Name: simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system
Uploaded: 2015-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
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この作品は、NIHの助成金のEY019312とEY021126（VJK）、ワシントン大学の眼科学部およびVisual科学へEY002687でサポートされていた、と研究によって失明を防ぐために。

全ての実験プロトコルは、実験動物の管理と使用に関する指針に従ったとワシントン大学の制度的動物研究委員会によって承認されました。 1.灌流および試料ホルダーの設定<ol><li>実験の日に新鮮な網膜灌流のための溶液を調製します。蒸留脱イオン水を使用してください。次の三つの溶液のいずれかを使用します。 <ol><li>重炭酸塩含有エイムズ」溶液（1 L）を：エイムスの1ボトル」の準備メディア、そしてNaHCO 3 1.9gの、 </li><li> （mm表示）ロックの溶液を調製する：112.5のNaCl、3.6のKCl、2.4のMgCl 2、1.2のCaCl 2、10.0 HEPES、20.0のNaHCO 3、3.0コハク酸ナトリウム、0.5のNa、グルタミン酸0.02 EDTA、及び10.0グルコース、0.1％のMEMビタミンとアミノ酸酸</li><li> （mm表示）HEPES緩衝リンゲル液を準備します。133.3のNaCl、3.3のKCl、2.0のMgCl 2、1.0のCaCl 2、10.0グルコース、0.01 EDTA、12.0 HEPES、pH値1 MのNaOH〜5.8ミリリットルを7.5に調整し、0.72グラム/ Lリーボビッツ培地のL-15を追加します。任意の灌流媒体と感光体の応答を分離するために、100μMのBaCl 2 - 50μMのDL-AP4、50 - 20を使用してください。 </li></ol></li><li> （mm表示）電極28用の溶液を調製：140.0のNaCl、3.6のKCl、2.4のMgCl 2、1.2のCaCl 2、3 HEPES、0.01 EDTAおよび7.4にpHを調整- NaOHで7.5。電極溶液は、数ヶ月間、室温で保存することができます。 </li><li>試料ホルダーを準備し、テストします。 <ol><li>試料ホルダーの底部のドームの上に黒/グレーの濾紙を接着（ 図1A参照 ）。ドームの平坦な頂部の縁の周りに慎重に二成分5分エポキシ接着剤を広げます。必要に応じて、解剖顕微鏡下でそれを行います。 </li><li>接着剤がほぼ乾燥するまで待ちます（約4分）、フラットなアイテムを使用して、ドームのろ紙を押してください。糊ろ紙実験前少なくとも1日。ザ濾紙は、複数回使用することができるが、記録の月後に交換されるべきです。交換用の紙をインストールする前に、糊残りから慎重にドームをきれいにするために70％エタノールを使用してください。 </li><li> （ 図1AおよびBを参照）、任意の気泡や電極チャネルにねじアダプタで囲まれたスクリューペレット電極を回避しようとしている電極溶液で電極チャネルを埋めます。 4本のネジで試料ホルダーの上下の部分を接続し、電極溶液で灌流ラインを埋めます。 </li><li>マルチメータ（ 図1B）を用いて、各電極対のリード線間の抵抗と電圧を測定します。チャネルは無気泡であり、電極が良好な状態にある場合、抵抗は100Ωkと10 mVの下の電圧以下である必要があります。 </li></ol></li><li>ガラス瓶に灌流培地の700ミリリットル - 400を注ぎます。別の300mlの網膜およびsの解剖において使用するために別個の冷蔵庫の中にそれを引き裂きました。 （ 図1Dを参照）、熱交換器ブロックで灌流チューブをセットし、加熱プレート上で予備加熱されたブロックを配置します。 </li><li> （ 図1Dを参照）接続（エイムズ」やロックのが使用されている場合）2 / O 2ガスをCOおよび灌流チューブ用するを持っているキャップでボトルを囲みます。 37°Cのにメディアでボトルを予熱し、加熱板上または37に設定した水浴中の光刺激装置の上に置きます- 39°Cの17。 <ol><li>プライム重力駆動流を開始するために灌流培地でそれらを充填することにより、灌流ラインが。 <ol><li> LKCシステムでは、その後の実験中にボトル内の灌流液の低下レベルによって影響を受けることなく、流量調節器によって調節される重要な重力流を提供するために、刺激器ユニット17の上にボトルを置きます。 </li><li> Ocuscienceシステムでは、Pを配置溶液の重力ドライブを増加させるために十分に試料ホルダー（および灌流瓶）のレベル以下（ステップ2.8を参照）、ノイズを最小限に抑え、試料ホルダから長い灌流出力線を配置するために、ファラデーケージ内のerfusionボトル。これらの出力線を遮蔽し、ERG信号への電磁ノイズの結合を防止するためにアンプのアースにシールドを接続します。 </li></ol></li></ol></li><li>流量調節器を用いて5ml /分 - 3に灌流を調整します。適切な調節因子でシリンダーから5％CO 2/95％O 2ガスを接続し、エアストーンを通してボトル内のメディアの安定バブリングを確実にするために流量を調整します。 </li></ol> 2.サンプル調製<ol><li>ストレート刃microscissorsは、1つまたは2つの45 Oピンセット、かみそりの刃と濾紙の長方形の一枚など、クリーンでシャープな解剖器具を組み立てます。 </li><li>冷たいperfuの約200mlを注ぎ大きいペトリ皿中のシオン溶液（ドームを含む）を試料ホルダーの底部全体を溶液に浸漬することができるように。ドームの網膜をマウントする場合、このステップは重要となる（ステップ2.6を参照してください）​​。いくつかのソリューションは、カルボゲン（5％CO 2/95％O 2）で飽和するように設計されているが、これは、切開のために必須ではなく、ここに記載した実験で行われていませんでした。 </li><li>典型的な実験では、明/暗サイクル12/12時間で動物を維持し、6のためにそれらを暗適応させる - レコーディングの前に12時間。 （顕微鏡光源の前に、例えば、赤色フィルタを使用）暗赤色灯の下で頸椎脱臼に続いてCO 2吸入により動物を安楽死させると、暗赤色またはIR光の下で、次のすべての手順を実行します。 <ol><li>ピンセットを使用して目を引いて、メディアに入れて。紙の小片（ 例えば、いくつかの定期的なフィルターペーパー）で一度に一つの目を配置したようにします（これはここでは、溶液の外で行われます）ピンセットで目を押さえながら鋸状縁のレベルにほぼ点灯。 </li></ol></li><li> microscissorsで鋸状縁（または目の赤道に近い）に沿って切断し、角膜とレンズを取り外してください。大型シャーレに冷たいメディアにアイカップを置き、他の目で同じ手順を繰り返します。 </li><li>可能な限り無傷のように網膜を維持するために、網膜と強膜の間にはさみを保持することにより、視神経に向かってアイカップの上から小さな切開をカット。グリップ2ピンセットを使用し、網膜をデタッチ互いに離れるピンセットを引くことにより、切開の両側から強膜。 <ol><li>視神経を切断し、遠位表面への物理的な接触の最小量で網膜を分離してみてください。 RPEは、主に解剖プロセスの間に、網膜から自動的に切り離します。これは、実行するよりも、網膜の機械的な妨害を回避することが重要です切開はすぐに一般網膜応答特性に大きな影響を与えることなく、溶液中で少なくとも30分間インキュベートすることができます。 </li></ol></li><li>試料ホルダー（ 図1C）のドームの網膜をマウントします。切開した網膜でペトリ皿内の試料ホルダーの底部を浸します。ドームの上に、上向きに網膜、光受容体の側（分離された網膜の凸面）をスライドさせ、網膜が濾紙上に付着するように試料ホルダーを持ち上げます。他の網膜のための手順を繰り返します。 </li><li>電気網膜間のクロストークと同様にノイズと信号シャントを防ぐために慎重にホルダープレートを乾燥させます。試料ホルダーは、ホルダーの底部と上部の部分の間の溶液が流出することを防止するだけでなく、個々の網膜の光受容体と神経節細胞の辺の電気的分離を助けるために底部のドームの周りにOリングを持っています。 （4本のネジでホルダーの上部を取り付け図1Bを参照）、注射器と針を用いて灌流溶液で灌流チャネルを満たします。 </li><li>熱交換器ブロックの隣に試料ホルダーを移し、試料ホルダ（ 図1D）の入出力灌流ラインを接続します。 ERG増幅器に電極を接続します（上部電極は、アンプに地面/マイナス端子に接続）とアダプタを使用して、試料ホルダーの刺激/コントロールユニットを接続したり、生体内でどのに応じて刺激ユニットに加熱パッドをスライドさせERGシステムが使用されます。 </li></ol> 3.レコーディング<ol><li> in vivoでのシステムのソフトウェアを使用することにより、アンプと刺激の設定を行います。 300 Hzにフィルタリングを1と10 kHzの低域の間の値に取得頻度を設定します。ハイパスフィルタを使用しないでください。必要に応じてフィルタをノッチ60ヘルツ（またはヨーロッパでは50 Hz）を使用してください。 </li><li>光刺激とウィットのないレコードのベースラインH薄暗い刺激（ 例えば 、-35 dB以上0.3 MCDのSM -2の緑色光）は、電極と網膜の試料との間の良好な電気的接続をテストします。網膜の温度と機能が安定した状態に達するように、データ収集を開始する前に20分 - 10を待ちます。 <ol><li>特定の実験によれば、刺激パラメータを選択し、データ収集を開始します。 例えば、千のMCD SMまで0デシベルまでまたは0.1から-40から緑色の光を使用する-2暗所視応答家族のために。 （ 図3を参照して、約1.3のCd SM -2 = 1デシベル） - （30 CDM -2 3）またはプローブフラッシュロッドが背景光によって抑制されなければならない明所録音で約2〜3対数単位明るく点滅を使用してください。 </li><li>しかし、正確な光強度値は、システム·キャリブレーションおよび実験条件に幾分依存する可能性があることを覚えておいてください。経験則として、スケール強度ダウン5による- 10倍の生体内と比較して、 </eM&gt;レコーディング緑色光17を使用して。 （市販アダプタシステムに含まれる）網膜上記開口を有するブラックカバーが試料ホルダに光散乱を減少させ、商業インビボ系の全体野球の両方によって網膜の均質と同じ刺激を容易にするために使用することができます。 注：暗順応網膜から記録のために、典型的な実験の漂白剤、顔料のごくわずかな割合で使用したテスト点滅の強度がするようにRPE主導の再生の欠如は問題ではありません。また、以前にコーン色素再生がまだミュラー細胞の視覚サイクル20を介して、単離された網膜中で行うことができることが示されています。 </li></ol></li><li>実験は数時間に30分まで、典型的持続として、これらの変化は、技術的な問題を示している可能性があるため、実験中ベースラインドリフト、ノイズレベルと応答性を監視します。 注：ノイズの増加または減少D応答振幅は、空気灌流または電極のチャネル内の気泡、低すぎる、または高温、液漏れ/流出または網膜の変位を示すことができます。 </li></ol> 4.クリーニング<ol><li>灌流ラインから試料ホルダーを外し、それを開いて、ろ紙から網膜を洗い流します。電極を取り外し、蒸留水（エタノールを使用していない）でそれらをすすぎます。エタノールおよび/または蒸留水で（灌流チャネルを含む）試料ホルダーを清掃してください。 &gt; 70％エタノールで慎重に同一平面灌流チューブ。 </li><li> （洗剤は使用しないでください）​​蒸留水で灌流ボトルを洗浄します。エタノールはまた、ボトルを洗浄するために使用することができます。 </li></ol>

