We are grateful to the past and present members of the laboratory, in particular Urszula Liwak, for critical discussion regarding polysome profiling protocols and sharing of data. This work was supported by operating grants from the Canadian institutes of Health Research, Cancer Research Society, and the National Science and Engineering Research Council of Canada to MH. MDF was supported by the Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award and the Ontario Graduate Scholarship, and this work forms part of her Ph.D. dissertation.

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The authors have nothing to disclose.

ポリソームプロファイリングは、異なる処置条件下での特異的転写物の翻訳の状態の定量化を可能にする強力な技術である。それはまだそれが良いソームプロファイルを生成するために重要であるそのうちのいくつかは、実行のいくつかのステップを必要とし、原則として、非常に単純な手法である。これらの重要なステップは次のとおりです。1）RNaseフリー化学物質やプラスチック製品を使用して、2）優れたショ糖勾配を（我々の経験では10-50％スクロース勾配が効率的にバインドされたリボソームを持つ40 / 60SサブユニットとmRNAを解決するための最善の仕事）を​​製造し、3 ）指数関数的に翻訳の最高速度を捕捉するために成長し、80％以下のコンフルエントされた細胞を使用。そのような遺伝子ノックダウンまたは過剰発現する限り、細胞治療を行う際にめっきする細胞の量は、細胞は、エンドポイントでコンフルエントにどれだけの関数になるように、この後者のステップは、考慮されるべきである。 結果にPRESENテッドはここで、ポリソームプロファイル分析は、IRES-保有するmRNA XIAPおよびBcl-xLの12の翻訳調節にPDCD4の役割を評価するための重要なツールでした。我々はPDCD4ノックダウン（ 図1B）の際に、一般的なポリソームプロファイルの変化を観察しなかったという事実は、私たちはPDCD4、実験の条件の下でグローバルセルラー翻訳を損なわなかったと結論することができました。我々は次に、PDCD4または対照siRNAで処理した細胞におけるXIAPおよびBcl-xLのmRNAの分布を決定するために、RT-qPCR分析を使用した。それはmRNAの分布を定量的にではなく、半定量的分析のために、および処置の間の翻訳効率の微妙なシフトの検出を可能にするため、定量PCRは、標準的なRT-PCRまたはノーザンブロット法とは対照的に、ポリソームプロファイルを分析するために選択される方法である。この技術を用いて、XIAPおよびBcl-xLのmRNAの分布は、（グラムでの合計は、標的mRNAのパーセントとして表されていることを示すことができたadient）PDCD4がノックダウン後に有意したがって、これらのmRNAの翻訳の増加を示している（ 図1D、E）重いポリリボソーム（それらに関連するリボソームの数が多いのmRNA）にシフトした。これをさらにXIAPおよびBcl-xLのタンパク質レベルではなく、それらの定常状態のRNAレベル（ 図1F、G）の増加によって確認された。重要なことは、XIAPの非IRES変異体のポリソーム分布は、処理および未処理細胞（ 図1C）の間で変化しなかった。代わりに、翻訳効率は14（通常2〜4を留分）モノソーム対ポリソーム中のmRNA量の比率（通常は5から10分画）として提示することができた。 254nmでの吸光度測定から観察されたピークが自分でリボソームRNA（洗剤に起因することができないようなプロトコルを通じてコン​​トロールの使用は、結果プロファイリング任意のポリソームを検証する上で重要であるトリトンX-100のようなsは、強く）スペクトルのこの領域で吸収し、勾配の最上部40 / 60Sピークを不明瞭にすることができる。溶解物なしで、および/または溶解物緩衝液ブランク勾配は、254nmにおける吸光度のバッファの相対的な寄与を決定するために実行される必要がある。人為的な高次構造も事実なしで（ 例えば 「擬似ポリソーム」20）があるポリソームの誤った解釈につながることができます。 EDTAが溶解物への勾配緩衝液（15分間の20mM）に加え、二価カチオンキレート剤は、その成分の小さい（40S）にリボソームの分離を引き起こし、大きな（60Sになると（80Sリボソームを安定化するための手順を通して使用される）、マグネシウムを封鎖）サブユニット。 260nmで記録された吸光度ピークがポリソーム確かであればこのように、EDTA処理は、単一の最大値は、mRNAとリボソームユニットを解放するために対応する勾配の最上部付近に観察されるように、プロファイルを崩壊する（データは示さず）。一致するプロファイルのEDTA誘発性崩壊で、定量PCRによって分析具体的な目標のすべてが今、勾配の上部に見つかるはずです。 