Name: physiological recordings and rna sequencing of the gustatory appendages of the yellow-fever mosquito aedes aegypti
Uploaded: 2014-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
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The authors thank Bryan T. Vinyard of the USDA, Agricultural Research Service, Henry A. Wallace Beltsville Agricultural Research Center, Biometrical Consulting Service, Beltsville, MD for statistical analyses. This work was supported in part by a grant to J.C.D. from the Deployed War Fighter Protection (DWFP) Research Program funded by the Department of Defense through the Armed Forces Pest Management Board (AFPMB).

1.飼育ヨンエ。ネッタイシマカ大人<ol><li>浅いトレイ内の約¾インチの水でハッチの卵。過密状態は、大人のサイズを小さくします。 </li><li> 25°C（12 hLの：12-HD）でリア幼虫と接地魚の餌で飼育。 注：過剰摂取は、生存率を減少させることができる。 </li><li>毎日のパスツールピペットによって個別に蛹を外し、細かいメッシュ蓋で小さな封じ込めバケットの内側にプラスチック皿（5.5センチメートル×9センチ）に移転、このように24時間の年齢グループを確立する。 </li><li>ケージハウジングの画面の壁に置かれた綿球によるフィード大人の蚊10％のショ糖溶液の幼虫と同じ光周期の下で27℃、相対湿度70％の環境チャンバー内の蚊。 </li><li>電気生理学のために、5〜10日齢の動物を使用しています。一般に、大型動物、より良い結果を生む。 RNA単離のために、5〜10日齢の範囲内の単一の24時間の年齢グループ内にある動物を使用しています。 </li></ol><ol><li>選択した感覚ニューロンからの最小限の活動を誘発電解質の適当な濃度（ 例えば 1-10 mm）を決定します。 10 mMのNaClまたは1mMのKClを実験の開始時のベースライン活性を試験するために合理的な電解質である。 </li><li>適切な溶媒中で、各実験化学物質を溶解させる（ない場合は水、エタノールまたはDMSOを使用）単独の電解質に比べてスパイク活性にほとんどまたは全く効果を有している。 10％エタノールまたは1％DMSOの最終濃度は、妥当な出発濃度である。 </li><li>昆虫に送り抑止や覚せい剤を十分に記載されている制御化学物質（甘いのための苦いまたはスクロース例えばキニーネ）適切なを選択します。 </li></ol> 3.電気生理学（先端記録8;図1） <ol><li>機械的にガラスキャピラリーを引いてフォームガラス電極。熱を最適化し、適切な形状のrecordiを形成するために、ガラスを引っ張って設定を引っ張るNG電極。慎重には、ターゲット感覚子を包むのに十分な幅が、隣接する構造体との接触を回避するのに十分に小さい開いた電極チップを作成するために、解剖顕微鏡下でピンセットを使用してガラス電極の端部を断つ。 </li><li>顕微鏡下で、視覚的に形態によって特定し、先端記録の再現性を確保するために、ターゲット感覚器/感覚子を配置。準備は動物電極エントリの角度から感覚器への無料アクセスを許可する。 </li><li> -20℃の冷凍庫に冷たい麻酔大人の昆虫。低温に露出オーバーにより末梢ニューロンへの損傷を避ける。スライドガラス上にカミソリの刃でセロハンテープの狭いストリップをカット。狭いストリップを使用してスライドガラス上に全昆虫を不動。 </li><li>無関心（アース）電極として機能するように背側胸部または眼の中に化学的に尖らタングステン線を挿入します。 </li><li>興味のある刺激溶液とステップ3.1で行われたガラス電極を埋める。挿入された注射器を使用して、キャップを埋めるエンドを鈍らに引か端からillary。プルダウン端部を保持、すべての気泡をはじく。記録と刺激電極として機能するようにステップ3.1で行われたガラス電極に銀線（塩化物化別売）を挿入します。 </li><li>昆虫におけるコンタクト化学受容の感覚器からの​​記録のために設計されてプリアンプに電極を接続します。このプリアンプ（300 HZ-3 kHzの帯域通過フィルタ）が可能なように導入を刺激に近づけ神経活動をキャプチャするセトリング時間を削減します。収集、保存、スパイク記録ソフトウェアを搭載したマイコンを使用して電気信号を解析する。 注記：正しく記録セットアップを接地すると、急激に信号対雑音比を改善することができる。 </li><li>機能性を確保するために、コントロール溶液（電解液のみ）との感覚器を刺激する。すべての準備のための刺激アーチファクト次の200ミリ秒を開始するスパイクをカウントします。 </li><li>用量応答研究を除いて、すべての実験のための試験化学物質の順序をランダム化、バイアスを除去する。用量応答研究のために、実験的な化学物質の濃度を増加する感覚器を公開。十分な回復を確実にするために刺激間の3分の最小値を許可します。 注：この要件は、昆虫や感覚器によって異なる場合があります。閾値は、標準誤差は試験した最低濃度の標準誤差と重ならないためにその濃度として定義される。 </li></ol> 4. RNA単離および配列決定（図2） <ol><li>しっかりとスナップキャップチューブに合わせて組織disruption.Prepare伴うRNaseフリー乳棒前にドライアイス上でそれらを冷却することによりしっかりとフィット無RNAse乳棒を準備します。積極的に過剰結露を避けるために、解剖しない限り、閉じたコレクションチューブを保管してください。 </li><li>性別によるコールドステージとソートに（-20℃の冷凍庫15秒）で濾過吸引器を使用して、30から40の冷麻酔をかけた蚊を置く。置き動物は味の付属を損傷しないように翼を把握し、ダウンサイド背側。</li><li>細かい鉗子の二組を使用して、解剖顕微鏡下で男性または女性からペアのlabellaまたはtarsiを解剖し、隣接する組織を含めることを制限する。 注：500ペアlabellaは全mRNAの約800〜ナノグラムが得られます。 400個々のtarsi（5セグメント毎に）全mRNAの1,200-1,800ナノグラムをもたらす。 </li><li>あえぎ-鉗子の1対の、軽く内側のスタイレットを公開するlabellaのすぐ近位蚊口吻を把握する。コレクション-鉗子の他のペアを使用して、labellaを削除し、冷たい収集チューブの側に組織を追加します。 </li><li>鉗子の1対の、軽く脛骨と第一足根セグメントの接合部に蚊の足を把握する。鉗子の他のペアを使用して、tarsiを除去し、冷収集チューブの側面に組織を加える。 注：希望と望ましくない組織の界面において考慮細胞型を取る。それは、組織を隣接の混入を制限することが重要であるが、所望の組織の一部を省略しないことも重要である。 FiのNALサンプルを正確に関心のある器官全体を表している必要があります。コレクション鉗子を正確に掻きのみ所望の組織をつかんことで解放することができるように、把持鉗子との正確な境界を作成します。 </li><li>定期的に、チューブの底に組織を維持するために9000×gで簡潔に0℃の遠心機でコレクションチューブをスピンダウン。水分が解剖時に採取管に蓄積する場合、採取した組織をカバーするために冷たいTrizol試薬50μlのを追加します。 </li><li>防汚ラボマーカーを使用して、明らかに1 RNaseフリー1.5ミリリットルコレクションの各組織型用キャップチューブスナップラベルを付けます。 1.5ミリリットルチューブラックと液体窒素を用いて、（トリゾールであれば細かい個）の微粉末に組織を挽く後、凍結。一回繰り返します。 1ミリリットルにトリゾールの全量を、ボルテックスで地面組織を懸濁します。 </li><li>クロロホルム200μlのを追加し、完全に混合する。室温で5分後、4℃、15分間11000×gで遠心分離器でスピンダウン。慎重にゲノムDNAフィルターカラムに直接水層を追加します。 5分間11000×gでスピンダウン。スルー流れ、ピペットで混合するRNaseフリーの70％エタノールを等量加える。 RNAのコレクション列に液体を移し、提供の指示に従ってRNA抽出を続ける。 </li><li>定量化し、精密分光光度計で全RNAの純度を評価し、任意の標準RNA配列決定法を進める。 </li></ol> 5.定量的RT-PCR RNAの配列決定の検証（図3） <ol><li>予測された配列の存在量と推定される化学感覚遺伝子機能の両方で、ダイナミックレンジの相対的な遺伝子発現レベルを比較するために、できるだけ多くの遺伝子を選択する。 </li><li>各標的遺伝子のための設計プライマー対は、特定の100-180塩基対のPCR産物を増幅した。セットごとに少なくとも1つのプライマーは、イントロン境界にまたがる確実にすることによって、非特異的なgDNAの増幅を除外する。あるいは、ゲノム汚染を低減するためにDNase処理を使用しています。 </li><li>集める前のセクションで説明したように昆虫組織。すべてのqRT-PCR反応を完了するのに十分なRNAを提供するために必要な組織を計算する。 注：生物学的三連と技術的三連の反応は、結果の最大の自信を提供します。 </li><li> 、生物学的および技術的の両方をそれぞれの各標的遺伝子の平均のために（Ctは[対象] -Ct [参照]）を複製- X ターゲットとして相対的な遺伝子定量化を計算します。生物学的反復の間のCt値を正規化し、相対的発現の比較でY軸スケールを根絶するために、ハウスキーピング遺伝子を使用する。 </li><li> RNA-seqのと回帰ベース、ブートストラップ同値手順9、反復的に各組織からのデータに、適用を使用して定量RT-PCRデータセットの類似性を評価する。 注：この手順は、観察されたRNA-seqの及び定量RT-PCRデータの周りに構築することができる最小の「類似性の領域」を特定し、QRT-によって測定される相対的な遺伝子発現を可能にするPCRは、RNA-seqのにより相対的遺伝子発現の測定と統計的に同等であると考えられる。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