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S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+mouse+cone-mediated+electroretinogram+during+light+adaptation.">Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation.</a> Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).</li></ol>

セントルイスのワシントン大学はXenotec社とのライセンス契約を締結しているし、ex vivoで 、アダプタの販売からロイヤリティを受け取ることができます。

<html>ここではex vivoで ERGアダプタと一緒にin vivoでの ERGシステムのコンポーネントを使用して、2つの単離されたマウス網膜から同時に高品質のex vivoでの ERG記録を得るための重要なステップを示しています。本研究では、同じ溶液（いずれかエイムズ&#39;、ロックのあるいはリンゲル）と動物の両方からの網膜を灌流が、薬物検査のために、別のソリューションの例で、それぞれの網膜を灌流することも可能です。高品質のデータを取得するための最も重要なステップは、高度な特注の試料ホルダを使用して、暗赤色（またはIR）の下で、すべてのサンプル調製手順を実行することにより、電磁ノイズ、網膜を注意深く解剖、安定した比較的速い灌流流れから遮蔽されています光。ここで説明する方法は、in vivoおよびex vivo ERG記録に実行するために、両方の網膜およびin vivoでの ERGのセットアップの二重使用をすぐに使用することができます。 _content &quot;&gt;最近、私たちの17で設計され、現在市販特注のex vivoでの ERGの試料ホルダーは、近位および網膜の遠位部分を効率的に電気的に分離することにより、SNRを改善し、網膜（高い溶液為替レート上記灌流の流れを最適化します。）ex vivoで ERG信号が遅い周波数ノイズ成分の欠如は、非常に小さな応答から定量分析を可能にするが、我々はex vivoでの記録は米国のAC電源ラインノイズ（60ヘルツの干渉をより受けやすいことがわかった。。50 in vivo実験よりもヨーロッパでヘルツ）。このノイズは、主に灌流ラインを介して信号に結合され、それは主に遮蔽（接地によって除去することができた）ファラデーケージまたは全体野球の外に存在するすべての灌流コンポーネント（瓶、チューブは） 。また、熱交換器と、このノイズを通してエキソビボ ERG信号に結合時々 60Hzのノイズも接地することによって除去することができました。&lt;/ P&gt; 我々は、3つの異なる生理的灌流培地（ 図2）と同じ網膜/実験における異なる細胞型の機能の解剖を可能にする実験中の灌流に薬理学的遮断薬を追加することによって、特定のERG信号成分を除去する方法を示します。最近の研究では、灌流媒体の選択は、単一細胞記録32における光受容体の生理機能に影響を与えることを示しました。ここでは、不在とERG信号（ 図2）の感光体成分を分離するために意図される薬理学的試薬の存在下での暗順応フラッシュ応答を記録するエイムズ」、ロックのと「HEPES-リンガー」メディアを使用していました。重炭酸塩緩衝溶液は1 mVにまで、大きくA及びB波振幅を与えました。 AmesRでは見られなかったブロッカーとロックの培地下での応答は複雑なリカバリー波形が含まれて感光体薄暗いフラッシュ（ 図2Dの挿入図を参照）17;またはリンガー灌流。 ex vivoでの ERGの使用は、より研究室によって適応になるとそれは別の信号成分を分離するために、同じ灌流媒体と、標準的な方法を使用することが有用であろう。この時点で、それが安定しており、大規模なA及びB波の振幅を与えるので、最も汎用性の高いオプションがエイムズ」媒体であると思われます。また、感光体の応答は、孤立した薬理学的には、このソリューションでは、単一の光受容体（ 図2E）から記録されたことを思わせる単純な波形を持っているように見えます。しかし、いくつかの未解決の問題は、インビボ条件下で観察された他のERG信号成分の存在について残ります。典型的には、in vivoでの ERG応答のb波の立ち上がり段階で観察されている150 Hzの振動波-たとえば、私たちのex vivoでの記録条件では、顕著な振動電位、100を見ていません。それは私たちのex vivoでの内網膜の機能ということが可能です</e大ex vivoで B波が双極細胞機能に対する実行可能な関与が、M&gt;の条件が侵害されました。今後の研究では、（解剖、灌流など）ここに示した実験プロトコルにおける改変は、私たちはex vivoでの条件で振動電位を記録することができるようになるかどうかを解決する必要があります。 コー​​ン機能は、私たちのビジョンのために不可欠です。しかし、コーンの調査は、特にマウスの網膜33にその小さなサイズと希少性によって妨げられています。そのM-コーンとロッドはほぼ同じスペクトル感度30を持っているので、円錐関数の単離は、マウスERG記録でさらに複雑になります。標準的なプロトコルは、ロッド抑制背景光を用いて、ロッドとコーン感受性との間のいくつかのログ単位の差を利用します。