mRNAと関連したリボソームの数は、常に特定のmRNAが翻訳されていることをどのように効率的にするものではありません。実際、ポリソーム上のアクティブな変換は、読者が知っておくべき21,22失速となるような特定のコンテキストがあります。転写物は積極的にEDTAとは異なり、「流出」を積極的mRNAを横切って転位されたリボソームを引き起こすピューロマイシンで試料を処理すること）により行うことができる翻訳機構に係合し、またはb）試料を処理しているか否かを判定する再び、任意の下流の転位リボソームの「流出」を引き起こし、開始コドンでのみ最初のリボソームの転位を抑制するホモハリングトニンと。 qPCR分析のための制御転写物の使用も重要である。セレクXIAP IRESの非IRES変種など、いくつかのハウスキーピング遺伝子（GAPDH、アクチン、チューブリン、ヌクレオリン）、リボソームのmRNA（18S、RPL13A）などの異なる処理条件によって、またはこの場合には影響を受けません転写物るが、中には重要である翻訳に対する治療の効果は、特定または一般化されている場合を検証。 XIAPおよびBcl-xLのmRNAはGAPDH mRNAに対して標準化し、すべての画分中のmRNA含有量の和で表される全mRNA含量の百分率として表し（ここで行ったように、これらの制御転写産物は、分析のmRNAの分布を正規化するために使用することができ）、又は代替的に、標的および対照mRNAは、絶対値として表され、別々に表示することができる。入力された溶解物（総体積の通常10％）のqPCR分析は、特定のmRNAの分布のた​​めに制御するもう一つのステップである。理想的には、入力された溶解物中の特定の転写物のmRNA含有量を分析し、すべての10の画分中のmRNA量の合計に匹敵する必要があります。最終的にフェノールのために制御するための任意のステップ：クロロホルム抽出工程（たとえばCAT、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼなど） のin vitro転写レポーターmRNAと各ポリソーム画分をスパイクすることで、その後、qPCRにより定量化され、さらに正規化するために使用することができるデータ14。 任意の技術と同様に、ポリソームプロファイリングは、いくつかの制限を提示します。通常、10画分の最小（変換効率のより微妙なシフトが20以上を必要とするかもしれない）素晴らしいポリソーム分布を有するために収集する必要があるという事実は、4つのサンプルのみを最大とすることができるという意味で、このステップは制限させる快適に一度に40個のサンプルと4の入力コントロールのRNA抽出およびqPCR分析を扱うことができるように時間に分析した。サンプルサイズは、容易に定量PCRを行うためにレプリケートする方法の多くの転写物解析されるべきであり、何を追加することができ、これはコストがかかる。プロファイリング定量PCRベースのポリソームの別の制限nalysisはそれだけで（分析される転写物が予め分かっている）は、候補ベースの手法で行うことができ、翻訳のゲノムワイドな解析のために適用することができないことである。しかし、21 世紀の初めに、研究者らは、DNAを用いてゲノムレベルでのそれらのポリソームRNAを調べるために開始した次世代シーケンス16,17とより最近15とをマイクロアレイ。むしろ個々の画分の定量PCR解析を行うよりも、ことを除いて、このプロトコルで説明したように、この強力なアプローチでは、ポリソームプロファイリングが行われ、グローバルな翻訳にフラクション（通常分2-4）およびポリソーム画分（通常留分）を一緒にプールされ、バリエーションを分析したモノソームDNAマイクロアレイまたは全ゲノムRNA配列決定によって。したがって、このアプローチでは、特定の治療の際に、その分布のシフトポリソームからモノソームに（翻訳の減少）またはその逆（翻訳の増加）全てのmRNAを評価することが可能であるメント。特定のmRNAのポリソーム分布の検証および定量化は、その後qPCRにより行うことができる。ポリソームプロファイリング原理のさらに強力な使用はリボソームプロファイリングです。この技術のさらなる高スループット拡張がポリソーム画分23の何百もの同時モニタリングが可能になることが最近報告された。変異体のコレクションや大規模RNAiスクリーニングの並進効率をプロービングするときに明確な利点を提供する。リボソームプロファイリングは、タンパク質合成24,25に従事リボソーム（リボソームフットプリント）によって保護RNA断片をマッピングするために、次世代シークエンシングを利用している技術である。この技術では、リボソームの転位は、リボソーム足跡の集団を得るために細胞溶解およびRNase消化に続いて（可逆）、シクロヘキシミドまたはエメチン（不可逆的）を抑制することができる。リボソームは、濃縮された全RNAを単離し、夾雑リボソームおよびミトコンドリアリボソームRNAを除去する。約26〜28ヌクレオチドのRNA足跡を単離し、逆転写、cDNAライブラリーに変換され、26を配列決定した。標準ポリソームプロファイリングとは異なり、このアプローチは、翻訳制御されている特定のmRNAを識別するだけでなく、そのような特定の転写物に沿ってリボソームの正確な占有密度などコドン解像度でのmRNAに固有の情報が得られる。それは転写物上リボソームの募集が行われている場所の詳細な情報を与えることができるので、これは、そのようなIRES-保有するmRNAの翻訳などの特定のモードを持つmRNAをするために特に重要である。

