Name: simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system
Uploaded: 2015-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי NIH EY019312 מענקים וEY021126 (VJK), EY002687 למחלקת העיניים ומדעים חזותיים באוניברסיטת וושינגטון, ועל ידי מחקר למניעת עיוורון.

כל פרוטוקולי הניסוי היו בהתאם המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי ועדת בעלי החיים המחקרים המוסדית באוניברסיטת וושינגטון. 1. הגדרה מחזיק זלוף והדגימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון לזלוף הרשתית טרי ביום של הניסוי. השתמש במים מזוקקים וללא יונים. השתמש באחד משלושת הפתרונות הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן יקרבונט המכיל &#39;הפתרון (1 ליטר): 1 בקבוק איימס&#39; איימס התקשורת ו1.9 גרם של NaHCO 3, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון של לוק (מ&quot;מ): 112.5 NaCl, 3.6 KCl, 2.4 MgCl 2, 1.2 CaCl 2, 10.0 HEPES, 20.0 3 NaHCO, 3.0 Na succinate, 0.5 גלוטמט Na, 0.02 EDTA, ו10.0 גלוקוז, ויטמיני ממ 0.1% ואמין חומצות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון HEPES שנאגר להכין רינגר (מ&quot;מ): 133.3 NaCl, 3.3 KCl, 2.0 MgCl 2, 1.0 CaCl 2, 10.0 גלוקוז, 0.01 EDTA, 12.0 HEPES, pHמותאם ל7.5 עם ~ 5.8 מיליליטר של 1 M NaOH, להוסיף L-15 0.72 גר &#39;/ בינוני תרבות L ליבוביץ. השתמש 20-50 מיקרומטר DL-AP4 ו50-100 מיקרומטר BaCl 2 לבודד את תגובת קולטי האור בכל מדיה זלוף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון לאלקטרודות 28 (מ&quot;מ): 140.0 NaCl, 3.6 KCl, 2.4 MgCl 2, 1.2 CaCl 2, 3 HEPES, 0.01 EDTA ולהתאים את ה- pH ל7.4-7.5 עם NaOH. פתרון אלקטרודה ניתן לאחסן ב RT במשך כמה חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין ולבדוק את בעל הדגימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דבק נייר שחור / אפור מסנן על גבי הכיפות של חלק התחתון של בעל הדגימה (ראה איור 1 א). מורחים דבק אפוקסי 5 דקות שני מרכיבים בזהירות מסביב לקצוות של צמרות שטוחות של הכיפות. אם יש צורך, לעשות את זה תחת מיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה עד שהדבק הוא (כ -4 דקות) כמעט יבשות ולחץ על נייר הסינון על הכיפות באמצעות פריט שטוח. נייר סינון דבק לפחות יום אחד לפני הניסוי.נייר סינון ניתן להשתמש מספר פעמים אבל יש להחליף אחרי חודש של הקלטות. השתמש 70% אתנול לנקות כיפות בזהירות מכל שאריות דבק לפני התקנת נייר ההחלפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את ערוצי אלקטרודה עם פתרון אלקטרודה מנסה להימנע מכל בועות אוויר ולדפוק אלקטרודות גלולה סגורות עם מתאם הברגה לערוצי אלקטרודה (ראה איורים 1 א &#39;וב&#39;). חבר את החתיכות העליונה ותחתונים של בעל הדגימה עם ארבעה ברגים ולמלא את שורות זלוף עם פתרון אלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את ההתנגדות ומתח בין המוביל של כל זוג האלקטרודה באמצעות מודד (איור 1). התנגדות צריכה להיות מתחת ל -100 Ωk והמתח מתחת ל -10 mV אם הערוצים ללא בועה ואלקטרודות נמצאות במצב טוב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 400-700 מיליליטר של תקשורת זלוף בבקבוק הזכוכית. נפרד עוד 300 מיליליטר לשימוש בנתיחה של הרשתית ושלקרע אותו במקרר. הגדר את צינורות טפטוף בבלוק מחליף חום ולמקם את הבלוק שחומם מראש על צלחת החימום (ראה איור 1D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקף את הבקבוק עם מכסה שיש לו קשרים ל- CO 2 / O 2 גז (אם לוק של איימס &quot;או משמש) ולצינורות טפטוף (ראה איור 1D). מחממים את הבקבוק עם התקשורת עד 37 מעלות צלסיוס ולמקם אותו על צלחת החימום או על החלק העליון של יחידת גירוי האור באמבט מים מוגדר 37 - C 39 O 17. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש קווי זלוף על ידי מילוי אותם עם תקשורת זלוף ליזום הזרימה מונעת כוח המשיכה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במערכת LKC, הנח את הבקבוק בחלק העליון של יחידת ממריץ 17 כדי לספק זרימה הכבידתית משמעותית שמותאמת לאחר מכן על ידי רגולטורי זרימת שיעור בלי שהושפע מרמת ההפחתה של פתרון זלוף בבקבוק במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במערכת Ocuscience, למקם את pבקבוק erfusion בתוך כלוב פאראדיי כדי למזער את הרעש ואת מקום קווי פלט זלוף ארוך מבעל הדגימה (ראה שלב 2.8) הרבה מתחת לרמתו של בעל הדגימה (ובקבוק זלוף) כדי להגדיל את כונן הכבידה של הפתרון. להגן על קווי פלט אלה ולחבר את המגן לקרקע של המגבר כדי למנוע צימוד של רעש האלקטרומגנטים לאות ERG. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את זלוף - 3 5 מיליליטר / דקה באמצעות רגולטורי ספיקה. חבר 2/95% גז 5% CO 2 O מגליל עם רגולטור נכון ולהתאים את קצב הזרימה על מנת להבטיח מבעבע קבועה של התקשורת בבקבוק באמצעות אבן אוויר. </li></ol> הכנת 2. דוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב מכשירי נתיחה נקיים וחדים כולל microscissors ישר-להב, אחד או שתיים 45 o פינצטה, סכין גילוח ופיסת נייר סינון מלבני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים כ -200 מיליליטר של perfu הקרפתרון שיאון בצלחת פטרי גדולה כל כך שכל החלק התחתון של בעל הדגימה (כולל כיפות) יכול להיות שקוע בפתרון. צעד זה הופך להיות חשוב כאשר ההרכבה הרשתית על הכיפות (ראה שלב 2.6). למרות כמה פתרונות נועדו להיות רווי בcarbogen (5% CO 2/95% O 2), זה לא חיוני לצורך הנתיחה ולא נעשה בניסויים שתוארו כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניסוי טיפוסי, לשמור על בעלי חיים ב12/12 שעות אפלים מחזור האור / וכהה להתאימם ל6-12 שעות לפני ההקלטות. להרדים את החיה משאיפת CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם תחת אור אדום עמום ולעשות את כל ההליכים תחת אור אדום או IR העמום הבאים (השתמש למשל, מסנן אדום מול מקור מיקרוסקופ האור). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את העיניים החוצה באמצעות פינצטה ולשים אותם בתקשורת. מניחים עין אחת בכל פעם על פיסת נייר קטנה (למשל, כמה נייר סינון רגיל) ולעשות כהדליק כ ברמה של serrata אורה תוך החזקת עין עם פינצטה (זה נעשה מחוץ לפתרון כאן). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך לאורך serrata אורה (או קרוב יותר לקו המשווה של העין) עם microscissors ולהסיר את הקרנית והעדשה. מניחים את כוס עין בתקשורת הקרה בצלחת פטרי הגדולה וחזור על אותו התהליך עם העין השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך חתך קטן מהחלק העליון של כוס עין לכיוון עצב הראייה על ידי שמירה על המספריים בין הרשתית ולובן העין על מנת לשמור על הרשתית כשלמה ככל האפשר. אחיזה בלובן העין משני צידי החתך באמצעות שתי פינצטה ולמשוך את פינצטה אחד משני כדי לנתק את הרשתית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את עצב הראייה ולנסות לבודד את הרשתית עם כמות מינימאלית של מגע פיזי אל פני השטח דיסטלי. הרשתית תהיה בעיקר לנתק באופן אוטומטי מהרשתית במהלך תהליך הנתיחה. חשוב יותר, כדי למנוע הפרעה מכאנית של הרשתית מאשר לבצענתיחה במהירות, בדרך כלל ניתן מודגרות רשתית לפחות 30 דקות בפתרון ללא השפעה משמעותית על מאפייני התגובה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הרשתית על הכיפות של בעל הדגימה (איור 1 ג). לטבול את החלק התחתון של בעל הדגימה בצלחת פטרי עם הרשתיות גזור. חלק את הרשתית, צד קולטי האור (המשטח הקמור של הרשתית המבודדת) כלפי מעלה, מעל לכיפה ולהרים את בעל הדגימה כך שהרשתית מצרפת על נייר הסינון. חזור על התהליך עבור הרשתית אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את צלחת בעל בזהירות כדי למנוע crosstalk החשמלי בין הרשתיות כמו גם הסטת רעש ואות. יש בעל דגימת O- טבעות סביב כיפות חלק התחתונה כדי למנוע דליפת פתרון בין התחתית והחלקים העליונים של בעל, כמו גם לעזור לבידוד חשמלי של הצדדים קולטי האור ותא גנגליון של הרשתית בודדת. צרף את החלק העליון של בעל עם ארבעה ברגים (ראה איור 1) ולמלא את ערוצי זלוף עם פתרון זלוף באמצעות מזרק ומחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את בעל הדגימה ליד הבלוק מחליף החום ולחבר את קווי קלט והפלט זלוף לבעל הדגימה (1D איור). חבר את האלקטרודות למגבר ERG (אלקטרודות העליונה להתחבר לאדמה / מינוס הסיכה במגבר) ולצרף את יחידת ממריץ / שליטה בבעל הדגימה באמצעות מתאם או להחליק את כרית החימום ליחידת ממריץ תלוי באיזה in vivo משמשת מערכת ERG. </li></ol> 3. הקלטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הגדרות מגבר וגירוי באמצעות התוכנה של מערכת in vivo. הגדר את תדירות הרכישה לערך בין 1 kHz ו -10 ונמוך לעבור סינון 300 הרץ. אל תשתמש בסינון גבוה לעבור. השתמש 60 הרץ (או 50 הרץ באירופה) לחרוץ מסנן במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא בסיס ללא גירוי ושנינות אורh גירוי עמום (למשל., אור הירוק של -35 dB או 0.3 מ&quot;ר MCD -2) לבדיקת חיבור חשמלי טוב בין האלקטרודות ומדגם רשתית. חכה 10 - 20 דקות לפני תחילת איסוף הנתונים, כך שטמפרטורה ובתפקוד רשתית להגיע למצב יציב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פרמטרים גירוי פי כל ניסוי ספציפי ולהתחיל איסוף הנתונים. לדוגמא, משתמשת באור ירוק מ -40 עד 0 dB או מ0.1 עד 1,000 מ&quot;ר MCD -2 למשפחת תגובת scotopic. השתמש על 2 עד 3 יומן-יחידות בהירות הבזקים בהקלטות photopic בי מוטות צריכה להיות מורחק על ידי אור הרקע (3-30 CDM -2) או הבזק בדיקה (מ&quot;ר על 1.3 Cd -2 = dB 1, ראה איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זאת, יש לזכור כי ערכי עוצמת אור המדויקים עשויים להיות מעט תלויים בכיול המערכת ותנאי ניסוי שלך. ככלל אצבע, בעוצמות בקנה מידה על ידי 5-10 פי לעומת in vivo </eמ &#39;&gt; הקלטות בעת שימוש באור ירוק 17. כיסוי שחור עם פתחים מעל הרשתית (הכלולה במערכת המתאם המסחרית) ניתן להשתמש כדי להפחית את פיזור אור בבעל הדגימה ולהקל גירוי אחיד ושווה של שני הרשתיות על ידי כדור Ganzfeld של במסחר vivo מערכות. הערה: להקלטות מרשתית כהה מותאם, בעוצמות של הבזקי בדיקה המשמשים באקונומיקת ניסוי טיפוסית חלק זניח בלבד של פיגמנט, כך שחוסר ההתחדשות מונעת הרשתית היא לא בעיה. בנוסף, זה כבר הראה בעבר כי התחדשות פיגמנט החרוט עדיין יכולה להתרחש ברשתית המבודדת באמצעות תא מולר המחזור 20 החזותי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כניסויים יימשכו בדרך כלל בין 30 דקות עד כמה שעות, לפקח להיסחף בסיסיים, רמת רעש ויציבות תגובה במהלך הניסוי כשינויים באלה עלולים להצביע על בעיות טכניות. רעש מוגבר או ירידה: הערהאמפליטודות תגובת ד עשויה להצביע על בועות אוויר בערוצי זלוף או אלקטרודה, טמפרטורה נמוכה מדי או גבוהה, פתרון דליפה / שפך או עקירה של הרשתית. </li></ol> 4. ניקוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את בעל דגימה מקווי זלוף, לפתוח אותו ולשטוף את הרשתית מנייר הסינון. הסר את האלקטרודות ולשטוף אותם במים מזוקקים (לא משתמש באתנול). נקה את בעל הדגימה (כולל ערוצי זלוף) עם אתנול ו / או מים מזוקקים. צינורות סומק זלוף בזהירות עם&gt; 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את בקבוק זלוף עם מים מזוקקים (לא משתמש בחומרי ניקוי). אתנול יכול לשמש גם כדי לנקות את הבקבוק. </li></ol>