しかし、安定したバックグラウンド光は、ロッド34,35を脱感作し、桿体および錐体の間のギャップ結合の結合の調節を介して、おそらくコーン機能に影響を及ぼすことが知られています&lt;SUP&gt; 36,37。したがって、円錐に影響を与えることなく、飽和ロッドを維持するのに十分明るい背景光の強度を見つけることは困難です。ここでは、より低い感度と円錐19,29,30の迅速な復旧速度の両方を利用しています代替ダブルフラッシュ法を示しています。このようにして、真の暗順応コーン媒介性応答を分離することが容易です。私たちは、エイムズ」または遮断することなくロックのソリューションでは、回復波形の詳細はやや明るいプローブと試験フラッシュを使用することにより、実験の過程で影響を受けたことに気づきました。これは、円錐の応答を分離するためにサブトラクション分析を複雑。しかし、バリウムによってグリア成分を除去すると、変動がミュラー細胞成分によるものであったことを示す応答の尾部を安定させるのに役立ちました。このようにして、WTマウス（ 図3）に暗順応円錐駆動応答を得ることができました。ダブルフラッシュによって単離されたコーン応答ロッド17,37活動を抑制するために背景光を使用して、WTマウスから記録されたものと比較して、WTマウスからの技術が小さく見えました。この差は、徐々に（10分以内）背景光の十分に特徴付けられた効果によって説明することができ、おそらくコーン応答37-39の桿体媒介抑制の除去錐体応答の振幅を増強します。 要約すると、ここでの実証方法は、網膜の機能を研究することが可能にex vivoでの電気生理学的記録を行います。今後は、より多くの研究室では、動物と人間の網膜の生理学および病理学を研究し、網膜機能の理解を進めるためにして病気を失明するためのより良い治療法を開発、この強力な方法を適応させることを願っています。

電図（ERG）は、光によって誘発網膜の電気的活動を記録するために使用することができ、十分に確立された技術です。 ERG信号は、網膜の抵抗性の細胞外空間に流れる（感光体と双極細胞の軸に沿って）半径方向の電流による電圧変化によって主に生成されます。最初のERG信号はフィッシュアイ1の表面からホルムグレンによって1865年に記録しました。アイントホーフェンとジョリー1908 2は、双極細胞ON、今主に光受容体の活性を反映することが知られている3つの異なるA-と呼ばれる波、B-、およびc波、への光の発症にERG応答を分割し、色素上皮細胞、それぞれ3-8。 ERGは、単離された眼用調製物9から、単離された無傷の網膜（ エキソビボ ）3,10-15間または微小電極を有する特定の網膜層にわたって、（ インビボ ）麻酔した動物またはヒトの目から記録することができます（ローカルERG）4,16。これらの中で、in vivoでの ERGは、現在、網膜機能を評価するために最も広く用いられている方法です。これは、診断目的のために使用することができ、あるいは、動物または患者における網膜疾患の進行を追跡するために非侵襲的な技術です。しかし、in vivoでの ERG記録は、多くの場合、外眼生理学的ノイズ（ 例えば、呼吸や心臓活動）によって汚染された、いくつかの重複する構成要素との複雑な信号を生成します。 ローカルERGは網膜の特定の層を横切って信号を記録するために使用することができるが、それは、最も侵襲性であり、他のERG記録の構成と比較して最も低い信号対雑音比（SNR）を有しています。ローカルERGも技術的に厳しいですし、高価な機器（ 例えば、顕微鏡とマイクロマニピュレータ）が必要です。無傷の、単離された網膜からTransretinal ERG（ex vivoでの ERG）は、インビボで安定した可能ローカルERG方法とHIGとの間の妥協を提供しています動物又はヒト17の無傷の網膜からのH SNRの録音。最近では、この方法は、哺乳動物、霊長類およびヒト網膜18-20に桿体および錐体光受容体の機能を研究するために首尾よく使用されています。また、原因エクスビボ網膜色素上皮が存在しないために、ERG信号の正のC波成分が除去され、顕著な負の遅いPIII成分は、ex vivoでの記録で明らかにされています。遅いPIII成分は網膜21-23におけるミュラーグリア細胞の活性に由来することが示されています。従って、 エキソビボ ERG方法も、無傷網膜におけるミュラー細胞を研究するために使用することができます。いくつかの研究はまた、 エクスビボで ERG記録が網膜24の周りの薬剤の濃度を測定し、薬物25-27の安全性及び有効性を試験するために使用され得ることを示しました。 複数の商業的なインビボ系が入手可能であり、必ずしも大規模な電気生理学的背景を持っていない多くの研究室で使用されます。これとは対照的に、ex vivoでのデバイスは、最近17まで利用されていないと、結果としてごく少数の研究室では、現在、この強力な技術を活用しています。これは、網膜の生理学および病理学についての知識を進めるために、および疾患を失明するための新しい治療法を開発するために、より多くの研究室へのex vivoでの ERG記録を利用できるようにすることが有益であろう。ここでは、単純で手頃な価格のエキソビボ ERG装置17を示し、それは棒状とコーン媒介シグナルを記録するために、いくつかの市販のin vivoでの ERGシステムと組み合わせて使用することができる方法を示す（A及びB波）と機能無傷の野生型マウスの網膜からミュラー細胞（PIIIを遅らせます）。