タンパク質合成（翻訳）の調節は、密接に細胞生存にリンクされている重要な細胞プロセスです。翻訳が細胞のエネルギーの50％以上を消費することを考慮すると、変換が厳密に調節されていること、および翻訳の摂動が十分に許容されていないことは驚くべきことではない。逆に、多くの異常な細胞プロセスは、翻訳機構と翻訳出力（ すなわちプロテオーム）を修正しなければならないことを要求している。これは、しばしば、様々なストレス応答および疾患状態における場合であり、おそらく最も癌に例示されている。翻訳制御の重要な利点は、迅速に、様々な外部及び内部トリガー、先端細胞生存および死亡1のバランスそれによって微調整機構に応じて、タンパク質の出力を再プログラムする細胞の能力である。 翻訳制御には2つの側面は、特に興味深いものです。規制MECの性質の理解hanism（単数または複数）と特定の変換を可能にする制御エレメントは、特定のmRNAおよび最初の場所で選択的翻訳を誘発し、特定のトリガに対する細胞応答に関与するそれらのタンパク質産物の同定。ソームプロファイリングは、両方のプロセスの効果的な研究を可能にする技術である。 ポリソームプロファイリング技術の全体的な目標は、異なる細胞条件下で特定のmRNAの翻訳状態を研究し、定量化することである。技術の原理は、「異なる転写産物上で「積極的に翻訳するリボソームを「凍結」することによってmRNAの翻訳を取り込むため、（数リボソームによって結合された）高度に翻訳された転写産物の区別を考慮して、ショ糖勾配上で遠心分離によって生じたポリリボソームを分離することで、不十分（1つまたは2つのリボソームによって結合された）ものを翻訳した。この特定のプロトコルに結合する抗生物質シクロヘキシミド中60SリボソームサブユニットとブロックリボソームのEサイト2からの脱アセチル化されたtRNAのリリースは、リボソームの転位を阻害し、mRNAの翻訳にリボソームを停止するために使用されます。しかし、このようなエメチンもブロック翻訳伸長3などの他のブロッキング剤を使用することができる。 翻訳プロセスの最終的な出力を測定し、ウェスタンブロッティングおよび35 Sメチオニン標識技術とは異なり、ポリソームプロファイリングは、このように異なる条件下で変換メカニズムのより詳細な研究を可能にし、積極的に翻訳mRNAとリボソームとの関連を測定するという利点を有する。したがって、この技術は、容易に翻訳調節7-9、タンパク質合成1,10,11、又はIRESの上流またはmRNA構造の効果に影響を与えるストレス状態に関与するタンパク質因子は、特異的に翻訳4-6の異なるモードを研究するために適合させることができるタンパク質シンセ上のオープンリーディングフレームESIS 12-14。今日では、ポリソームプロファイリングアプリケーションがさらに広いポリソーム関連するmRNAを分析するためのDNAマイクロアレイ15または次世代シーケンス16,17を用いている。