<ol>
	<li>Armington, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Electroretinogram. , (1974).</li><li>Einthoven, W., Jolly, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+form+and+magnitude+of+the+electrical+response+of+the+eye+to+stimulation+by+light+at+various+intensities.">The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities.</a> Q J Exp Physiol. 1, 43 (1908).</li><li>Granit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+components+of+the+retinal+action+potential+in+mammals+and+their+relation+to+the+discharge+in+the+optic+nerve.">The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve.</a> J. Physiol. 77, 207-239 (1933).</li><li>Penn, R. D., Hagins, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transmission+along+retinal+rods+and+the+origin+of+the+electroretinographic+a-wave.">Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave.</a> Nature. 223, 201-204 (1969).</li><li>Stockton, R. A., Slaughter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-wave+of+the+electroretinogram.+A+reflection+of+ON+bipolar+cell+activity.">B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity.</a> J. Gen. Physiol. 93, 101-122 (1989).</li><li>Robson, J. G., Frishman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+linearity+and+kinetics+of+the+cat+retina:+the+bipolar+cell+component+of+the+dark-adapted+electroretinogram.">Response linearity and kinetics of the cat retina: the bipolar cell component of the dark-adapted electroretinogram.</a> Vis. Neurosci. 12, 837-850 (1995).</li><li>Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dissection+of+the+electroretinogram+from+the+isolated+rat+retina+with+microelectrodes+and+drugs.">A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs.</a> Vis. Neurosci. 16, 727-741 (1999).</li><li>Steinberg, R. H., Schmidt, R., Brown, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+responses+to+light+from+cat+pigment+epithelium:+origin+of+the+electroretinogram+c-wave.">Intracellular responses to light from cat pigment epithelium: origin of the electroretinogram c-wave.</a> Nature. 227, 728-730 (1970).</li><li>Wilson, W. S., Shahidullah, M., Millar, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bovine+arterially-perfused+eye:+an+in+vitro+method+for+the+study+of+drug+mechanisms+on+IOP,+aqueous+humour+formation+and+uveal+vasculature.">The bovine arterially-perfused eye: an in vitro method for the study of drug mechanisms on IOP, aqueous humour formation and uveal vasculature.</a> Curr. Eye Res. 12, 609-620 (1993).</li><li>Frank, R. N., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+photoproducts:+effects+on+electroretinogram+sensitivity+in+isolated+perfused+rat+retina.">Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina.</a> Science. 161, 487-489 (1968).</li><li>Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependence+of+rod+photoresponses+from+the+aspartate-treated+retina+of+the+frog+(Rana+temporaria).">Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria).</a> Acta Physiol. Scand. 134, 535-541 (1988).</li><li>Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+properties+of+a+new+isolated+rat+retina+preparation.">Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation.</a> Vision Res. 39, 2165-2177 (1999).</li><li>Hamasaki, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+sodium+ion+concentration+on+the+electroretinogram+of+the+isolated+retina+of+the+frog.">The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog.</a> J. Physiol. 167, 156-168 (1963).</li><li>Luke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+perfused+bovine+retina--a+sensitive+tool+for+pharmacological+research+on+retinal+function.">The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 16, 27-36 (2005).</li><li>Bastian, B. L., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+adaptation+in+toad+rods:+requirement+for+an+internal+messenger+which+is+not+calcium.">Light adaptation in toad rods: requirement for an internal messenger which is not calcium.</a> J. Physiol. 297, 493-520 (1979).</li><li>Arden, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+gradients+across+the+receptor+layer+of+the+isolated+rat+retina.">Voltage gradients across the receptor layer of the isolated rat retina.</a> J. Physiol. 256, 333-360 (1976).</li><li>Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+ERG+analysis+of+photoreceptors+using+an+in+vivo+ERG+system.">Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system.</a> Vision Res. 101, 108-117 (2014).</li><li>Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+responses+and+light+adaptation+in+rat+retinal+rods+at+different+temperatures.">Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures.</a> J. Physiol. 567, 923-938 (2005).</li><li>Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cone+photoresponses+obtained+with+electroretinogram+from+the+isolated+retina.">Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina.</a> Vision Res. 48, 264-272 (2008).</li><li>Wang, J. S., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+pathway+mediates+the+mouse+and+human+cone+visual+cycle.">An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle.</a> Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).</li><li>Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barium+suppresses+slow+PIII+in+perfused+bullfrog+retina.">Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina.</a> Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).</li><li>Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+conductance+block+by+barium+in+amphibian+Muller+cells.">Potassium conductance block by barium in amphibian Muller cells.</a> Brain Res. 498, 308-314 (1989).</li><li>Oakley, B., Katz, B. J., Xu, Z., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+buffering+of+extracellular+potassium+by+Muller+(glial)+cells+in+the+toad+retina.">Spatial buffering of extracellular potassium by Muller (glial) cells in the toad retina.</a> Exp. Eye Res. 55, 539-550 (1992).</li><li>Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+measuring+free+drug+concentration:+retinal+tissue+as+a+biosensor.">A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2583-2588 (2006).</li><li>Walter, P., Luke, C., Sickel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+light+responses+in+superfused+bovine+retina.">Antibiotics and light responses in superfused bovine retina.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 19, 87-92 (1999).</li><li>Luke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+safety+profile+of+alkylphosphocholines+in+the+model+of+the+isolated+perfused+vertebrate+retina.">The safety profile of alkylphosphocholines in the model of the isolated perfused vertebrate retina.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 248, 511-518 (2010).</li><li>Januschowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+toxicity+testing+of+VEGF+Trap-Eye+in+an+isolated+perfused+vertebrate+retina+organ+culture+model.">Electrophysiological toxicity testing of VEGF Trap-Eye in an isolated perfused vertebrate retina organ culture model.</a> Acta Ophthalmol. 92, e305-e311 (2014).</li><li>Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transretinal+ERG+recordings+from+mouse+retina:+rod+and+cone+photoresponses.">Transretinal ERG recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Koskelainen, A., Hemila, S., Donner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+sensitivities+of+short-+and+long-wavelength+sensitive+cone+mechanisms+in+the+frog+retina.">Spectral sensitivities of short- and long-wavelength sensitive cone mechanisms in the frog retina.</a> Acta Physiol. Scand. 152, 115-124 (1994).</li><li>Lyubarsky, A. L., Falsini, B., Pennesi, M. E., Valentini, P., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV-+and+midwave-sensitive+cone-driven+retinal+responses+of+the+mouse:+a+possible+phenotype+for+coexpression+of+cone+photopigments.">UV- and midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: a possible phenotype for coexpression of cone photopigments.</a> J. Neurosci. 19, 442-455 (1999).</li><li>Lyubarsky, A. L., Daniele, L. L., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+candelas+to+photoisomerizations+in+the+mouse+eye+by+rhodopsin+bleaching+in+situ+and+the+light-rearing+dependence+of+the+major+components+of+the+mouse+ERG.">From candelas to photoisomerizations in the mouse eye by rhodopsin bleaching in situ and the light-rearing dependence of the major components of the mouse ERG.</a> Vision Res. 44, 3235-3251 (2004).</li><li>Azevedo, A. W., Rieke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+protocols+alter+phototransduction:+the+implications+for+retinal+processing+at+visual+threshold.">Experimental protocols alter phototransduction: the implications for retinal processing at visual threshold.</a> J. Neurosci. 31, 3670-3682 (2011).</li><li>Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rods+and+cones+in+the+mouse+retina.+I.+Structural+analysis+using+light+and+electron+microscopy.">Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy.</a> J. Comp. Neurol. 188, 245-262 (1979).</li><li>Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+in+vertebrate+photoreceptors.">Adaptation in vertebrate photoreceptors.</a> Physiol. Rev. 81, 117-151 (2001).</li><li>Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-driven+translocation+of+signaling+proteins+in+vertebrate+photoreceptors.">Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors.</a> Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).</li><li>Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+photovoltage+of+macaque+cone+photoreceptors:+adaptation,+noise,+and+kinetics.">The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics.</a> J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).</li><li>Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesopic+background+lights+enhance+dark-adapted+cone+ERG+flash+responses+in+the+intact+mouse+retina:+a+possible+role+for+gap+junctional+decoupling.">Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling.</a> J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).</li><li>Gouras, P., MacKay, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+in+amplitude+of+the+human+cone+electroretinogram+with+light+adaptation.">Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).</li><li>Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+mouse+cone-mediated+electroretinogram+during+light+adaptation.">Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation.</a> Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).</li></ol>