味覚感覚器からの​​記録活動電位の最も挑戦的な側面はあるの応答を決定されている「通常」与えられた昆虫種、総数と味覚受容体ニューロンの感度（GRNs）の最初の時間を記録する単一の味覚感覚子チップを採用する場合であるそう不明。多くの予備録音は最初のテストの範囲や化学物質の濃度を決定するために必要とされる。この例では、我々は、単一のGRNはDEETの低濃度（ 図1）に応答したことを観察し始めた。その後、我々は、苦味または他の昆虫に嫌悪であることが知られている化学物質の濃度の範囲に同じ感覚器内の反応を検討し、同様のスパイク形状および振幅（ 図1）を観察した。これらの観​​察は、単一のGRNのサブタイプはこれらの嫌悪の化合物に応答することを示唆した。比較のために、我々はmosquに摂食を刺激することが知られて甘い化合物を試験した同じようなスパイクが発生したかどうかを確認するためにitoes。我々は、この場合、異なる、より大きなスパイクを観察した。同様に、3つの合計GRNサブタイプ数をもたらす、塩の刺激に応答して第三の中間サイズのスパイクを観察した。 昆虫における電気生理学的記録製剤は、本質的に可変である。ターゲット味覚感覚器は、典型的には非常に小さく、キューティクルにガラスに触れることなく、記録電極にアクセスするための適切な角度で配置されなければならない。味覚神経細胞への導電性ブリッジを確立するには、感覚子の端子細孔が記録電極の電解液との直接接触を確立するために含まれているリンパ液に開いている必要があります。我々は、ターゲット感覚子内から外国の残骸や排泄し、乾燥材料のいずれかによって感覚器の開口部の閉塞を観察している。飼育および取り扱い昆虫が標的感覚器に接触しないようにするとき、これらの障害を避けるために、注意しなければならない。チュウに加えて損傷を受けていない、健康的なテスト昆虫、生物学的年齢などの要因、レコーディングの変動を軽減するためのコントロールを確立する際に考慮すべき状態とzeitgeber時間を交配、状態を供給することを歌う。 これは、一貫して応答性の製剤を得ることが困難となる。多くの試験は、個々のスパイクを解決するのに十分な信号対雑音比を改善することが必要であり得る。前述の準備に関する実験的変形がより良い結果につながる可能性があります。それは、スクロースまたはキニーネのような一般的な昆虫スパイクエリシターを使用して、あなたの試験種については、記録装置に強固な応答を確立することをお勧めします。味覚感覚子が応答したら、これらの応答は再現すべきである。刺激間の時間の長さの最小値は、実験的に異なる時間的制約の下でスパイクのダイナミクスを調べる決定すべきである。過剰な刺激は、GRNの健康を維持し、感覚子リンパ劣化を防止するために避けるべきである。ケースTHAにはtの応答感度はプレップより多数のこれらの応答は、所与の種のために、生理学的に典型的であるという確信を提供するために取得する必要があり、最初の刺激後に急速に減少する。 いくつかの溶媒は、低い最終濃度で、GRN活性に影響を与える可能性としていくつかのテスト化学物質の溶解度は、刺激電極を製造する難しさを作成することができる。これらの考察は、試行錯誤しながら、適切なコントロールとアドレス指定することができる。使用される任意の溶媒は、反応の一貫性を確保するために、制御電解質および他の試験溶液に添加されるべきである。したがって、脆弱な組織を損傷することなく、感覚器をターゲットに直接アクセスを提供する固定化小さな昆虫は、試行錯誤が必要な場合があります。 電気生理学の主な制限は、観測されたニューロンの応答や潜在的な下流の行動反応の不幸な分離である。したがって、aがbいる化学物質への応答をテストすることが有利であるのeen生態コンテキストの結果の重要性を議論するために、特定の行動反応を誘発することが示さ。ヒント録音は、トランスジェニック動物または行動の表現型の違いを示すものを評価するためのこの技術に最適です、細胞活性の非常に正確な検出を可能にする。これらの録音はまた、神経活動の視覚的な記者に頼るシステムよりも、このような時間と振幅のダイナミクスなどのニューロンの応答に関するより多くの情報を提供します。いくつかの例において、神経応答は、行動データ12よりも容易に定量することができる。 RNA-seqのと定量RT-PCRのための組織採取は単純ですが、冷蔵や余分な水分の回避を通して細胞材料を維持する継続的な濃度と注意が必要です。 RNase活性は、RNAの品質に影響を与えることができる。したがって、組織にのみ収集し、RNA抽出全体の清浄な表面に連絡する必要があります。トラブルシューティングは定量RT-PCR私に必要なもののSは十分に文書プライマーを設計し、ターゲットとハウスキーピング遺伝子を選択する際に、最も可能性が高い落とし穴は、プロセスの初期に発生する。予想通りに相対的な発現レベルのラインに沿って均等に間隔を置いた点を表す遺伝子は、RNA-seqのと定量RT-PCRデータセット（ 図3）比較するのに有用である。例えば、等0、10、20、30、のRPKM値を示すqPCRのための遺伝子を選択し、それぞれ、試験されるべき存在量の予測可能な順序を提供する。 RNA-seqが卑しい味覚組織の我々の調査（ 図2）に遺伝子を発現するハイライトに成功しました。 ヨンエのための信頼性のある遺伝子の構築。ネッタイシマカ （AaegL1.3、http://aaegypti.vectorbase.org/GetData/Downloads/）前化学受容遺伝子識別14は、遺伝子発現が比較的容易で得点した。これらの目的のために、利用可能な遺伝子のアノテーションと関心の同定された遺伝子ファミリーと昆虫は貴重なモデル系である。正確な閾値を決定するバックグラウンドノイズ対遺伝子発現のために投機的ですが、合理的なカットオフを決定する方法は、15-17をご利用いただけます。ここでは、完全な信頼と私たちは、結果の私達の議論を額装したことにより、先例9に基づいて減少した信頼の下RPKMレベルのRPKMレベルを決定した。 今後は、昆虫忌避性を仲介する遺伝子の我々の知識を拡張するために蚊やその他の経済的に重要な昆虫の両方で他の化学感覚の組織を分析したいと考えています。私たちは、最も可能性の高い利用可能な官能データ13を有する種への遺伝子配列を比較することによって嫌悪化合物に対する応答を媒介しているいくつかの候補味覚遺伝子を確立している。我々は、これらの個々の化学感覚の遺伝子が欠落して蚊のトランスジェニック系統を生成している。私たちは、知られている忌避剤を検出するために、動物の能力にこれらの遺伝子の役割を評価し、REPEにこれらの変異体の行動反応を評価するために、先端の録音を使用しますllents。これらの候補遺伝子が有意に撥水性に影響を与えないことの例において、より分解能がより正確に単一感覚子または細胞における遺伝子発現またはタンパク質の存在を決定する必要があるかもしれない。低い発現される受容体は、遍在的に発現される共受容体と一緒に、新規な忌避剤をスクリーニングするための重要な標的であり得る。残念ながら、in situハイブリダイゼーションおよび免疫学昆虫味覚組織18における驚くほど困難であることが判明した。 我々はこれらの生理反応や行動を媒介する遺伝子が確立したら、我々は、候補忌避剤のハイスループットスクリーニングに適している細胞系においてこれらの遺伝子を発現することができる。また、化合物の種類は、特定の受容体からの強い応答を誘発するかを予測するのに有用であり得る構造モデリング7を使用するインシリコアプローチで。

