid in the adaptation of this protocol to many different viruses.

We describe here a method for regulating picornavirus tropism by incorporating sequences complementary to specific microRNAs into the viral genome. This protocol can be adapted to all different classes of viruses with modifications based upon the length and nature of their life cycle.

ピコルナウイルス向性のマイクロRNAベースの規制

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

免疫・感染学

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNAの蛍光による単一細胞遺伝子転写の解析<em&gt; in situで</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

生物学

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, could repress the expression of outer membrane proteins. To further investigate the regulation function of micC in Salmonella Enteritidis, we cloned the micC gene in the Salmonella Enteritidis strain 50336, and then constructed the mutant 50336&#916;micC by the &#955; Red-based recombination system and the complemented mutant 50336&#916;micC/pmicC carrying recombinant plasmid pBR322 expressing micC. qRT-PCR results demonstrated that transcription of ompD in 50336&#916;micC was 1.3-fold higher than that in the wild type strain, while the transcription of ompA and ompC in 50336&#916;micC were 2.2-fold and 3-fold higher than those in the wild type strain. These indicated that micC represses the expression of ompA and ompC. In the following study, the pathogenicity of 50336&#916;micC was detected by both infecting 6-week-old Balb/c mice and 1-day-old chickens. The result showed that the LD50 of the wild type strain 50336, the mutants 50336&#916;micC and 50336&#916;micC/pmicC for 6-week-old Balb/c mice were 12.59 CFU, 5.01 CFU, and 19.95 CFU, respectively. The LD50 of the strains for 1-day-old chickens were 1.13 x 109 CFU, 1.55 x 108 CFU, and 2.54 x 108 CFU, respectively. It indicated that deletion of micC enhanced virulence of S. Enteritidis in mice and chickens by regulating expression of outer membrane proteins.

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

An &#955;-Red-mediated recombination system was used to create a deletion mutant of a small non-coding RNA micC.

ノンコード低分子RNA MicCは、 サルモネラ ・エンテリティディスの外膜タンパク質の病原性に寄与します

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

低分子RNA種のノーザンブロット検出における強化<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

ポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mRNAの翻訳の評価

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

小さなRNAおよびリボソームの占有の調節の役割を調査する方法

要約

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急速な手法による新規RNA結合タンパク質の単離

リーシュマニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

小型RNA-seqの改善:バイアスの減少と2'-O-メチルRNAの検出の改善

哺乳類の細胞周期中に RNA 活性化蛋白質キナーゼの RNA インターアクターを勉強

グラム陽性菌におけるRNAシーケンシングと結合したMS2-アフィニティ精製

ピコルナウイルス向性のマイクロRNAベースの規制

RNAの蛍光による単一細胞遺伝子転写の解析

ノンコード低分子RNA MicCは、サルモネラ・エンテリティディスの外膜タンパク質の病原性に寄与します

低分子RNA種のノーザンブロット検出における強化

ポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mRNAの翻訳の評価

小さなRNAおよびリボソームの占有の調節の役割を調査する方法

要約

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急速な手法による新規RNA結合タンパク質の単離

リーシュ マニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

小型RNA-seqの改善:バイアスの減少と2'-O-メチルRNAの検出の改善

哺乳類の細胞周期中に RNA 活性化蛋白質キナーゼの RNA インターアクターを勉強

グラム陽性菌におけるRNAシーケンシングと結合したMS2-アフィニティ精製

ピコルナウイルス向性のマイクロRNAベースの規制

RNAの蛍光による単一細胞遺伝子転写の解析

ノンコード低分子RNA MicCは、 サルモネラ ・エンテリティディスの外膜タンパク質の病原性に寄与します

低分子RNA種のノーザンブロット検出における強化

ポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mRNAの翻訳の評価

リーシュマニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

ノンコード低分子RNA MicCは、サルモネラ・エンテリティディスの外膜タンパク質の病原性に寄与します