יש אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס הסכם רישיון עם Xenotec, Inc. ועשויה לקבל תמלוגים ממכירת מתאם vivo לשעבר.

<html> אנו מדגימים כאן את השלבים הקריטיים להשגת הקלטות vivo ERG לשעבר באיכות גבוהה בו זמנית משתי רשתיות עכבר מבודדות באמצעות רכיבים במערכת vivo ERG יחד עם vivo לשעבר מתאם ERG. במחקר זה אנו perfused שני הרשתיות מבעלי החיים עם אותו הפתרון (או איימס &#39;, לוק של או רינגר) אבל זה גם אפשרי לינקב כל רשתית עם למשל פתרון שונה, למטרות בדיקת סמים. הצעדים החשובים ביותר לקבלת נתונים באיכות גבוהה הם מיגון מרעש אלקטרומגנטים, לנתיחה זהירה של הרשתית, יציב וזרימת זלוף מהירה יחסית על ידי שימוש בבעל דגימה שהותקן מתקדם, וביצוע כל הליכי הכנת המדגם תחת אדום עמום (או IR) אור. השיטה המתוארת כאן מאפשרת שימוש מיידי של שני הרשתיות והשימוש הכפול של התקנת ERG in vivo לבצע in vivo לשעבר הקלטות ERG vivo. _content &quot;&gt; vivo לשעבר בעל דגימת ERG שהותקן נועד לאחרונה על ידי 17, ועכשיו זמין באופן מסחרי, משפר את יחס האות לרעש על ידי בידוד חשמלי יעיל של הפרוקסימלי וחלקים הדיסטלי של הרשתית ומייעלת את זרימת זלוף מעל הרשתית (שער החליפין גבוה פתרון .) היעדרות של רכיבי רעש בתדר האיטי באות vivo לשעבר ERG מאפשרת ניתוח כמו גם מתגובות קטנות מאוד עם זאת, מצאנו כי הקלטת vivo לשעבר היא נוטה יותר להפרעות של רעש קו AC-הכח (60 הרץ בארה&quot;ב;. 50 הרץ באירופה) מאשר בvivo ניסויים. רעש זה מצמידים את האות בעיקר באמצעות קו זלוף, וזה יכולים להיות בעיקר הוסרו על ידי מגן (והארקה) כל רכיבי זלוף (בקבוק, צינורות) המתגורר מחוץ לתחום כלוב פאראדיי או Ganzfeld . בנוסף, לפעמים 60 הרץ רעש מצמידים את אות ERG vivo לשעבר דרך מחליף החום ורעש זה יכול גם להסיר על ידי הארקה. &lt;/ P&gt; אנו מדגימים כיצד להסיר רכיבי אות ERG ספציפיים על ידי הוספת חוסמי תרופתיים לזלוף במהלך הניסוי מאפשר לנתיחה של הפונקציה של סוגי תאים שונים באותו הרשתית / ניסוי עם שלוש תקשורת שונה פיזיולוגית זלוף (איור 2). מחקר שנערך לאחרונה הראה כי הבחירה של תקשורת זלוף משפיעה פיזיולוגיה קולטי האור בהקלטות תא בודדת 32. כאן אנו משמשים &quot;לוק של, ו&#39;איימס תקשורת &#39;HEPES-רינגר להקליט תגובות הבזק כהות מותאמת בהעדר והנוכחות של חומרים כימיים תרופתיים נועדו לבודד את מרכיב קולטי האור של אות ERG (איור 2). פתרונות שנאגרו ביקרבונט נתנו אמפליטודות a- וב-גל גדול יותר, עד 1 mV. תגובות הבזק קולטי האור עמומים תחת בינוני של לוק עם חוסמי הכילו צורת גל התאוששות מסובכת (ראה הבלעה של איור 2 ד) שלא ראה עם AmesR17; או זלוף רינגר. כאשר השימוש בvivo לשעבר ERG הופך מותאם על ידי מעבדות יותר יהיה זה מועיל להשתמש באותו כלי התקשורת זלוף ושיטות סטנדרטיים לבודד את רכיבי אות שונים. בשלב זה נראה שהאופציה צדדי ביותר היא המדיום &#39;איימס כי זה נותן לי אמפליטודות a- וב-גל יציב וגדולה. בנוסף, תגובת קולטי האור, פרמקולוגית מבודד בפתרון זה, נראה שיש לי צורת גל פשוט מזכיר שנרשם מקולטני אור יחיד (איור 2E). ובכל זאת, כמה שאלות פתוחות יישארו על קיומם של רכיבי אות אחרים ERG נצפו בתנאי in vivo. לדוגמא, בתנאים שלנו הקלטת vivo לשעבר לא ראו פוטנציאל oscillatory בולט, 100 - 150 הרץ גלי נדנוד שנצפו בדרך כלל בשלב של העלייה ב-גל in vivo תגובת ERG. יתכן אפוא שפונקצית הרשתית הפנימית בvivo לשעבר שלנו </eמ &#39;&gt; תנאים נפגעו למרות vivo לשעבר ב-גלים גדולים מעורבים קיימא על תפקוד תאים דו קוטבי. מחקרים עתידיים צריכים לפתור אם שינויים בפרוטוקולים הניסוי שמוצגים כאן (לנתיחה, וכו &#39;זלוף) תאפשר לנו להקליט פוטנציאלי oscillatory בתנאי vivo לשעבר. פונקצית קון היא חיונית לחזון שלנו. עם זאת, חקירה של קונוסים הקשו על ידי גודלם הקטן ומחסור במיוחד בעכבר רשתית 33. בידוד של פונקצית קונוס מסתבך עוד יותר בהקלטות ERG עכבר כי יש לי M-קונוסים והמוטות שלהם רגישויות רפאים כמעט זהות 30. פרוטוקולים סטנדרטיים לנצל את הבדל יומן-יחידת מספר בין רגישויות מוט וחרוטים באמצעות אור רקע דיכוי-מוט. עם זאת, לאור רקע יציב ידוע להוריד את רמת רגישות מוטות 34,35 ולהשפיע על תפקוד קונוס אולי דרך אפנון של צימוד junctional פער בין מוטות קונוסים &lt;sup&gt; 36,37. לפיכך, קשה למצוא עוצמת אור רקע שהיא בהיר מספיק כדי לשמור על מוטות רוויות מבלי להשפיע על קונוסים. כאן אנו מדגימים שיטת הבזק כפולה חלופית שמנצלת הן את הרגישות וקינטיקה התאוששות מהירה יותר של קונוסים 19,29,30 נמוכות יותר. בדרך זו קל יותר לבודד תגובות בתיווך חרוט באמת-כהות מותאמות. שם לב שבאיימס &quot;או הפתרונות של לוק ללא כל חוסמי, הפרטים של צורת גל ההתאוששות הושפעו במידה מסוימת במהלך הניסוי על ידי השימוש בהבזקי בדיקה ובדיקה בהירים. זה מסובך ניתוח החיסור כדי לבודד את תגובות קונוס. עם זאת, הסרת רכיב גליה ידי בריום עזרה לייצב את הזנב של התגובות המצביעות על כך ההשתנות הייתה בשל מרכיב תא מולר. בדרך זו ניתן היה להשיג את תגובות מונעים חרוט כהות מותאמות בעכברי WT (איור 3). תגובות קונוס מבודדים על ידי הבזק כפולטכניקה מעכברי WT הופיעה קטנה יותר בהשוואה לאלו שנרשמו מעכברי WT באמצעות אור הרקע לדכא פעילות מוט 17,37. הבדל זה יכול להיות מוסבר על ידי השפעה מאופיינת היטב של אור הרקע שלאט (תוך 10 דקות) משפרת אמפליטודות תגובת חרוט כנראה בשל הסרת הדיכוי בתיווך המוט של תגובות קונוס 37-39. לסיכום, השיטה הוכיחה כאן עושה הקלטות אלקטרו vivo לשעבר ניתן ללמוד את הפונקציה של הרשתית. בעתיד, אנו מקווים שעוד רבות מעבדות תהיה להתאים שיטה זו עוצמה ללמוד הפיסיולוגיה ופתולוגיה של רשתית בעלי חיים ובני אדם ולקדם את ההבנה של תפקוד רשתית שלנו ולפתח טיפולים טובים יותר למחלות מסנוורים.