<table><tbody><tr><td>Gradient Master 108 automated gradient maker</td><td>BIOCOMP</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker</td><td>LABCONCO</td><td>4517000</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Ultracentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Model # L-100-XP</td><td></td></tr><tr><td>Density gradient fractionator</td><td>TELEDYNE ISCO</td><td>69-3873-246</td><td>Composed of: tube piercing system,&amp;nbsp; peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280 nm filters and Foxy R1 Fraction Collector</td></tr><tr><td>WinDaq data acquisition software</td><td>DATAQ INSTRUMENTS</td><td>WINDAQ/LITE</td><td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm</td></tr><tr><td>Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose)</td><td>DiaMed</td><td>PRE1900-N</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom)</td><td>SafeSeal</td><td>12000</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose (nucleases-free)</td><td>Calbiochem</td><td>573113</td><td>MW = 342.3 g/mol</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>SIGMA</td><td>C7698</td><td>MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing.</td></tr><tr><td>Sodium chloride (nucleases-free)</td><td>OmniPur</td><td>7710</td><td>MW = 58.44 g/mol</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O (nucleases-free)</td><td>OmniPur</td><td>5980</td><td>MW = 203.3 g/mol</td></tr><tr><td>Tris Base (nucleases-free)</td><td>J.T. Baker</td><td>4109-01</td><td>MW = 121.14 g/mol</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>OmniPur</td><td>9400</td><td>Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation</td></tr><tr><td>Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Rnase inactivation solution</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9722</td><td>Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion</td></tr></tbody></table>

assessment of selective mrna translation in mammalian cells by polysome profiling

タンパク質合成の調節は、ストレスに対する細胞応答の重要な制御点を表す。具体的には、控えめなRNA調節エレメントは通常、特定のストレス応答に必要なタンパク質をコードする特定のmRNAの選択的翻訳を可能にすることが示された。これらのmRNAの同定だけでなく、選択的な翻訳のために責任を調節メカニズムの特徴付けは、しばらくの間、分子生物学の最前線に立ってきました。ソームプロファイリングは、これらの研究における礎石方法です。ポリソームプロファイリングの目標は、異なる転写に積極的に翻訳するリボソームを固定化することによってmRNAの翻訳をキャプチャし、これにより、高度に翻訳された転写物および不完全に翻訳されたものとの区別を可能にする、スクロース勾配上の超遠心分離によって生じたポリリボソームを分離することである。次いで、これらは、さらに伝統的な生化学的および分子生物学的方法によって特徴付けることができる。重要なことは、組み合わせのpハイスループットゲノムアプローチとolysom​​eプロファイリングは翻訳制御の大規模解析を可能にします。