DEET、Picaridin、シトロネラールとIR3535のような化合物は、効果的に重要な病気のベクトル1,2 ネッタイシマカヒトスジシマカなどの蚊を、撃退することが示されている。私たちは、蚊の忌避に関与する細胞を決定するために、特定の味覚感覚器に関連した感覚ニューロンからの活動電位を記録します。これらの組織で発現された遺伝子の下流の配列決定と相まって、我々は、改善された撥水性機能のための新規な化合物をスクリーニングするために最も可能性の高いこれらの細胞の応答を媒介する遺伝子を同定することができる。 RNA-seqが迅速に遺伝子発現の時間的·空間的変化を追跡するための標準になりつつ、強力なツールです。昆虫化学感覚付属や臓器のRNA-seqの分析が大幅に遺伝子6により従来のPCRベースの検索遺伝子に改善し、いくつかの昆虫種3-5の分子受容体を発見するために使用されている。昆虫は最も多様な動物のクラスを表す、事前遺伝子とユニークな表現型との間の接続を研究する多くの機会をセンディング。 RNA-seqの技術は、あらゆる生きている昆虫の組織に採用することができる。同様に、uniporous味覚感覚器内の感覚細胞からの電気生理学的記録は、多くの異なる昆虫種で達成することができる。これら2つの技術のペアリングは、研究者が観測された化学感覚表現型に関与セット遺伝子を絞り込むことができます。異なる種は、特定の課題を提示するが、化学感覚受容体遺伝子および化学感覚適応の間の接続を通知することができる。化学感覚感覚器のサイズおよび形態は可変であり、活動電位を記録する際のノイズを低減し、反復可能な信号を識別するために大規模なトラブルシューティングを必要とする場合がある。化学感覚器官の解剖は、昆虫の形態およびサイズ​​に応じて、些細なまたは繊細で時間がかかるかもしれない。高品質なRNAの回収は、そのような中に特定の顔料を避けるように、同様にいくつかのトラブルシューティングが必要な場合があります組織収集。 行動試験によって忌避化合物の効果を実証する直接的で有益であるが、このアプローチは、時間の作用機構に関して集中的かつ広い。 RNA-seqのと相まって電気生理学は、昆虫に回避行動を駆動何のより具体的な分析が可能になります。化学的差別の「キット」は、昆虫種で同定されたならば、既知の忌避剤に改善するためのより具体的な試みが可能である。これらの行動に関与する感覚細胞における受容体および関連タンパク質は、直接的な化学スクリーニングのために、異種発現されてもよい。さらに、分子モデリングは、化学物質は、これらの受容体7からの強い応答を誘発するかを予測することができます。 化学感覚組織の狭いセット内のすべてのアクティブな遺伝子のスナップショットは、他の種における類似の遺伝子を同定するのに有用であり得る。配列相同性および発現シを使用してmilarities、研究者は、最も可能性の昆虫に広く有効である忌避剤に対する応答を媒介する受容体分子の集合を形成することができる。私たちは、昆虫の化学感覚経路を解体の研究者を支援する非モデルと経済的に重要な昆虫のneuroethology掘り下げるために多くを説得するために以下のプロトコルを提示する。