Electroretinogram (ERG) הוא טכניקה מבוססת היטב כי ניתן להשתמש כדי להקליט את הפעילות החשמלית של הרשתית מופעלת על ידי אור. אות ERG מופקת בעיקר משינויי מתח שנגרמו על ידי זרמי רדיאלי (לאורך הציר של קולטני האור ותאים דו קוטביים) זורמים במרחב תאי ההתנגדות של הרשתית. אות ERG הראשונה נרשמה בשנת 1865 על ידי הולמגרן מפני שטח של עין דג 1. Einthoven וJolly 1,908 2 חילקו את תגובת ERG לתחילתה של אור לשלושה גלים שונים, נקראת a-, B-, וג-גלים, שכיום ידועים שישקפו בעיקר את הפעילות של קולטני האור, על תאים דו קוטביים, ואפיתל הפיגמנט תאים, בהתאמה 3-8. ניתן להקליט ERG מהעיניים של בעלי חיים או בני אדם (in vivo) בהרדמה, מהכנת עין מבודדת 9, על פני רשתית שלמה מבודדת (לשעבר vivo) 3,10-15 או על פני שכבות רשתית ספציפיות עם microelectrodes (מקומיERG) 4,16. מבין אלה, in vivo ERG הוא כיום השיטה הנפוצה ביותר להערכת תפקוד רשתית. זוהי טכניקה לא פולשנית שיכול לשמש למטרות אבחון או למעקב ההתקדמות של מחלות רשתית בבעלי חיים או חולים. עם זאת, בvivo הקלטות ERG לייצר אות מורכבת עם מספר מרכיבים חופפים, לעתים קרובות מזוהמות ברעש extraocular הפיזיולוגי (למשל, נשימה ופעילות לב). ERG המקומי ניתן להשתמש כדי להקליט את האות על פני שכבות מסוימות של הרשתית אבל זה חודרני ביותר ויש לו את היחס הנמוך ביותר אות לרעש (SNR) בהשוואה לתצורות הקלטת ERG האחרות. ERG המקומי הוא גם תובעני מבחינה טכנית ודורש ציוד יקר (למשל, מיקרוסקופ וmicromanipulators). Transretinal ERG מהרשתית שלמה, מבודדת (לשעבר vivo ERG) מציע פשרה בין in vivo ושיטות ERG מקומיים המאפשרת יציב וHIGהקלטות h SNR מרשתית שלמה של בעלי חיים או בני אדם 17. לאחרונה, שיטה זו שמשה בהצלחה ללמוד לתפקד מוט וקולטי אור חרוט ברשתית של יונקים, קופים ובני אדם 18-20. בנוסף, בשל היעדר אפיתל הפיגמנט ברשתית vivo לשעבר, מרכיב ג-הגל החיובי של אות ERG מוסר ורכיב איטי שלילי בולט PIII מתגלה בvivo לשעבר ההקלטות. רכיב PIII האיטי הוכח מקורן את הפעילות של תאי גליה מולר ב21-23 הרשתית. לפיכך, לשעבר vivo שיטת ERG יכול לשמש גם כדי ללמוד תאי מולר ברשתית ללא פגע. גם מספר מחקרים הראו כי vivo לשעבר הקלטות ERG יכולים לשמש למדידת ריכוז של סוכנים תרופתיים סביב 24 הרשתית ולבדוק את הבטיחות ויעילות של תרופות 25-27. מסחרי מרובים במערכות vivo זמינים ומשמש במעבדות רבות שלא בהכרח יש לי רקע אלקטרופיזיולוגיה נרחב. לעומת זאת, מכשירי vivo לשעבר לא היו זמינים עד לאחרונה 17 וכתוצאה מכך רק מעט מאוד מעבדות כיום מנצלות טכניקה רבת עוצמה זו. זה יהיה מועיל לבצע הקלטות vivo לשעבר ERG זמינים ליותר מעבדות במטרה לקדם את הידע שלנו על פיזיולוגיה והפתולוגיה ברשתית, ולפתח טיפולים חדשים למחלות מסנוורים. אנו מדגימים כאן מכשיר vivo לשעבר ERG פשוט ובמחיר סביר 17 ולהראות כיצד ניתן להשתמש בו בשילוב עם מספר מערכות vivo ERG הזמינים מסחרי בלהקליט איתות rod- ותיווך קונוס (a- וB-גלים) והפונקציה של תאי מולר (להאט PIII) מרשתית עכבר wild-type בשלמותה.

<table><tbody><tr><td>&lt;i&gt;In vivo&lt;/i&gt; ERG system</td><td>OcuScience</td><td>HMsERG</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ocuscience.us/id77.html&quot;&gt;www.ocuscience.us/id77.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;i&gt;In vivo&lt;/i&gt; ERG system</td><td>LKC Technologies</td><td>UTAS-E 3000</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html&quot;&gt;www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;i&gt;Ex vivo&lt;/i&gt; adapter</td><td>OcuScience</td><td>Ex VIVO ERG adapter</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ocuscience.us/id107.html&quot;&gt;www.ocuscience.us/id107.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>North Central Instruments</td><td>Leica M80</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ncimicro.com/store/ListProduct.asp?bSub=T&amp;amp;idCategory=27&quot;&gt;May use any brand&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>IR emitter</td><td>Opto Diode Corp.</td><td>OD-50L</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.optodiode.com/&quot;&gt;www.optodiode.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Prowler Night Vision Scopes</td><td>B.E. Meyers Electro Optics</td><td>D4300-I</td><td>Military grade product.</td></tr><tr><td>Red filter</td><td>Rosco Laboratories</td><td>Roscolux #27 Medium Red</td><td>May be used instead of IR system</td></tr><tr><td>Red head light</td><td>OcuScience</td><td>ERGX011</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.ocuscience.us/catalog/i29.html&quot;&gt;www.ocuscience.us/catalog/i29.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>WPI, Inc.</td><td>500086</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.wpiinc.com/&quot;&gt;www.wpiinc.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Dumont tweezers #5</td><td>WPI, Inc.</td><td>14101</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72000</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emsdiasum.com/&quot;&gt;www.emsdiasum.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Scale</td><td>Metler Toledo</td><td>AB54-S/FACT</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/&quot;&gt;May use any brand&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>pH meter and electrode</td><td>Beckman Coulter</td><td>pHI 350</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/&quot;&gt;May use any brand&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60129</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/&quot;&gt;May use any brand&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63020</td><td>1.0 M solution</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21114</td><td>1.0 M solution</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>Ames medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>BaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0750</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>DL-AP4</td><td>Tocris Bioscience</td><td>101</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>Succinic acid disodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224731</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>L-Glutamic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2834</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>Leibovitz culture medium L-15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4386</td><td>May use any brand</td></tr><tr><td>MEM vitamins</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>MEM amino acids</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5550</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>UN3156</td><td>5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr></tbody></table>

simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

הקלטנו תגובות הבזק מסוג wild-כהה מותאם (WT) C57BL / 6 רשתית עכבר ידי ביצוע פרוטוקולי הניסוי שתואר לעיל ושמודגמים באיור 1 על ידי שימוש בפתרוני זלוף סטנדרטיים שונים (איור 2). גל התגובה וקינטיקה כמו גם הרגישות של קולטני אור מוט הופיעו דומים באיימס &#39;והתקשורת של לוק (איור 2 א&#39; וב &#39;). מצד השני, תחת פתרון HEPES שנאגר רינגר (לא O CO 2/95% ביקרבונט או 5% 2) אמפליטודות התגובה היתה קטנה יותר באופן משמעותי. מצאנו גם כי בתנאים אלה יציבות ב-גל הייתה בסכנה. הוספת 40 APB מיקרומטר (DL-AP4) הוסר ב-גל חיובי ביעילות בכל שלוש התקשורת (איורים 2D-F). הסרת ב-הגל חשפה גל גדול איטי שלילי (איור 2 ד) שיוחס לפעילות תאי מולר 21. הוספת 100 &amp;956 #; M של בריום בוטל רכיב זה, חושף את תגובת קולטי האור של אות ERG vivo לשעבר (איורים 2D-F). אנחנו יכולים להקליט עד 1 תגובות קולטי האור mV רוויות באיימס &#39;ולוק של אילו תגובות מקסימליים היו בדרך כלל סביב 200 μV תחת זלוף רינגר. תגובות קולטי האור קון היו מבודדות בעבר על ידי מה שנקרא טכניקת הבזק הכפול שבו הבזק בדיקה בהיר להרוות את המוטות ואחריו הבזק בדיקה בתקופה שבי קונוסים החזירו המדינה הכהה המותאמות שלהם, אבל מוטות להישאר רוויות 19,29. כאן אנו מבודדים תגובות ERG בתיווך חרוט (המכיל את שני a- וב-גל) בתקשורת &quot;איימס בתוספת של בריום 100 מיקרומטר, אך לא DL-AP4 על ידי שימוש בטכניקה כפולה הבזק (איור 3). בריום שימש כדי להסיר את רכיב גליה האיטי שהופיע כדי להפוך את החלק המאוחר של התגובות משתנים יותר במיוחד בשימוש חוזר ונשנה של brighהבזקים לא. אנחנו השתמשנו בפלאש בדיקה מתמיד כדי להרוות מוטות והבזקי מבחן משתנים 300 אלפיות שניים לאחר הבדיקה הבזק לעורר תגובות קונוס. משפחת תגובת קונוס שהושגה על ידי הפחתת בדיקה תגובת הבזק מהתגובות &quot;הבזק הבדיקה + בדיקה &#39;מוצגת באיור 3. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52855/52855fig1.jpg" /> מילוי איור 1. שימוש בבעל דגימת vivo לשעבר ERG. (א) לערוצי אלקטרודה והרכבה של האלקטרודות. (ב) בדיקה של בעל דגימה שנאסף לפני הנתיחה על ידי מדידת ההתנגדות ומתח בין זוגות אלקטרודה. הרכבה (C) של הרשתית על נייר הסינון בבעל הדגימה. (ד) בעל הדגימה מחובר לקווי זלוף ומגבר ERG בסאי ERG המסחרייםגזע. זרימת זלוף הנתיב מסומן בחצים כחולים. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52855/52855fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52855/52855fig2.jpg" /> משפחות איור 2. Flash תגובה נרשמו מהרשתית כהה מותאם WT עכבר perfused עם של לוק (), איימס &#39;(B), ובינוני HEPES שנאגר רינגר (C). ההבזקים נמסרו 3, 40, 130, 390 ו1,400 הפוטונים מיקרומטר -2 (מ-36 ל-9 dB או -3.6 ל-0.9 יומן (ס&quot;מ Cd -2) אור ירוק (530 ננומטר)). עקבות שחורות בתגובות הצג (DF) נרשמו מרשתית ב( AC) לאחר תוספת של 40 מיקרומטר APB ו -100 מיקרומטר בריום. עקבות אדומות בתגובות הצג (ד) נרשמו מהרשתית ב()<html> perfused עימו של לוק בתוספת APB מיקרומטר 40 אבל לא בריום. הבלעה מראה את התגובות לשלושת ההבזקים הקלושים ביותר בתקשורת של לוק מכילה APB ובריום. ההבזקים נע בין 7 ל -14,000 פוטונים מיקרומטר -2 (מ-32 עד 1 אור הירוק dB) ב( ד &#39;), בין 3 ל -1,400 פוטונים מיקרומטר -2 (מ-36 ל-9 dB אור ירוק) ב( E), וממיקרומטר 7 ל -1,400 פוטונים -2 (מ-32 ל-9 dB אור ירוק) ב( F). ראה Vinberg et al. 2,014 17 וLyubarsky et al. 1,999 30 ו2004 31 לפרטים של המרת אנרגיה זוהרת photopic ניתנה בCd מ&quot;ר -2 לפוטונים מיקרומטר -2. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52855/52855fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> עומס / 52,855 / 52855fig3.jpg &quot;/&gt; בידוד איור 3. תגובות קונוס עם שיטת הבזק כפולה בעכבר WT. (א) תגובה לבדיקת הבזק (מיקרומטר 14,000 פוטונים -2 או 1 אור ירוק dB, שחור) ותגובה לבדיקת הבזק ואחריו הבזק מבחן (81,000 מיקרומטר פוטונים -2 או 9 אור dB ירוק, אדום). (ב) תגובות פלאש קון לבדוק הבזקים החל 360 ל81,000 פוטונים מיקרומטר -2 (-14 עד 10 אור הירוק dB) המבודדים על ידי הפחתת תגובת הבזק בדיקה מ&quot; בדיקה + בדיקת פלאש &quot;תגובה. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52855/52855fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System at JoVE.com