我々は最近、アポトーシス阻害剤XIAPおよびBcl-xLの12をコードするIRES-保有するmRNAの選択的な翻訳阻害剤として腫瘍抑制PDCD4のための新規の役割を説明した。ソームプロファイリングはIRES媒介翻訳PDCD4の具体的な関与を実証するための重要な技術だった。 HEK293細胞を一過性にPDCD4（ 図1A）の内因性レベルを枯渇させるトランスフェクトし、その後、プロファイル分析をポリソームに供した。我々は、比較siCTRLとsiPDCD4細胞（ 図1B）で処理ソームプロフィールの変化の欠如によって判断されるようにPDCD4のレベルを減らすことが、グローバル細胞翻訳を損なわなかったことを観察した。同様に、XIAP 19の非IRES変異型のポリソーム分布は、処理および未処理細胞（ 図1C）との間で変化しなかった。対照的に、2つのIRES-保有するmRNAのポリソーム分布は、XIAPおよびBcl-xLのは、有意に変化した。 Pの非存在下でDCD4これら2つのmRNAの分布は重いribopolysomes（ 図1D、E）にシフトされます。これはXIAPおよびBcl-xLのmRNAは（ 図1F）の定常状態レベルの変化を伴わないので、これらの結果は、ウェスタンブロッティング（ 図によって確認された減少PDCD4のレベルの細胞におけるXIAPおよびBcl-xLのの翻訳の増強を実証1G）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> 図1：ポリソームプロファイリングがXIAPおよびBcl-xLの翻訳の選択的阻害剤としてPDCD4を識別し、（A）HEK293細胞を、PDCD4 siRNAまたはコントロール（CTRL）で処理し、抗PDCD4で溶解し、ウェスタンブロット分析に供したsiRNAを、非標的およびPDCD4の程度を確認するために、抗ヌクレオリン抗体がノックダウン（B）PDCD4は（A）のようにノックダウンしたと細胞溶解物をプロファイリングポリソームに供した。代表ポリソームプロファイルは、トップパネルに示されている。 XIAP非IRES（C）の分布は、GAPDHのそれと比較したBcl-xLの（D）、およびXIAP IRES（E）のmRNAが各画分中の全mRNAのパーセント（％mRNA）のように示されている。（F）で点灯-state mRNAレベルはPDCD4 siRNAまたはコントロール（CTRL）siRNA処理細胞におけるRT-qPCRにより測定した。（G）からの溶解物（A）抗XIAP、抗-Bcl-xLの、及び用いたウエスタンブロット分析に供した抗ヌクレオリン抗体。 （NB。データが元々 12に掲載された図1に示した） <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

ポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mRNAの翻訳の評価

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

28.1K ビュー.  University of Ottawa. The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions. 

ビデオ: Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

グローバルを測定する定量的蛍光ローカライズ翻訳

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

生化学

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For a long time, the gene expression studies were dominated by research on the transcriptional level. However, the steady-state levels of mRNAs do not correlate well with protein production, and the translatability of mRNAs varies greatly depending on the conditions. In some organisms, like the parasite Leishmania, the protein expression is regulated mostly at the translational level. Recent studies demonstrated that protein translation dysregulation is associated with cancer, metabolic, neurodegenerative and other human diseases. Polysome profiling is a powerful method to study protein translation regulation. It allows to measure the translational status of individual mRNAs or examine translation on a genome-wide scale. The basis of this technique is the separation of polysomes, ribosomes, their subunits and free mRNAs during centrifugation of a cytoplasmic lysate through a sucrose gradient. Here, we present a universal polysome profiling protocol used on three different models - parasite Leishmania major, cultured human cells and animal tissues. Leishmania cells freely grow in suspension and cultured human cells grow in adherent monolayer, while mouse testis represents an animal tissue sample. Thus, the technique is adapted to all of these sources. The protocol for the analysis of polysomal fractions includes detection of individual mRNA levels by RT-qPCR, proteins by Western blot and analysis of ribosomal RNAs by electrophoresis. The method can be further extended by examination of mRNAs association with the ribosome on a transcriptome level by deep RNA-seq and analysis of ribosome-associated proteins by mass spectroscopy of the fractions. The method can be easily adjusted to other biological models.