<table><tbody><tr><td>Glass capillary</td><td>A-M Systems</td><td>628000</td><td>Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4&quot;</td></tr><tr><td>Silver wire</td><td>A-M Systems</td><td>7875</td><td>.015&quot; bare</td></tr><tr><td>Tungsten wire</td><td>Alfa Products</td><td>369</td><td>0.127 mm diameter</td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252</td><td>#5SF Inox</td></tr><tr><td>Refridgerated stage</td><td>BioQuip Products</td><td>1429</td><td>Chill Table</td></tr><tr><td>Preamplifier</td><td>Syntech</td><td>Taste Probe</td><td>preamplifier</td></tr><tr><td>Software for electrophysiology</td><td>Syntech</td><td>Autospike</td><td>software for electrophysiology</td></tr><tr><td>TetraMin fish food</td><td>Tetra</td><td>Tropical fish food granules</td><td>fish food ground to fine powder</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>RNA isolation reagent</td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74136</td><td>includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns</td></tr><tr><td>Nanodrop spectrophotometer</td><td>Nano Drop Products</td><td>ND-1000</td><td>tabletop spectrometer</td></tr><tr><td>R statistics</td><td>freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka)</td><td>www.r-project.org</td><td>Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.</td></tr><tr><td>1.5 ml tube rack</td><td>Evergreen</td><td>240-6388-030</td><td>Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.</td></tr><tr><td>1.5 ml collection tubes with pestle</td><td>Grainger</td><td>6HAX6</td><td>RNase free</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>11178160</td><td>Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube.</td></tr><tr><td>Primer-BLAST Primer Designing tool</td><td>NCBI</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

physiological recordings and rna sequencing of the gustatory appendages of the yellow-fever mosquito aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