<table><tbody><tr><td>&lt;i&gt;In vivo&lt;/i&gt; ERG system</td><td>OcuScience</td><td>HMsERG</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ocuscience.us/id77.html&quot;&gt;www.ocuscience.us/id77.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;i&gt;In vivo&lt;/i&gt; ERG system</td><td>LKC Technologies</td><td>UTAS-E 3000</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html&quot;&gt;www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;i&gt;Ex vivo&lt;/i&gt; adapter</td><td>OcuScience</td><td>Ex VIVO ERG adapter</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ocuscience.us/id107.html&quot;&gt;www.ocuscience.us/id107.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>North Central Instruments</td><td>Leica M80</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ncimicro.com/store/ListProduct.asp?bSub=T&amp;amp;idCategory=27&quot;&gt;May use any brand&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>IR emitter</td><td>Opto Diode Corp.</td><td>OD-50L</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.optodiode.com/&quot;&gt;www.optodiode.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Prowler Night Vision Scopes</td><td>B.E. Meyers Electro Optics</td><td>D4300-I</td><td>Military grade product.</td></tr><tr><td>Red filter</td><td>Rosco Laboratories</td><td>Roscolux #27 Medium Red</td><td>May be used instead of IR system</td></tr><tr><td>Red head light</td><td>OcuScience</td><td>ERGX011</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ocuscience.us/catalog/i29.html&quot;&gt;www.ocuscience.us/catalog/i29.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>WPI, Inc.</td><td>500086</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.wpiinc.com/&quot;&gt;www.wpiinc.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Dumont tweezers #5</td><td>WPI, Inc.</td><td>14101</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72000</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emsdiasum.com/&quot;&gt;www.emsdiasum.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Scale</td><td>Metler Toledo</td><td>AB54-S/FACT</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/&quot;&gt;May use any brand&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>pH meter and electrode</td><td>Beckman Coulter</td><td>pHI 350</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/&quot;&gt;May use any brand&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60129</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/&quot;&gt;May use any brand&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63020</td><td>1.0 M solution</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21114</td><td>1.0 M solution</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>Ames medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>BaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0750</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>DL-AP4</td><td>Tocris Bioscience</td><td>101</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>Succinic acid disodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224731</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>L-Glutamic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2834</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>Leibovitz culture medium L-15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4386</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>MEM vitamins</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>MEM amino acids</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5550</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>UN3156</td><td>5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr></tbody></table>

simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

我々は、実験プロトコル上述の異なる標準灌流液（ 図2）を用いて、 図1に示しに従って、暗順応の野生型（WT）C57BL / 6マウスの網膜からフラッシュ応答を記録しました。応答波形と速度だけでなく、桿体の感度はエイムスの類似しているように見えた」とロックのメディア（ 図2AおよびB）。一方、HEPES緩衝リンガー液（重炭酸塩なしまたは5％CO 2/95％O 2）下での応答振幅が有意に小さかったです。また、これらの条件にb波の安定性が損なわれたことがわかりました。 40μMのAPB（DL-AP4）を追加すると、すべての3つのメディア（ 図2D-F）で効率的にポジティブb波を除去します。 b波の除去は、ミュラー細胞活性21に起因している大規模な低速負の波（ 図2D）を明らかにしました。 100を追加します＃956;バリウムのMは、ex vivo ERG信号（ 図2D-F）の光受容体応答を明らかにし、このコンポーネントを無効にしました。最大応答はリンガー灌流下で典型的には約200μVだったのに対し、我々は、エイムズ &#39;とロックの中の1 mVの飽和感光回答まで記録可能性があります。 錐体光受容体の応答は、ロッドを飽和明るいプローブフラッシュは、コーンは、その暗順応状態を回復しているが、ロッドは19,29飽和まま時のテスト発光が続いている、いわゆるダブルフラッシュ技術により、以前に単離されています。ここでは、バリウム100μMのではなく、ダブルフラッシュ技術を使用して、DL-AP4（ 図3）を補充したエイムズのメディアに円錐媒介ERG応答（A及びB波の両方を含む）を単離しました。バリウムは、特にbrighを繰り返し使用時に応答より変動の後半部分を作るために登場遅いグリア成分を除去するために使用されましたTが点滅します。我々は、コーン応答を誘発するために300ミリ秒プローブフラッシュ後のロッド、可変テストが点滅を飽和させるために、一定のプローブのフラッシュを使用していました。 「プローブ+試験フラッシュ」反応からプローブフラッシュ応答を差し引いた錐体応答ファミリーは、 図3Bに示されています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52855/52855fig1.jpg" /> 電極チャネルの図1 エキソビボ ERGの試料ホルダを使用する。（A）充填し、電極対間の抵抗と電圧を測定することにより、解剖前に組み立てられた試料ホルダの電極の取り付け（B）試験。（C）取付け試料ホルダでろ紙上の網膜。（D）商業ERG SYにおける灌流ラインとERG増幅器に接続された試料ホルダのステム。灌流流路は青色の矢印で示されている。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52855/52855fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52855/52855fig2.jpg" /> 図2.フラッシュ応答ロックの（A）で灌流暗順応のWTマウス網膜から記録家族、エイムズ&#39;（B）、およびHEPES緩衝リンガー（C）培地。フラッシュは（-0.9ログ（カドミウムSM -2）、緑色光（530 nm）に-36からに-9 dB以上-3.6）3、40、130、390および1400光子ミクロンを-2配信しました。 （DF）の黒のトレースは、40μMAPBおよび100μMのバリウムの添加後（AC）で網膜から記録応答を示します。 （A）に網膜から記録された（D）を示す応答の赤のトレース<html>ロックの40μMのAPBではなく、バリウムを補っで灌流。挿入図は、APBとバリウムを含むロックのメディアで3最も暗いフラッシュに対する応答を示しています。点滅は、3〜1400光子からミクロン-2（-36からに-9 dBの緑の光）における（E）、7 -2μmの光子14,000（D）中の（-32からdBの緑色の光1）の範囲でしたと（F）で7〜1400光子ミクロン-2（-32から-9 dBの緑色の光）から。 Vinberg ら 2014 17とLyubarsky らを参照してください。1999年30年と2004年31 CdのSMに与えられた明所光量を変換-2光子ミクロンに-2の詳細については。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52855/52855fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> ロード/ 52855 / 52855fig3.jpg &quot;/&gt; WTマウスでダブルフラッシュ法とコーン応答の図3.単離（A）フラッシュ（14,000光子ミクロン-2または1デシベル緑の光、黒）および試験フラッシュに続くフラッシュをプローブに対する応答をプローブに対する応答（81,000光子ミクロン-2または9デシベル緑色光、赤色）。360 81,000に光子ミクロンの範囲の点滅をテストするために、（B）コーンフラッシュ応答-2（-14〜10 dBの緑の光）」からのプローブフラッシュ応答を減算することによって単離しましたプローブ+テストフラッシュ」応答。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52855/52855fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

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Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

同時<em&gt; ex vivoで</emによる二つの網膜の&gt;機能テスト<em&gt; in vivoで</em&gt;電図システム

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

simultaneous-ex-vivo-functional-testing-two-retinas-vivo

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

9.1K ビュー.  Washington University in St. Louis. Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

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Multifocal Electroretinograms

A limitation of traditional full-field electroretinograms (ERG) for the diagnosis of retinopathy is lack of sensitivity. Generally, ERG results are normal unless more than approximately 20% of the retina is affected. In practical terms, a patient might be legally blind as a result of macular degeneration or other scotomas and still appear normal, according to traditional full field ERG. An important development in ERGs is the multifocal ERG (mfERG). Erich Sutter adapted the mathematical sequences called binary m-sequences enabling the isolation from a single electrical signal an electroretinogram representing less than each square millimeter of retina in response to a visual stimulus1.
Results that are generated by mfERG appear similar to those generated by flash ERG. In contrast to flash ERG, which best generates data appropriate for whole-eye disorders. The basic mfERG result is based on the calculated mathematical average of an approximation of the positive deflection component of traditional ERG response, known as the b-wave1. Multifocal ERG programs measure electrical activity from more than a hundred retinal areas per eye, in a few minutes. The enhanced spatial resolution enables scotomas and retinal dysfunction to be mapped and quantified.
In the protocol below, we describe the recording of mfERGs using a bipolar speculum contact lens.
Components of mfERG systems vary between manufacturers. For the presentation of visible stimulus, some suitable CRT monitors are available but most systems have adopted the use of flat-panel liquid crystal displays (LCD). The visual stimuli depicted here, were produced by a LCD microdisplay subtending 35 - 40 degrees horizontally and 30 - 35 degrees vertically of visual field, and calibrated to produce multifocal flash intensities of 2.7 cd s m-2. Amplification was 50K. Lower and upper bandpass limits were 10 and 300 Hz. The software packages used were VERIS versions 5 and 6.

The development of the multifocal electroretinogram (mfERG) is an important advance in the diagnosis and characterization of retinopathy. Multifocal electroretinograms are a mathematical average of an approximation of a b-wave. Software programs can derive ERGs from more than a hundred retinal areas in a few minutes per eye. Scotomas and retinal dysfunction can be mapped and quantified.

多発性電図

A limitation of traditional full-field electroretinograms (ERG) for the diagnosis of retinopathy is lack of sensitivity.  Generally, ERG results are ...

医学

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light whereas cones operate continuously under rapidly changing bright light conditions. Absorption of light by rod- and cone-specific visual pigments in the outer segments of photoreceptors triggers a phototransduction cascade that eventually leads to closure of cyclic nucleotide-gated channels on the plasma membrane and cell hyperpolarization. This light-induced change in membrane current and potential can be registered as a photoresponse, by either classical suction electrode recording technique1,2 or by transretinal electroretinogram recordings (ERG) from isolated retinas with pharmacologically blocked postsynaptic response components3-5. The latter method allows drug-accessible long-lasting recordings from mouse photoreceptors and is particularly useful for obtaining stable photoresponses from the scarce and fragile mouse cones. In the case of cones, such experiments can be performed both in dark-adapted conditions and following intense illumination that bleaches essentially all visual pigment, to monitor the process of cone photosensitivity recovery during dark adaptation6,7. In this video, we will show how to perform rod- and M/L-cone-driven transretinal recordings from dark-adapted mouse retina. Rod recordings will be carried out using retina of wild type (C57Bl/6) mice. For simplicity, cone recordings will be obtained from genetically modified rod transducin &alpha;-subunit knockout (T&alpha;-/-) mice which lack rod signaling8.

We describe a relatively simple method of transretinal electroretinogram (ERG) recordings for obtaining rod and cone photoresponses from intact mouse retina. This approach takes advantage of the block of synaptic transmission from photoreceptors to isolate their light responses and record them using field electrodes placed across the isolated flat-mounted retina.

マウス網膜からERG Transretinal·レコーディング：ロッドとコーンの光応答

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

神経科学

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

無傷の網膜におけるGFP発現細胞集団の電気生理学的特性

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain the overall health and structural integrity of the photoreceptors. The RPE is polarized, exhibiting apically and basally located receptors or channels, and performs vectoral transport of water, ions, metabolites, and secretes several cytokines.
In vivo noninvasive measurements of RPE function can be made using direct-coupled ERGs (DC-ERGs). The methodology behind the DC-ERG was pioneered by Marmorstein, Peachey, and colleagues using a custom-built stimulation recording system and later demonstrated using a commercially available system. The DC-ERG technique uses glass capillaries filled with Hank&#8217;s buffered salt solution (HBSS) to measure the slower electrical responses of the RPE elicited from light-evoked concentration changes in the subretinal space due to photoreceptor activity. The prolonged light stimulus and length of the DC-ERG recording make it vulnerable to drift and noise resulting in a low yield of useable recordings. Here, we present a fast, reliable method for improving the stability of the recordings while reducing noise by using vacuum pressure to reduce/eliminate bubbles that result from outgassing of the HBSS and electrode holder. Additionally, power line artifacts are attenuated using a voltage regulator/power conditioner. We include the necessary light stimulation protocols for a commercially available ERG system as well as scripts for analysis of the DC-ERG components: c-wave, fast oscillation, light peak, and off response. Due to the improved ease of recordings and rapid analysis workflow, this simplified protocol is particularly useful in measuring age-related changes in RPE function, disease progression, and in the assessment of pharmacological intervention.

Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Here, we present a method for recording light-evoked electrical responses of the retinal pigment epithelium (RPE) in mice using a technique known as DC-ERGs first described by Marmorstein, Peachey, and colleagues in the early 2000s.

マウス網膜色素上皮の光誘発電気応答を記録するための直接結合電解電解(DC-ERG)

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain ...

化学

Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the retina. The ERG is a sensitive measure of changes in retinal function that are pan-retinal, but is less effective for detecting damage confined to a small area of retina. In the present work we describe how to record the &#8216;flash&#8217; ERG, which is the potential generated when the retina is exposed to a brief light flash. We describe methods of anaesthesia, mydriasis and corneal management during recording; how to keep the retina dark adapted; electrode materials and placement; the range and calibration of stimulus energy; recording parameters and the extraction of data. We also describe a method of inducing ischemia in one limb, and how to use the ERG to assess the effects of this remote-from-the-retina ischemia on retinal function after light damage. A two-flash protocol is described which allows isolation of the cone-driven component of the dark-adapted ERG, and thereby the separation of the rod and cone components. Because it can be recorded with techniques that are minimally invasive, the ERG has been widely used in studies of the physiology, pharmacology and toxicology of the retina. We describe one example of this usefulness, in which the ERG is used to assess the function of the light-damaged retina, with and without a neuroprotective intervention; preconditioning by remote ischemia.