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

בו זמנית<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; בדיקות פונקציונליות של שתי הרשתיות על ידי<em&gt; In vivo</emמערכת electroretinogram&gt;

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

simultaneous-ex-vivo-functional-testing-two-retinas-vivo

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

9.1K Views.  Washington University in St. Louis. Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Video: Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Multifocal Electroretinograms

A limitation of traditional full-field electroretinograms (ERG) for the diagnosis of retinopathy is lack of sensitivity. Generally, ERG results are normal unless more than approximately 20% of the retina is affected. In practical terms, a patient might be legally blind as a result of macular degeneration or other scotomas and still appear normal, according to traditional full field ERG. An important development in ERGs is the multifocal ERG (mfERG). Erich Sutter adapted the mathematical sequences called binary m-sequences enabling the isolation from a single electrical signal an electroretinogram representing less than each square millimeter of retina in response to a visual stimulus1.
Results that are generated by mfERG appear similar to those generated by flash ERG. In contrast to flash ERG, which best generates data appropriate for whole-eye disorders. The basic mfERG result is based on the calculated mathematical average of an approximation of the positive deflection component of traditional ERG response, known as the b-wave1. Multifocal ERG programs measure electrical activity from more than a hundred retinal areas per eye, in a few minutes. The enhanced spatial resolution enables scotomas and retinal dysfunction to be mapped and quantified.
In the protocol below, we describe the recording of mfERGs using a bipolar speculum contact lens.
Components of mfERG systems vary between manufacturers. For the presentation of visible stimulus, some suitable CRT monitors are available but most systems have adopted the use of flat-panel liquid crystal displays (LCD). The visual stimuli depicted here, were produced by a LCD microdisplay subtending 35 - 40 degrees horizontally and 30 - 35 degrees vertically of visual field, and calibrated to produce multifocal flash intensities of 2.7 cd s m-2. Amplification was 50K. Lower and upper bandpass limits were 10 and 300 Hz. The software packages used were VERIS versions 5 and 6.

The development of the multifocal electroretinogram (mfERG) is an important advance in the diagnosis and characterization of retinopathy. Multifocal electroretinograms are a mathematical average of an approximation of a b-wave. Software programs can derive ERGs from more than a hundred retinal areas in a few minutes per eye. Scotomas and retinal dysfunction can be mapped and quantified.

A limitation of traditional full-field electroretinograms (ERG) for the diagnosis of retinopathy is lack of sensitivity.  Generally, ERG results are ...

Medicine

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light whereas cones operate continuously under rapidly changing bright light conditions. Absorption of light by rod- and cone-specific visual pigments in the outer segments of photoreceptors triggers a phototransduction cascade that eventually leads to closure of cyclic nucleotide-gated channels on the plasma membrane and cell hyperpolarization. This light-induced change in membrane current and potential can be registered as a photoresponse, by either classical suction electrode recording technique1,2 or by transretinal electroretinogram recordings (ERG) from isolated retinas with pharmacologically blocked postsynaptic response components3-5. The latter method allows drug-accessible long-lasting recordings from mouse photoreceptors and is particularly useful for obtaining stable photoresponses from the scarce and fragile mouse cones. In the case of cones, such experiments can be performed both in dark-adapted conditions and following intense illumination that bleaches essentially all visual pigment, to monitor the process of cone photosensitivity recovery during dark adaptation6,7. In this video, we will show how to perform rod- and M/L-cone-driven transretinal recordings from dark-adapted mouse retina. Rod recordings will be carried out using retina of wild type (C57Bl/6) mice. For simplicity, cone recordings will be obtained from genetically modified rod transducin &alpha;-subunit knockout (T&alpha;-/-) mice which lack rod signaling8.

We describe a relatively simple method of transretinal electroretinogram (ERG) recordings for obtaining rod and cone photoresponses from intact mouse retina. This approach takes advantage of the block of synaptic transmission from photoreceptors to isolate their light responses and record them using field electrodes placed across the isolated flat-mounted retina.

Transretinal ERG הקלטות של רשתית עכבר: רוד Photoresponses חרוט

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

אפיון אלקטרו של ה-GFP, הבעת אוכלוסיות תאים ברשתית אינטקט

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain the overall health and structural integrity of the photoreceptors. The RPE is polarized, exhibiting apically and basally located receptors or channels, and performs vectoral transport of water, ions, metabolites, and secretes several cytokines.
In vivo noninvasive measurements of RPE function can be made using direct-coupled ERGs (DC-ERGs). The methodology behind the DC-ERG was pioneered by Marmorstein, Peachey, and colleagues using a custom-built stimulation recording system and later demonstrated using a commercially available system. The DC-ERG technique uses glass capillaries filled with Hank&#8217;s buffered salt solution (HBSS) to measure the slower electrical responses of the RPE elicited from light-evoked concentration changes in the subretinal space due to photoreceptor activity. The prolonged light stimulus and length of the DC-ERG recording make it vulnerable to drift and noise resulting in a low yield of useable recordings. Here, we present a fast, reliable method for improving the stability of the recordings while reducing noise by using vacuum pressure to reduce/eliminate bubbles that result from outgassing of the HBSS and electrode holder. Additionally, power line artifacts are attenuated using a voltage regulator/power conditioner. We include the necessary light stimulation protocols for a commercially available ERG system as well as scripts for analysis of the DC-ERG components: c-wave, fast oscillation, light peak, and off response. Due to the improved ease of recordings and rapid analysis workflow, this simplified protocol is particularly useful in measuring age-related changes in RPE function, disease progression, and in the assessment of pharmacological intervention.

Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Here, we present a method for recording light-evoked electrical responses of the retinal pigment epithelium (RPE) in mice using a technique known as DC-ERGs first described by Marmorstein, Peachey, and colleagues in the early 2000s.

אלקטרורטינוגרמה ישירה (DC-ERG) להקלטת התגובות החשמליות המעוררות אור של אפיתל פיגמנט רשתית העכבר

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain ...

Chemistry

Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the retina. The ERG is a sensitive measure of changes in retinal function that are pan-retinal, but is less effective for detecting damage confined to a small area of retina. In the present work we describe how to record the &#8216;flash&#8217; ERG, which is the potential generated when the retina is exposed to a brief light flash. We describe methods of anaesthesia, mydriasis and corneal management during recording; how to keep the retina dark adapted; electrode materials and placement; the range and calibration of stimulus energy; recording parameters and the extraction of data. We also describe a method of inducing ischemia in one limb, and how to use the ERG to assess the effects of this remote-from-the-retina ischemia on retinal function after light damage. A two-flash protocol is described which allows isolation of the cone-driven component of the dark-adapted ERG, and thereby the separation of the rod and cone components. Because it can be recorded with techniques that are minimally invasive, the ERG has been widely used in studies of the physiology, pharmacology and toxicology of the retina. We describe one example of this usefulness, in which the ERG is used to assess the function of the light-damaged retina, with and without a neuroprotective intervention; preconditioning by remote ischemia.

The electroretinogram (ERG) is an electrical potential generated by the retina in response to light. This paper describes how to use the ERG to assess retinal function, in dark-adapted rats, and how it can be can be used to assess a neuroprotective intervention, in the present case remote ischemic preconditioning.

שימוש בelectroretinogram כדי להעריך את התפקוד ברשתית מכרסמים וההשפעות המגנות של האיבר המרוחק איסכמי אכשור קד

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the ...

Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats

The electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are commonly used to assess the integrity of the visual pathway. The ERG measures the electrical responses of the retina to light stimulation, while the VEP measures the corresponding functional integrity of the visual pathways from the retina to the primary visual cortex following the same light event. The ERG waveform can be broken down into components that reflect responses from different retinal neuronal and glial cell classes. The early components of the VEP waveform represent the integrity of the optic nerve and higher cortical centers. These recordings can be conducted in isolation or together, depending on the application. The methodology described in this paper allows simultaneous assessment of retinal and cortical visual evoked electrophysiology from both eyes and both hemispheres. This is a useful way to more comprehensively assess retinal function and the upstream effects that changes in retinal function can have on visual evoked cortical function.

This protocol describes simultaneous measurement of electroretinogram and visual evoked potentials in anesthetized rats.

הקלטה בו זמנית של Electroretinography ופוטנציאלים חזותיים מעוררים אצל חולדות הרדימו

The electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are commonly used to assess the integrity of the visual pathway. The ERG measures the ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in retinal diseases, and testing therapeutic interventions. The ex vivo electroretinogram (ERG) allows the quantification of contributions from individual cell types in the isolated retina by addition of specific pharmacological agents and evaluation of tissue-intrinsic changes independently of systemic influences. Retinal light responses can be measured using a specialized ex vivo ERG specimen holder and recording setup, modified from existing patch clamp or microelectrode array equipment. Particularly, the study of ON-bipolar cells, but also of photoreceptors, has been hampered by the slow but progressive decline of light responses in the ex vivo ERG over time. Increased perfusion speed and adjustment of the perfusate temperature improve ex vivo retinal function and maximize response amplitude and stability. The ex vivo ERG uniquely allows the study of individual retinal neuronal cell types. In addition, improvements to maximize response amplitudes and stability allow the investigation of light responses in retina samples from large animals, as well as human donor eyes, making the ex vivo ERG a valuable addition to the repertoire of techniques used to investigate retinal function.

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Modification of existing multielectrode array or patch clamp equipment makes the ex vivo electroretinogram more widely accessible. Improved methods to record and maintain ex vivo light responses facilitate the study of photoreceptor and ON-bipolar cell function in the healthy retina, animal models of eye diseases, and human donor retinas.

אופטימיזציה של ההגדרה והתנאים עבור אלקטרורטינוגרמה של Ex Vivo כדי לחקור את תפקוד הרשתית בעיניים קטנות וגדולות

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in ...

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular cells. Isolating, culturing, and sustaining retinal neurons in vitro have technical and biological limitations. Culturing retinal explants may overcome these limitations and offer a unique ex vivo model to study the cross-talk between various retinal cells with well-controlled biochemical parameters and independent of the vascular system. Moreover, retinal explants are an effective screening tool for studying novel pharmacological interventions in various retinal vascular and neurodegenerative diseases such as diabetic retinopathy. Here, we describe a detailed protocol for retinal explants' isolation and culture for an extended period. The manuscript also presents some of the technical problems during this procedure that may affect the desired outcomes and reproducibility of the retinal explant culture. The immunostaining of the retinal vessels, glial cells, and neurons demonstrated intact retinal capillaries and neuroglial cells after 2 weeks from the beginning of the retinal explant culture. This establishes retinal explants as a reliable tool for studying changes in the retinal vasculature and neuroglial cells under conditions that mimic retinal diseases such as diabetic retinopathy.

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

This protocol presents and describes steps for the isolation, dissection, culturing, and staining of retinal explants obtained from an adult mouse. This method is beneficial as an ex vivo model for studying different retinal neurovascular diseases such as diabetic retinopathy.

השתלת הרשתית של הרשתית של עכבר בוגר כמודל ex vivo לחקר מחלות נוירו-וסקולריות ברשתית

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular ...

Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

<a href='https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61970/transpupillary-two-photon-in-vivo-imaging-of-the-mouse-retina'>Source: Wang, Z., et al.&#160;Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp.&#160;(2021).</a>This video demonstrates a technique for in vivo retinal imaging using two-photon microscopy. Anesthetized mice are prepared for imaging by securing their heads, Applying eye lubricant, and placing a coverslip over the eye. Retinal ganglion cells (RGCs) expressing fluorescent proteins are first visualized using epifluorescence for alignment. Finally, two-photon imaging is employed, allowing for high-resolution visualization of RGCs.

Source: Wang, Z., et al.&#160;Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp.&#160;(2021).This video demonstrates a technique ...

בו זמנית

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video