アエからの活動電位のトレース記録。ネッタイシマカ味覚感覚器（ 図1）化学物質の範囲の直接刺激の有効性を示す。この技術は、合理的な時間範囲（一般に500ms未満）にわたって所定の振幅と持続時間のスパイクをカウントすることによって、任意の刺激の化学への応答を定量することができる。トレース記録は、実験条件の所定のセットの下で容易に再現可能でなければなりません。そうでない場合には、観察された生理学的反応は、試験動物種の個体間の珍しい表現型を表すことができる。 生RNA-seqのデータは、丸みを帯びたRPKM（マップされた数がマッピングされた読み取り万人当たりの転写産物のキロベースの長さごとに読み込む）またはFPKM（百万分の転写産物のキロベース長さ当たりの読み取りフラグメントの数がマッピングされた読み取り）として表示される前にろ過し、正確なマッピングが必要です数値は（ 図2）。の区別これら二つのRNA-seqの正規化手法は、2つの精液の作品10,11に記載されている。全mRNA配列決定の一つの利点は、同時に大きな遺伝子ファミリーの発現を検出する能力である。一度に多くの遺伝子の発現の視覚的な表現は、与えられた組織のための分子ツールセットのユニークな理解を可能にします。性別、発生段階または組織型間の比較は、迅速に行うことができる。 RNA-seqのデータセットのための生物学的反復は、コストまたは組織収集の難しさによって制限され得る。定量RT-PCRは、より少ないコストでトータル遺伝子発現の小さなサブセットを検証する機能を提供し、より少ないソースRNAが必要です。 （ 図3A）の2つの方法が、遺伝子資源量推定のための別の化学的性質に依存しているように、RNA-seqの結果に大きな自信を可能側のデータの比較によってサイド。統計的な等価な機能（ 図3B）は、それぞれの場合に確実に制限を実証する。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52088/52088fig1highres.jpg" /> 図1： ヨンエの唇弁上の中型の感覚子から電気生理学的記録。引用されたワーク12から変更されたネッタイシマカ雌は、。トレースは100mMのNaCl、100mMのスクロース、1mMのキニーネ、0.8％DEET、0.8％Picaridin、0.8％シトロネラール、0.8％IR3535への応答を示している。異なる振幅または形状を持つ3つのスパイクが、B又はCのラベルが付いています。それぞれ、塩、砂糖、苦い：これらの3のスパイクは異なる感度を持つ3つの感覚ニューロンのサブタイプに対応しています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52088/52088fig2highres.jpg" /> 図2：8組織サンプルのためRNA-seqのにより決定引用したワーク13から修正された味覚受容体遺伝子発現の表個々の細胞のためRPKM値を報告各味覚遺伝子アノテーション、男性の組織（左）とメスの組織（右）。数値は、四捨五入に丸められます。ヒートマップの色の強度が最も高いRPKMを上限とし、中間点は、個別に各遺伝子ファミリーのためにスケーリングされます。この場合に示されている唯一の遺伝子ファミリーがある。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52088/52088fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52088/52088fig3highres.jpg" /> 図3：引用したワーク13から修正のqRT-PCRデータおよびRNA-seqのデータの比較（A）の横軸の各化学受容遺伝子は、二つのデータ列で表される。左の列は、RNA-seqのによって決定された相対的な発現を示す。化学受容遺伝子のRPKM値は、この組織における数値の比率を生成するために、ハウスキーピング遺伝子Aaeg LASPのそれで割った。右定量RT-PCRによって決定された列は、相対式を表します。まず、labella遺伝子の生物学的レプリケートのCt値は、標準としてAaeg LASPを用いて正規化した。第二に、各遺伝子のCt値は、相対的な発現値（ - （Ctは[対象] -Ct [参照]）E ターゲット ） を計算するために使用された複製。エラーバーは、個別に計算された相対的な発現値の標準偏差を示す。（B）RNA-seqの及び定量RT-PCRのデータセットは、別々の分析で比較した。 1の値は、ハウスキーピング遺伝子Aaeg LASPに帰属され、他のすべての遺伝子発現が、 ​​この値を基準に報告された状態で、RNA-seqのデータによって示されるように、縦軸は相対的な遺伝子の存在量を表す。 1の値は、ハウスキーピング遺伝子Aaeg LASPに帰属され、他のすべての遺伝子の発現は、この値を基準に報告されて、定量RT-PCRによって予測されるように、横軸は相対的な遺伝子の存在量を表す。赤い線は正確な等価性を表す。破線は、統計的な等価アルゴリズム9によって計算斜面のための「類似性のある領域」、の境界を表す。黒い実線は、円データポイントによって表される各、RNA-seqの12標的遺伝子のための定量化とAaeg LASPのハウスキーピング遺伝子に定量RT-PCRの等価の最小二乗回帰を表す。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52088/52088fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

電気生理学的検査によって決定されるようネッタイシマカの主要な味覚付属における遺伝子発現を評価するために2つの方法を使用して、我々は、推定される苦味反発化合物に神経細胞応答の根底にある遺伝子のセットを同定した。

生理的録音と黄熱病の蚊の味覚付属器RNAの配列決定<em&gt;ネッタイシマカ</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

physiological-recordings-rna-sequencing-gustatory-appendages-yellow

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

8.0K ビュー.  United States Department of Agriculture. 電気生理学的検査によって決定されるようネッタイシマカの主要な味覚付属における遺伝子発現を評価するために2つの方法を使用して、我々は、推定される苦味反発化合物に神経細胞応答の根底にある遺伝子のセットを同定した。 

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Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

昆虫における単一感覚子録音キイロショウジョウバエとハマダラカ</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

神経科学

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

AEから中腸と唾液腺の解剖。ネッタイシマカ蚊

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

生物学

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

黄熱病の蚊から血球を収集し、染色のためのプロトコルネッタイシマカ</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

免疫・感染学

Genome Editing in the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti using CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering field and opened the doors for precise genome editing in multiple species, including non-model organisms. In the mosquito Aedes aegypti, loss-of-function mutations and DNA insertions have been accomplished with this technology. Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology, focusing on both the generation of gene knockout and knockin lines. In this protocol, quartz needles are filled with a mixture of guide RNA, recombinant Cas9, and a plasmid containing a DNA cassette encoding a gene for a fluorescent marker, if gene knockin is desired. Embryos at the preblastoderm stage are lined up onto a strip of double-sided sticky tape placed onto a coverslip, which is subsequently mounted onto a glass slide. With the help of a microinjector, the needles are inserted gently into the posterior end of the embryos and a small volume of the CRISPR mixture is dispensed. When the embryos are hatched, the larvae are checked under the fluorescent scope, and the pupae are sex-sorted and separated in different cages. Once the adults emerge, these are reciprocally crossed with wild-type individuals, blood-fed, and placed for egg laying. Once these eggs are hatched, the fluorescent larvae collected represent individuals with stable insertion of the DNA cassette into their genome. These larvae are then grown to the adult stage, outcrossed to wild-type individuals, and then further assessed through molecular techniques to confirm that the exact sequence of the DNA cassette is present at the desired site of the mosquito genome. Homozygous lines can also be obtained by following the provided pipeline of crossing schema and molecular screening of the mutations.

Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology.

CRISPR-Cas9を用いた黄熱病ネ ッタイシマカ のゲノム編集

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering ...

遺伝学

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In the laboratory, researchers can deliver animal-derived and artificial blood meals to mosquitoes via membrane feeders, which allow for manipulation of meal composition. Here, we present methods for feeding blood and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes and quantifying the volume consumed by individual females.
Targeted feeding and quantification of artificial/blood meals have broad uses, including testing the effects of meal components on mosquito behavior and physiology, delivering pharmacological compounds without injection, and infecting mosquitoes with specific pathogens. Adding fluorescein dye to the meal prior to feeding allows for subsequent meal size quantification. The meal volume consumed by mosquitoes can be measured either by weight, if the females are to be used later for behavioral experiments, or by homogenizing individual females in 96-well plates and measuring fluorescence levels using a plate reader as an endpoint assay. Meal size quantification can be used to determine whether changing the meal components alters the meal volume ingested or if meal consumption differs between mosquito strains. Precise meal size quantification is also critical for downstream assays, such as those measuring effects on host attraction or fecundity. The methods presented here can be further adapted to track meal digestion over the course of days or to include multiple distinguishable markers added to different meals (like nectar and blood) to quantify the consumption of each meal by a single mosquito.
These methods allow researchers to singlehandedly perform high-throughput measurements to compare the meal volume consumed by hundreds of individual mosquitoes. These tools will therefore be broadly useful to the community of mosquito researchers for answering diverse biological questions.

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

The goal of this protocol is to deliver animal-derived and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes through an artificial membrane feeder and precisely quantify the volume of meal ingested.

アエデスアエジプティ蚊の動物由来血液と人工食事の摂食と定量化

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

Heterologous Expression and Functional Analysis of Aedes aegypti Odorant Receptors to Human Odors in Xenopus Oocytes

The mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), a vector of many important human diseases including yellow fever, dengue fever and Zika fever, shows a strong preference for human hosts over other warm-blooded animals for blood meals. Olfactory cues play a critical role for mosquitoes as they explore their environment and seek a human host to obtain blood meals, thus transmitting human diseases. Odorant receptors (ORs) expressed in the olfactory sensory neurons are known to be responsible for the interaction of mosquito vectors with human odors. To gain deeper insights into Ae. aegypti&#8217;s olfactory physiology and investigate their interactions with humans at the molecular level, we used an optimized protocol of Xenopus Oocytes heterologous expression to functionally analyze Ae. aegypti odorant receptors in response to human odors. Three example experiments are presented: 1) Cloning and synthesizing cRNAs of ORs and odorant receptor co-receptor&#160;(Orco) from four to six days old Ae. aegypti antennae; 2) Microinjection and expression of ORs and Orco in Xenopus oocytes; and 3) Whole-cell current recording from Xenopus oocytes expressing mosquito ORs/Orco with a two-electrode voltage-clamp. These optimized procedures provide a new way for researchers to investigate human odor reception in Aedes mosquitoes and reveal the underlying mechanisms governing their host-seeking activity at a molecular level.

Heterologous Expression and Functional Analysis of Aedes aegypti Odorant Receptors to Human Odors in Xenopus Oocytes

A protocol is presented that functionally characterizes mosquito ORs in response to human odors using a Xenopus oocyte expression system coupled with a two-electrode voltage clamp, providing a powerful new technique for exploring the responses of mosquitoes ORs to exposure to human odors.

The mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), a vector of many important human diseases including yellow fever, dengue fever and Zika fever, shows a strong ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

アジアのタイガーモスキートにおける日長休眠のRNA-seqの分析のための実験とバイオインフォマティクス·プロトコル、<em&gt;ヒトスジシマカ</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect fat body tissue is usually distributed throughout the insect body. However, it is often concentrated in the abdomen and attached to the abdominal body wall.
The mosquito fat body is the sole source of yolk proteins, which are critical for egg production. Therefore, the in vitro culture of mosquito fat body tissues represents an important system for the study of mosquito physiology, metabolism, and, ultimately, egg production. The fat body culture process begins with the preparation of solutions and reagents, including amino acid stock solutions, Aedes physiological saline salt stock solution (APS), calcium stock solution, and fat body culture medium. The process continues with fat body dissection, followed by an experimental treatment. After treatment, a variety of different analyses can be performed, including RNA sequencing (RNA-Seq), qPCR, Western blots, proteomics, and metabolomics.
In our example experiment, we demonstrate the protocol through the excision and culture of fat bodies from the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, a principal vector of arboviruses including dengue, chikungunya, and Zika. RNA from fat bodies cultured under a physiological condition known to upregulate yolk proteins versus the control were subject to RNA-Seq analysis to demonstrate the potential utility of this procedure for investigations of gene expression.

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The fat body is the central metabolic organ in insects. We present a live organ culture system that enables the user to study the responses of isolated fat body tissue to various stimuli.

ネッタイシマカジカのベクトルで脂肪ボディ臓器培養システム

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high quality and quantity DNA from a well-preserved individual mosquito sufficient for downstream whole genome sequencing. However, reliance on an expensive automated DNA extraction instrument can be prohibitive for many laboratories. Here, the study provides a budget-friendly magnetic-bead-based DNA extraction protocol, which is suitable for low to medium throughput. The protocol described here was successfully tested using individual Aedes aegypti mosquito samples. The reduced costs associated with high quality DNA extraction will increase the application of high throughput sequencing to resource limited labs and studies.

Described here is a DNA extraction protocol using magnetic beads to produce high quality DNA extractions from mosquitoes. These extractions are suitable for a downstream next-generation sequencing approach.

次世代シーケンシングのための磁気ビーズベースの蚊DNA抽出プロトコル

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

生理的録音と黄熱病の蚊の味覚付属器RNAの配列決定

要約

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この動画の章

昆虫における単一感覚子録音キイロショウジョウバエとハマダラカ

AEから中腸と唾液腺の解剖。ネッタイシマカ蚊

黄熱病の蚊から血球を収集し、染色のためのプロトコルネッタイシマカ

CRISPR-Cas9を用いた黄熱病ネッタイシマカのゲノム編集

アエデスアエジプティ蚊の動物由来血液と人工食事の摂食と定量化

Heterologous Expression and Functional Analysis of Aedes aegypti Odorant Receptors to Human Odors in Xenopus Oocytes

アジアのタイガーモスキートにおける日長休眠のRNA-seqの分析のための実験とバイオインフォマティクス·プロトコル、

ネッタイシマカジカのベクトルで脂肪ボディ臓器培養システム

次世代シーケンシングのための磁気ビーズベースの蚊DNA抽出プロトコル

成虫のアノフェレスガンビアエ蚊への効果的な経口RNA干渉(RNAi)投与

生理的録音と黄熱病の蚊の味覚付属器RNAの配列決定

要約

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昆虫における単一感覚子録音キイロショウジョウバエとハマダラカ

AEから中腸と唾液腺の解剖。ネッタイシマカ蚊

黄熱病の蚊から血球を収集し、染色のためのプロトコルネッタイシマカ

CRISPR-Cas9を用いた黄熱病ネ ッタイシマカ のゲノム編集

アエデスアエジプティ蚊の動物由来血液と人工食事の摂食と定量化

Heterologous Expression and Functional Analysis of Aedes aegypti Odorant Receptors to Human Odors in Xenopus Oocytes

アジアのタイガーモスキートにおける日長休眠のRNA-seqの分析のための実験とバイオインフォマティクス·プロトコル、

ネッタイシマカジカのベクトルで脂肪ボディ臓器培養システム

次世代シーケンシングのための磁気ビーズベースの蚊DNA抽出プロトコル

成虫 のアノフェレスガンビアエ 蚊への効果的な経口RNA干渉(RNAi)投与

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成虫のアノフェレスガンビアエ蚊への効果的な経口RNA干渉(RNAi)投与