The electroretinogram (ERG) is an electrical potential generated by the retina in response to light. This paper describes how to use the ERG to assess retinal function, in dark-adapted rats, and how it can be can be used to assess a neuroprotective intervention, in the present case remote ischemic preconditioning.

齧歯類網膜とリモート四肢虚血プレコンディショニングの保護効果に機能を評価するために電図を用いて、

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the ...

Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats

The electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are commonly used to assess the integrity of the visual pathway. The ERG measures the electrical responses of the retina to light stimulation, while the VEP measures the corresponding functional integrity of the visual pathways from the retina to the primary visual cortex following the same light event. The ERG waveform can be broken down into components that reflect responses from different retinal neuronal and glial cell classes. The early components of the VEP waveform represent the integrity of the optic nerve and higher cortical centers. These recordings can be conducted in isolation or together, depending on the application. The methodology described in this paper allows simultaneous assessment of retinal and cortical visual evoked electrophysiology from both eyes and both hemispheres. This is a useful way to more comprehensively assess retinal function and the upstream effects that changes in retinal function can have on visual evoked cortical function.

This protocol describes simultaneous measurement of electroretinogram and visual evoked potentials in anesthetized rats.

麻酔ラットにおける電図および視覚誘発電位の同時記録

The electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are commonly used to assess the integrity of the visual pathway. The ERG measures the ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in retinal diseases, and testing therapeutic interventions. The ex vivo electroretinogram (ERG) allows the quantification of contributions from individual cell types in the isolated retina by addition of specific pharmacological agents and evaluation of tissue-intrinsic changes independently of systemic influences. Retinal light responses can be measured using a specialized ex vivo ERG specimen holder and recording setup, modified from existing patch clamp or microelectrode array equipment. Particularly, the study of ON-bipolar cells, but also of photoreceptors, has been hampered by the slow but progressive decline of light responses in the ex vivo ERG over time. Increased perfusion speed and adjustment of the perfusate temperature improve ex vivo retinal function and maximize response amplitude and stability. The ex vivo ERG uniquely allows the study of individual retinal neuronal cell types. In addition, improvements to maximize response amplitudes and stability allow the investigation of light responses in retina samples from large animals, as well as human donor eyes, making the ex vivo ERG a valuable addition to the repertoire of techniques used to investigate retinal function.

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Modification of existing multielectrode array or patch clamp equipment makes the ex vivo electroretinogram more widely accessible. Improved methods to record and maintain ex vivo light responses facilitate the study of photoreceptor and ON-bipolar cell function in the healthy retina, animal models of eye diseases, and human donor retinas.

大小眼の網膜機能を研究するための Ex Vivo 網膜電図のセットアップと条件の最適化

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in ...

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular cells. Isolating, culturing, and sustaining retinal neurons in vitro have technical and biological limitations. Culturing retinal explants may overcome these limitations and offer a unique ex vivo model to study the cross-talk between various retinal cells with well-controlled biochemical parameters and independent of the vascular system. Moreover, retinal explants are an effective screening tool for studying novel pharmacological interventions in various retinal vascular and neurodegenerative diseases such as diabetic retinopathy. Here, we describe a detailed protocol for retinal explants' isolation and culture for an extended period. The manuscript also presents some of the technical problems during this procedure that may affect the desired outcomes and reproducibility of the retinal explant culture. The immunostaining of the retinal vessels, glial cells, and neurons demonstrated intact retinal capillaries and neuroglial cells after 2 weeks from the beginning of the retinal explant culture. This establishes retinal explants as a reliable tool for studying changes in the retinal vasculature and neuroglial cells under conditions that mimic retinal diseases such as diabetic retinopathy.

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

This protocol presents and describes steps for the isolation, dissection, culturing, and staining of retinal explants obtained from an adult mouse. This method is beneficial as an ex vivo model for studying different retinal neurovascular diseases such as diabetic retinopathy.

網膜神経血管疾患研究のための ex vivo モデルとしての成体マウス網膜網膜の外植片

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular ...

Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

<a href='https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61970/transpupillary-two-photon-in-vivo-imaging-of-the-mouse-retina'>Source: Wang, Z., et al.&#160;Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp.&#160;(2021).</a>This video demonstrates a technique for in vivo retinal imaging using two-photon microscopy. Anesthetized mice are prepared for imaging by securing their heads, Applying eye lubricant, and placing a coverslip over the eye. Retinal ganglion cells (RGCs) expressing fluorescent proteins are first visualized using epifluorescence for alignment. Finally, two-photon imaging is employed, allowing for high-resolution visualization of RGCs.

Source: Wang, Z., et al.&#160;Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp.&#160;(2021).This video demonstrates a technique ...

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