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

The overall goal of polysome profiling technique is analysis of translational activity of individual mRNAs or transcriptome mRNAs during protein synthesis. The method is important for studies of protein synthesis regulation, translation activation and repression in health and multiple human diseases.

リーシュ マニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ischemia and reperfusion using the isolated perfused mouse heart coupled with polysome profiling. To further understand the dynamic changes in protein translation, we characterized the mRNAs that were loaded with cytosolic ribosomes (polyribosomes or polysomes) and also recovered mitochondrial polysomes and compared mRNA and protein distribution in the high-efficiency fractions (numerous ribosomes attached to mRNA), low-efficiency (fewer ribosomes attached) which also included mitochondrial polysomes, and the non-translating fractions. miRNAs can also associate with mRNAs that are being translated, thereby reducing the efficiency of translation, we examined the distribution of miRNAs across the fractions. The distribution of mRNAs, miRNAs, and proteins was examined under basal perfused conditions, at the end of 30 min of global no-flow ischemia, and after 30 min of reperfusion. Here we present the methods used to accomplish this analysis&#8212;in particular, the approach to optimization of protein extraction from the sucrose gradient, as this has not been described before&#8212;and provide some representative results.

Here we present a protocol to perform polysome profiling on the isolated perfused mouse heart. We describe methods for heart perfusion, polysome profiling, and analysis of the polysome fractions with respect to mRNAs, miRNAs, and the polysome proteome.

動的プロテオミクスおよび miRNA 蛍光灌流後分離されたマウス心臓ポリソームの分析

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

雄マウスの生殖細胞におけるリボタグ免疫沈降

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

発生生物学

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

真核生物のポリリボソームプロファイル解析

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

生物学

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

ポリソームプロファイリングによってストレス状態の間に翻訳開始の分析

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

ゲノム規模で哺乳類Translatomesのソーム分画および分析

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell types. This balance is tightly controlled by gene expression that is fine-tuned at multiple levels, including transcription, post-transcription and translation. In this regard, a growing body of evidence highlights a critical role of translational regulation in coordinating neural stem cell fate decisions. Polysome fractionation is a powerful tool for the assessment of mRNA translational status at both global and individual gene levels. Here, we present an in-house polysome profiling pipeline to assess translational efficiency in cells from the developing mouse cerebral cortex. We describe the protocols for sucrose gradient preparation, tissue lysis, ultracentrifugation and fractionation-based analysis of mRNA translational status.

The development of the mammalian brain requires proper control of gene expression at the level of translation. Here, we describe a polysome profiling system with an easy-to-assemble sucrose gradient-making and fractionation platform to assess the translational status of mRNAs in the developing brain.

ポリソームプロファイリングを用いたマウス脳の発達における翻訳の解析

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

ポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mRNAの翻訳の評価

要約

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グローバルを測定する定量的蛍光ローカライズ翻訳

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

リーシュマニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

動的プロテオミクスおよび miRNA 蛍光灌流後分離されたマウス心臓ポリソームの分析

グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング

雄マウスの生殖細胞におけるリボタグ免疫沈降

真核生物のポリリボソームプロファイル解析

ポリソームプロファイリングによってストレス状態の間に翻訳開始の分析

ゲノム規模で哺乳類Translatomesのソーム分画および分析

ポリソームプロファイリングを用いたマウス脳の発達における翻訳の解析

ポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mRNAの翻訳の評価

要約

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グローバルを測定する定量的蛍光ローカライズ翻訳

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

リーシュ マニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

動的プロテオミクスおよび miRNA 蛍光灌流後分離されたマウス心臓ポリソームの分析

グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング

雄マウスの生殖細胞におけるリボタグ免疫沈降

真核生物のポリリボソームプロファイル解析

ポリソームプロファイリングによってストレス状態の間に翻訳開始の分析

ゲノム規模で哺乳類Translatomesのソーム分画および分析

ポリソームプロファイリングを用いたマウス脳の発達における翻訳の解析

リーシュマニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム