Name: physiological recordings and rna sequencing of the gustatory appendages of the yellow-fever mosquito aedes aegypti
Uploaded: 2014-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti at JoVE.com

The authors thank Bryan T. Vinyard of the USDA, Agricultural Research Service, Henry A. Wallace Beltsville Agricultural Research Center, Biometrical Consulting Service, Beltsville, MD for statistical analyses. This work was supported in part by a grant to J.C.D. from the Deployed War Fighter Protection (DWFP) Research Program funded by the Department of Defense through the Armed Forces Pest Management Board (AFPMB).

1. Crianza Ae. adultos aegypti <ol><li> Los huevos eclosionan en aproximadamente ¾ de pulgada de agua en la bandeja poco profunda. El hacinamiento reducirá el tamaño de los adultos. </li><li> Larvas posterior a 25 ° C (12 hL: 12-HD) y alimentarlos con comida para peces suelo. NOTA: La sobrealimentación puede reducir las tasas de supervivencia. </li><li> Retire pupas individualmente por pipeta Pasteur diario y transferir a los platos de plástico (9 cm x 5,5 cm) dentro de pequeños cubos de contención con tapas de malla fina, estableciendo así 24 grupos de edad hr. </li><li> Alimentación mosquitos adultos 10% de solución de sacarosa por bola de algodón colocado en las paredes de pantalla de una carcasa de la jaula de los mosquitos en una cámara ambiental a 27 ° C y humedad relativa del 70% bajo el mismo fotoperiodo como larvas. </li><li> Para electrofisiología, utilice 5-10 días los animales viejos. En general, los animales más grandes producirán mejores resultados. Para el aislamiento de ARN, utilizar animales que están dentro de un mismo grupo de edad de 24 horas en el rango de edad 5-10 días. </li></ol><ol><li> Determinar una concentración adecuada de electrolito (por ejemplo, 1-10 mM) que provoca una mínima actividad de las neuronas sensoriales seleccionados. NaCl 10 mM o 1 mM KCl son electrolitos razonables para poner a prueba la actividad basal al comenzar un experimento. </li><li> Disolver cada producto químico experimental en un disolvente apropiado (si no el agua, utilizar etanol o DMSO) que tiene poco o ningún efecto sobre la actividad de pico en comparación con electrolito solo. Las concentraciones finales de etanol al 10% o 1% de DMSO son concentraciones de partida razonables. </li><li> Seleccionar apropiado (por ejemplo la quinina por amargo o sacarosa para dulces) productos químicos de control que están bien descritos disuasorias de la alimentación o estimulantes en los insectos. </li></ol> 3. Electrofisiología (grabación punta 8. La figura 1) <ol><li> Electrodos de vidrio Forma tirando mecánicamente capilares de vidrio. Optimizar calor y tire ajustes para tirar de vidrio para formar recordi forma apropiadaelectrodos NG. Romper con cuidado extremo del electrodo de vidrio usando pinzas bajo un microscopio de disección para crear electrodo de punta abertura que es lo suficientemente amplia como para envolver sensillum objetivo, pero lo suficientemente pequeño para evitar el contacto con las estructuras vecinas. </li><li> Bajo el microscopio, identificar visualmente por la morfología y la posición del objetivo sensilla / sensillum para asegurar la repetibilidad de grabación punta. Animales de preparación para permitir el libre acceso a sensilla de ángulo de entrada del electrodo. </li><li> Insectos anestesiar adultos fríos en el congelador a -20 ° C. Evitar daños a las neuronas periféricas por la sobreexposición a las bajas temperaturas. Cortar tiras angostas de cinta de celofán con hoja de afeitar en portaobjetos de vidrio. Inmovilizar todo insecto en un portaobjetos de vidrio utilizando tiras estrechas. </li><li> Insertar un alambre de tungsteno afilado químicamente en el tórax dorsal o el ojo para servir como el electrodo (tierra) indiferente. </li><li> Rellene electrodo de vidrio realizada en el paso 3.1 con una solución estimulante de interés. Usando una jeringa insertada, la tapa de llenadoIllary desde finales tirado al extremo romo. Flick a cabo todas las burbujas de aire, la celebración de fin derribado. Inserte un alambre de plata (cloruración opcional) en el electrodo de vidrio realizada en el paso 3.1 para servir como registro y electrodo de estimulación. </li><li> Conectar los electrodos a un preamplificador que está diseñado para grabaciones de contacto quimiorreceptora sensilla en los insectos. Este preamplificador (300 Hz-3 filtro de banda kHz) reducirá el tiempo de establecimiento para capturar la actividad neuronal tan cerca a los estímulos introducción posible. Recoger, almacenar y analizar las señales eléctricas utilizando un microordenador equipado con software de grabación de espiga. NOTA: Conexión a tierra del sistema de grabación correctamente puede mejorar drásticamente la relación señal-ruido. </li><li> Estimular sensilla con una solución de control (sólo electrolito) para asegurar la funcionalidad. Cuente picos a partir de 200 ms siguientes el artefacto de estímulo para todas las preparaciones. </li><li> Selección aleatoria de la orden de sustancias químicas de prueba para todos los experimentos, excepto los estudios de dosis-respuesta,para eliminar los prejuicios. Para los estudios de dosis-respuesta, exponer sensilla a concentraciones crecientes de la sustancia química experimental. Permita un mínimo de 3 minutos entre estímulos para asegurar una adecuada recuperación. NOTA: Este requisito puede variar dependiendo de los insectos y sensilla. Umbral se define como la concentración para la cual el error estándar no se superponga con el error estándar para la concentración más baja ensayada. </li></ol> 4. Aislamiento de ARN y secuenciación (Figura 2) <ol><li> Preparar las majas RNasa libre herméticamente cerradas al enfriarlos en hielo seco antes de tejido disruption.Prepare acompañan majas sin RNasa para aerosol que se ajusten a los tubos de tapa a presión con fuerza. Mantenga los tubos de recogida cerrados a menos que la disección de forma activa para evitar el exceso de condensación. </li><li> Utilizando aspirador filtrada, colocar 30 a 40 mosquitos en frío anestesiados (15 seg en congelador a -20ºC) en el escenario frío y ordenar por sexo. Coloque los animales dorsal lado de abajo, agarrando las alas para no dañar apéndices gustativas.</li><li> El uso de dos pares de pinzas finas, diseccionar labella emparejado o tarsos de los machos o hembras con un microscopio de disección y limitar la inclusión de los tejidos adyacentes. NOTA: 500 labella emparejado rinde aproximadamente 800-1,000 nanogramos de mRNA total. 400 tarsos individual (5 segmentos cada uno) producen 1,200-1,800 nanogramos de mRNA total. </li><li> Con un par de fórceps-jadeantes, ligeramente captar proboscis de mosquitos justo proximal a labella exponer estiletes interiores. Uso de otro par de collection-forceps, quitar y agregar labella tejido a lado del tubo de recogida de frío. </li><li> Con un par de fórceps, ligeramente captar la pierna mosquito en la salida de la tibia y el primer segmento tarsal. Uso de otro par de pinzas, retire tarsos y añadir tejido a lado del tubo de recogida de frío. NOTA: Tener en cuenta los tipos de células en la superficie del tejido deseado y no deseado. Si bien es importante para limitar la inclusión de los tejidos vecinos, es igualmente importante no omitir porciones de tejido deseado. El fimuestra final debe representar con precisión todo el órgano de interés. Crear un límite preciso con las pinzas de agarre de tal manera que el fórceps de recogida pueden liberar precisamente por raspado o agarrar sólo el tejido deseado. </li><li> Periódicamente, de girar el tubo de recogida brevemente en 0 ° C centrifugar a 9000 xg para mantener el tejido en la parte inferior del tubo. Si la humedad se acumula en tubos de recogida durante la disección, añadir 50uL de reactivo Trizol fría para cubrir el tejido recogido. </li><li> El uso de marcadores de laboratorio anti-manchas, identificándolas claramente uno-RNasa libre de 1,5 ml encajen tubo con tapa para cada tipo de tejido para su recogida. El uso de 1,5 ml Gradilla para tubos y nitrógeno líquido, por congelación luego moler tejido en polvo fino (finas piezas si en Trizol). Repetir una vez. Aumentar el volumen total de Trizol a 1 ml y resuspender tejido fundamental por agitación. </li><li> Añadir 200 ul de cloroformo y mezclar bien. Después de 5 min a temperatura ambiente, de girar en centrífuga a 4 ° C y 11.000 xg durante 15 min. Cuidadosamenteañadir capa acuosa directamente a una columna de filtro de ADN genómico. Centrifugar a 11.000 x g durante 5 min. Añadir un volumen igual de RNasa libre de 70% de etanol a fluir a través y mezclar pipeta. Traslado líquido a una columna colección ARN y continuar la extracción de RNA según las instrucciones proporcionadas. </li><li> Cuantificar y evaluar la pureza del ARN total en un espectrofotómetro precisión y proceder con cualquier método de secuenciación de ARN estándar. </li></ol> 5. RT-PCR cuantitativa Validación de RNA Sequencing (Figura 3) <ol><li> Seleccione tantos genes como posible comparar relativos niveles de expresión génica en un rango dinámico, tanto en abundancia predicho secuencia y función de los genes quimiosensorial presunta. </li><li> Pares de cebadores de diseño para cada gen diana para amplificar un 100 a 180 pares de bases producto de PCR específico. Excluir amplificación gDNA no específica asegurando al menos un cebador por juego abarca un límite de intrón. También puede utilizar el tratamiento DNasa para reducir la contaminación genómica. </li><li> Recogertejido de insectos como se describe en la sección anterior. Calcular la cantidad de tejido que se requiere para proporcionar suficiente ARN para completar todas las reacciones QRT-PCR. NOTA: triplicado Biológica y reacciones por triplicado técnicos proporcionarán máxima confianza en los resultados. </li><li> Calcula la cuantificación relativa de genes como objetivo X - (Ct [target] -Ct [referencia]) para cada gen diana y medio para cada replicar, tanto biológica como técnico. Utilice gen (s) de limpieza para normalizar los valores de Ct entre las réplicas biológicas y erradicar la escala del eje Y en las comparaciones de expresión relativa. </li><li> Evaluar la similitud de RNA-seq y conjuntos de datos qRT-PCR utilizando el, procedimiento de equivalencia de arranque basado en la regresión 9, iterativa aplicado, a los datos de cada tejido. NOTA: Este procedimiento identifica la &quot;región de similitud&quot; más pequeño que puede ser construido en torno a los datos de RNA-seq y QRT-PCR observado, y permitir la expresión génica relativa medido por QRT-PCR para ser considerado estadísticamente equivalente a la medición de la expresión génica relativa por RNA-seq. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

El aspecto más difícil de potenciales de acción de grabación de sensilla gustativa es decidir qué respuestas son &quot;normales&quot;. Cuando se emplea un solo punta sensillum gustativa grabar la primera vez que una especie de insectos dado, el número total y sensibilidades de las neuronas receptoras gustativas (GRNs) son probablemente desconocido. Muchas grabaciones preliminares primera obligados a decidir el alcance y las concentraciones de los productos químicos para probar. En este caso, empezamos con la observación de que un solo GRN respondió a bajas concentraciones de DEET (Figura 1). Posteriormente, se examinaron las respuestas dentro de la misma sensillum a un rango de concentraciones de sustancias químicas conocidas por ser amargo o aversivo a otros insectos y observamos una forma similar y pico de amplitud (Figura 1). Estas observaciones sugirieron que un único subtipo GRN responde a estos compuestos aversivos. Para la comparación, hemos probado compuestos azucarados conocidos para estimular la alimentación en Mosquitoes para ver si se ha producido un aumento similar. Se observó un pico diferente, más grande en este caso. Del mismo modo, se observó tercera espiga, de tamaño intermedio en respuesta a la estimulación sal, con lo que el recuento total de GRN subtipo a tres. Preparaciones de registro electrofisiológico en los insectos son inherentemente variable. Target sensilla gustativa son típicamente muy pequeña, y debe colocarse en el ángulo correspondiente para acceder a la grabación con el electrodo de vidrio sin tocar a la cutícula. Para establecer un puente conductor a las neuronas gustativas, el poro terminal de la sensillum debe estar abierto a la linfa contenida establecer un contacto directo con el electrolito de la electrodo de registro. Hemos observado obstrucción de las aberturas sensilla, ya sea por los residuos extraños o excretado y material seco desde dentro del sensillum objetivo. Para evitar estos obstáculos, se debe tener cuidado cuando la cría y manejo de insectos para evitar el contacto con la sensilla objetivo. Además en Choocantar, insectos de ensayo sanos sin daños, factores biológicos como la edad, la alimentación de estado, el apareamiento tiempo estatal y zeitgeber se debe considerar al establecer controles para reducir la variabilidad en las grabaciones. Puede ser difícil para obtener una preparación de respuesta consistente. Muchos ensayos pueden ser necesarios para mejorar la relación suficiente de señal a ruido para resolver los picos individuales. Variaciones experimentales sobre los preparados mencionados pueden conducir a mejores resultados. Es aconsejable establecer una respuesta contundente en su aparato de registro para sus especies de prueba utilizando un inductor pico insecto común, como la sacarosa o la quinina. Una vez que un sensillum gustativa está respondiendo, estas respuestas deben ser reproducibles. La longitud mínima de tiempo entre estimulaciones se debe determinar experimentalmente el examen de la dinámica de pico bajo diferentes restricciones temporales. La estimulación excesiva debe evitarse para preservar GRN salud y para prevenir la degradación linfático sensillum. En el caso del thasensibilidad t respuesta disminuye rápidamente después de la primera estimulación, un mayor número de preps se debe obtener para proporcionar la confianza que estas respuestas son fisiológicamente típico para la especie dada. La solubilidad de algunas sustancias problema puede crear dificultades para hacer electrodos de estimulación, ya que algunos disolventes pueden afectar la actividad GRN, incluso a concentraciones finales bajas. Estas consideraciones pueden ser abordados a través de ensayo y error y con controles apropiados. Cualquier disolvente utilizado se debe añadir al electrolito de control y otras soluciones de prueba para garantizar la coherencia de las respuestas. Pequeños insectos de inmovilización, proporcionando así acceso directo al objetivo sensilla sin dañar los tejidos frágiles, pueden requerir de ensayo y error. La principal limitación de electrofisiología es la desafortunada separación de las respuestas neuronales observadas y potenciales respuestas de comportamiento descendente. Por lo tanto, es ventajoso para probar las respuestas a los productos químicos que han been muestra para provocar respuestas conductuales específicos con el fin de discutir la importancia de los resultados en un contexto ecológico. Grabaciones de punta permiten la detección muy precisa de la actividad celular, por lo que esta técnica ideal para la evaluación de animales transgénicos o aquellos que presentan diferencias fenotípicas en el comportamiento. Estas grabaciones también ofrecen más información acerca de las respuestas neuronales, como la dinámica temporal y de amplitud, que los sistemas que dependen de los periodistas visuales de la actividad neuronal. En algunos casos, las respuestas neuronales se pueden cuantificar con más facilidad que los datos de comportamiento 12. Colección de tejidos de RNA-seq y QRT-PCR es sencilla pero requiere concentración continua y atención a la preservación de material celular a través de una cámara frigorífica y evitar el exceso de humedad. Actividad de RNasa que puede afectar la calidad del ARN; por lo tanto, sólo debe ponerse en contacto con el tejido superficies limpias en toda la recolección y extracción de RNA. Aunque la solución de problemas requiere para QRT-PCR is bien documentado, los más probables trampas ocurren temprano en el proceso en el diseño de cebadores y la selección de genes diana y de limpieza. Los genes que previsiblemente representan puntos uniformemente espaciados a lo largo de una línea de nivel relativo de expresión son útiles para comparar RNA-seq y conjuntos de datos de QRT-PCR (Figura 3). Por ejemplo, la selección de genes para qPCR que muestran valores RPKM de 0, 10, 20, 30, etc., respectivamente, ofrecen un orden predecible de la abundancia para ser probado. RNA-seq tuvo éxito a destacar humilde expresión de genes en nuestro estudio de los tejidos gustativas (Figura 2). La acumulación de genes fiable para Ae. aegypti (AaegL1.3, http://aaegypti.vectorbase.org/GetData/Downloads/) y el gen quimiorrecepción previa identificación 14 hizo anotando la expresión de genes relativamente fácil. A estos efectos, los insectos con las anotaciones de genes disponibles y identificadas las familias de genes de interés son sistemas modelo de valor. La determinación de un umbral de precisiónpara la expresión génica contra el ruido de fondo es especulativo, pero los métodos para determinar los puntos de corte razonables están disponibles 15-17. Aquí se determinó un nivel RPKM de total confianza y un nivel más bajo de confianza RPKM disminuido basado en precedentes 9 por el que enmarcamos nuestra discusión de los resultados. En el futuro esperamos que diseccionar otros tejidos chemosensory tanto en el mosquito y otros insectos de importancia económica para ampliar nuestro conocimiento de los genes que median la repelencia de insectos. Hemos establecido varios genes gustativas candidata que son más probable mediación de las respuestas de aversión a compuestos mediante la comparación de secuencias de genes a las especies con los datos funcionales disponibles 13. Estamos generando líneas transgénicas de mosquitos que faltan estos genes chemosensory individuales. Vamos a utilizar grabaciones de punta para evaluar el papel de estos genes en la capacidad del animal para detectar repelentes conocidos y evaluar las respuestas de comportamiento de estos mutantes a repellents. En el caso de que estos genes candidatos no afectan significativamente la repelencia, puede ser necesario más de resolución para determinar más precisamente la expresión de genes o la presencia de proteínas en una sola sensillum o célula. Lowly receptores expresados ​​pueden ser objetivos críticos para el cribado de nuevos repelentes, además de co-receptores expresados ​​doquier. Desafortunadamente, hibridación in situ e inmunolocalización ha demostrado ser muy difícil en el tejido gustativo de insectos 18. Una vez que hemos establecido que los genes median estas respuestas fisiológicas y comportamientos, podemos expresar estos genes en sistemas de células que son susceptibles de cribado de alto rendimiento de los repelentes de candidatos. En silico enfoques que utilizan modelado estructural 7 también puede ser útil en la predicción de qué tipos de compuestos se provocar fuertes respuestas de receptores específicos.

Compuestos como DEET, Picaridin, citronelal y IR3535 se ha demostrado eficaz para repeler mosquitos, incluyendo las importantes vectores de enfermedades Aedes aegypti 1,2. Registramos los potenciales de acción de las neuronas sensoriales asociadas con sensilla gustativo específico para determinar las células involucradas con la repelencia de mosquitos. Junto con la secuenciación de aguas abajo de los genes expresados ​​en estos tejidos, podemos identificar los genes más probable que median las respuestas de estas células con el fin de cribar nuevos compuestos para la mejora de las capacidades de repelencia. RNA-seq es una herramienta poderosa, convirtiéndose rápidamente en estándar para el seguimiento de los cambios temporales y espaciales en la expresión génica. Análisis de RNA-seq de apéndices quimiosensoriales de insectos y los órganos se han utilizado para descubrir receptores moleculares en varias especies de insectos 3-5, mejorando en gran medida de gen convencional búsquedas basado en la PCR-6 por el gen. Los insectos representan la clase de animales más diverso, presenta muchas oportunidades para estudiar la relación entre los genes y fenotipos únicos. Tecnología de RNA-seq se puede emplear en cualquier tejido de insectos que viven. Asimismo, el registro electrofisiológico de las células sensoriales dentro de sensilla gustativa uniporous se puede lograr en muchas especies de insectos diferentes. El emparejamiento de estas dos técnicas permite a los investigadores Para limitar los genes que participan en conjunto un fenotipo observado quimiosensorial. Las diferentes especies presentarán desafíos específicos, pero pueden informar a la conexión entre los genes de los receptores quimiosensoriales y una adaptación quimiosensorial. El tamaño y la morfología de sensilla quimiosensorial es variable y pueden requerir extensa resolución de problemas durante la grabación de los potenciales de acción para reducir el ruido e identificar señales repetibles. Las disecciones de los órganos quimiosensoriales pueden ser triviales o delicada y requiere mucho tiempo, dependiendo de la morfología y el tamaño del insecto. La recuperación de ARN de alta calidad puede requerir alguna solución de problemas, así como evitar ciertos pigmentos durantela recogida de tejidos. Al tiempo que demuestran los efectos de los compuestos repelentes a través de ensayos de comportamiento es directa e informativo, este enfoque es intensiva en tiempo y amplia con respecto a mecanismo de acción. Electrofisiología junto con RNA-seq permite análisis más específicos de lo que impulsa a comportamientos de evitación en los insectos. Una vez que el &quot;kit de herramientas&quot; de la discriminación químico ha sido identificado en una especie de insecto, los intentos más específicas para mejorar en los repelentes conocidos son posibles. Los receptores y proteínas asociadas en las células sensoriales responsables de estos comportamientos pueden ser expresados ​​de forma heteróloga para la detección química directa. Además, el modelado molecular puede predecir que los productos químicos se provocar respuestas fuertes de estos receptores 7. La instantánea de todos los genes activos en un conjunto limitado de tejidos quimiosensoriales también puede ser útil en la identificación de genes similares en otras especies. Usando homología de secuencia y si la expresiónmilarities, los investigadores pueden formar conjuntos de receptores moleculares más probable que median las respuestas a los repelentes que son ampliamente eficaces en insectos. Presentamos el siguiente protocolo para ayudar a los investigadores en la deconstrucción de las vías chemosensory insectos y persuadir más que ahondar en la neuroetología de la no-modelo y los insectos de importancia económica.

<table><tbody><tr><td>Glass capillary</td><td>A-M Systems</td><td>628000</td><td>Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4&quot;</td></tr><tr><td>Silver wire</td><td>A-M Systems</td><td>7875</td><td>.015&quot; bare</td></tr><tr><td>Tungsten wire</td><td>Alfa Products</td><td>369</td><td>0.127 mm diameter</td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252</td><td>#5SF Inox</td></tr><tr><td>Refridgerated stage</td><td>BioQuip Products</td><td>1429</td><td>Chill Table</td></tr><tr><td>Preamplifier</td><td>Syntech</td><td>Taste Probe</td><td>preamplifier</td></tr><tr><td>Software for electrophysiology</td><td>Syntech</td><td>Autospike</td><td>software for electrophysiology</td></tr><tr><td>TetraMin fish food</td><td>Tetra</td><td>Tropical fish food granules</td><td>fish food ground to fine powder</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>RNA isolation reagent</td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74136</td><td>includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns</td></tr><tr><td>Nanodrop spectrophotometer</td><td>Nano Drop Products</td><td>ND-1000</td><td>tabletop spectrometer</td></tr><tr><td>R statistics</td><td>freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka)</td><td>www.r-project.org</td><td>Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.</td></tr><tr><td>1.5 ml tube rack</td><td>Evergreen</td><td>240-6388-030</td><td>Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.</td></tr><tr><td>1.5 ml collection tubes with pestle</td><td>Grainger</td><td>6HAX6</td><td>RNase free</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>11178160</td><td>Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube.</td></tr><tr><td>Primer-BLAST Primer Designing tool</td><td>NCBI</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

physiological recordings and rna sequencing of the gustatory appendages of the yellow-fever mosquito aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Los registros de Trace de potenciales de acción de Ae. aegypti sensilla gustativa (Figura 1) demuestran la eficacia de la estimulación directa con una gama de productos químicos. Esta técnica se puede utilizar para cuantificar las respuestas a la estimulación de cualquier producto químico contando los picos de una amplitud y duración dada durante un intervalo de tiempo razonable (generalmente menos de 500 ms). Grabaciones de rastreo deben ser fácilmente reproducible bajo un conjunto dado de condiciones experimentales. De lo contrario, las respuestas fisiológicas observadas pueden representar fenotipos poco comunes entre los individuos de la especie estudiada. Datos de RNA-seq Raw requiere filtración y la cartografía exacta antes de ser presentado como RPKM redondeado (el número de mapeado lee por longitud kilobases de transcripción por millón lecturas mapeadas) o FPKM (el número de fragmentos de lectura por longitud de kilobases de transcripción por millón lecturas mapeadas) valores numéricos (Figura 2). La distinción entreestos dos métodos de normalización de ARN-seq ha sido descrita en dos obras seminales 10,11. Una ventaja de secuenciación total de ARNm es la capacidad de detectar la expresión de grandes familias de genes simultáneamente. La presentación visual de la expresión de muchos genes a la vez permite una comprensión única del conjunto de herramientas moleculares para un tejido dado. Las comparaciones entre sexos, etapas de desarrollo o tipos de tejidos se pueden hacer rápidamente. Biológica repeticiones para conjuntos de datos de RNA-seq pueden estar limitadas por coste o la dificultad de la recogida de tejidos. QRT-PCR ofrece la posibilidad de validar pequeños subgrupos de la expresión génica total a un costo menor y requiere menos ARN fuente. Lado a comparaciones de datos secundarios (Figura 3A) permitir una mayor confianza en los resultados de ARN-ss, como los dos métodos se basan en diferentes químicas para la estimación de la abundancia de genes. Funciones de equivalencia estadística (Figura 3B) demuestran los límites de la seguridad en cada caso. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52088/52088fig1highres.jpg" /> Figura 1: Registros electrofisiológicos de un sensillum de tamaño mediano en el labelo de Ae. Aegypti, modificados de trabajo citado 12. Las huellas muestran respuestas a NaCl 100 mM, sacarosa 100 mM, quinina 1 mM, 0,8% de DEET, Picaridin 0,8%, 0,8% y 0,8% Citronelal IR3535. Los tres picos con diferentes amplitudes o formas se etiquetan a, b o c. Estos tres picos corresponden con tres subtipos de neuronas sensoriales con diferentes sensibilidades: sal, azúcar y amargo, respectivamente. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52088/52088fig2highres.jpg" /> Figura 2:. Tabla de gustativa expresión del gen del receptor según lo determinado por la RNA-seq para 8 muestras de tejido, modificado a partir del trabajo citado 13 células individuales reportan valores RPKM paracada anotación de genes gustativa, tejidos masculinos (izquierda) y tejidos femeninos (derecha). Los valores numéricos se redondean a la décima más cercana. Heat-mapa de intensidad de color tiene un tope más alto RPKM y el punto medio se escala para cada familia de genes de forma individual. Sólo hay una familia de genes se muestra en este caso. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52088/52088fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52088/52088fig3highres.jpg" /> Figura 3:. Comparación de los datos qRT-PCR y los datos de RNA-seq, modificados de trabajo citado 13 (A) Cada gen quimiorrecepción del eje horizontal se representa por dos columnas de datos. La columna de la izquierda representa la expresión relativa tal como se determina por la RNA-seq; Valores RPKM de genes quimiorrecepción se dividieron por el de limpieza de genes Aaeg LASP para generar proporciones numéricas en este tejido. El derechocolumna representa la expresión relativa determinada por QRT-PCR. En primer lugar, los valores de Ct para biológica replicar genes Labella se normalizaron usando Aaeg LASP como un estándar. En segundo lugar, replicar los valores de Ct para cada gen se utilizaron para calcular los valores relativos de expresión (objetivo E - (Ct [target] -Ct [referencia])). Las barras de error indican la desviación estándar de los valores de expresión relativa calculados individualmente. (B) RNA-seq y QRT-PCR datos se compararon en un análisis por separado. Los ejes verticales representan la abundancia relativa de gen como se demostró por los datos de RNA-seq, con un valor de 1 se atribuye a la limpieza de genes Aaeg LASP y el resto de la expresión de genes que se informa relación a este valor. Los ejes horizontales representan la abundancia relativa de gen como se predijo por qRT-PCR, con un valor de 1 se atribuye a la limpieza de genes Aaeg LASP y el resto de la expresión de genes que se informa relación a este valor. Las líneas rojas representan equivalencia exacta. Las líneas discontinuas representan los límites de la &quot;región de similitud &#39;de pendiente, calculada por el algoritmo de equivalencia estadística 9. Líneas negras representan la regresión de mínimos cuadrados de equivalencia QRT-PCR para la cuantificación de RNA-seq para los 12 genes diana y limpieza de genes Aaeg LASP, cada uno representado por punto círculo datos. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52088/52088fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

El uso de dos métodos para estimar la expresión génica en las principales apéndices gustativas de Aedes aegypti, hemos identificado el conjunto de genes supuestamente subyacentes a las respuestas neuronales a compuestos amargos y repulsivas, como se determina por examen electrofisiológico.

Fisiológicos Grabaciones y RNA Secuenciación de los apéndices gustativas del mosquito de la fiebre amarilla<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

8.0K vistas.  United States Department of Agriculture.  El uso de dos métodos para estimar la expresión génica en las principales apéndices gustativas de Aedes aegypti, hemos identificado el conjunto de genes supuestamente subyacentes a las respuestas neuronales a compuestos amargos y repulsivas, como se determina por examen electrofisiológico. 

Video: Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Grabaciones solo Sensillum en los insectos Drosophila melanogaster Y Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Investigación

Neurociencias

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

La disección de las glándulas salivales y del intestino medio de Ae. aegypti

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Biología

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Un protocolo para la recolección y la tinción de los hemocitos del mosquito de la fiebre amarilla Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Inmunología e Infección

Genome Editing in the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti using CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering field and opened the doors for precise genome editing in multiple species, including non-model organisms. In the mosquito Aedes aegypti, loss-of-function mutations and DNA insertions have been accomplished with this technology. Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology, focusing on both the generation of gene knockout and knockin lines. In this protocol, quartz needles are filled with a mixture of guide RNA, recombinant Cas9, and a plasmid containing a DNA cassette encoding a gene for a fluorescent marker, if gene knockin is desired. Embryos at the preblastoderm stage are lined up onto a strip of double-sided sticky tape placed onto a coverslip, which is subsequently mounted onto a glass slide. With the help of a microinjector, the needles are inserted gently into the posterior end of the embryos and a small volume of the CRISPR mixture is dispensed. When the embryos are hatched, the larvae are checked under the fluorescent scope, and the pupae are sex-sorted and separated in different cages. Once the adults emerge, these are reciprocally crossed with wild-type individuals, blood-fed, and placed for egg laying. Once these eggs are hatched, the fluorescent larvae collected represent individuals with stable insertion of the DNA cassette into their genome. These larvae are then grown to the adult stage, outcrossed to wild-type individuals, and then further assessed through molecular techniques to confirm that the exact sequence of the DNA cassette is present at the desired site of the mosquito genome. Homozygous lines can also be obtained by following the provided pipeline of crossing schema and molecular screening of the mutations.

Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology.

Edición del genoma del mosquito Aedes aegypti de la fiebre amarilla mediante CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering ...

Genética

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In the laboratory, researchers can deliver animal-derived and artificial blood meals to mosquitoes via membrane feeders, which allow for manipulation of meal composition. Here, we present methods for feeding blood and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes and quantifying the volume consumed by individual females.
Targeted feeding and quantification of artificial/blood meals have broad uses, including testing the effects of meal components on mosquito behavior and physiology, delivering pharmacological compounds without injection, and infecting mosquitoes with specific pathogens. Adding fluorescein dye to the meal prior to feeding allows for subsequent meal size quantification. The meal volume consumed by mosquitoes can be measured either by weight, if the females are to be used later for behavioral experiments, or by homogenizing individual females in 96-well plates and measuring fluorescence levels using a plate reader as an endpoint assay. Meal size quantification can be used to determine whether changing the meal components alters the meal volume ingested or if meal consumption differs between mosquito strains. Precise meal size quantification is also critical for downstream assays, such as those measuring effects on host attraction or fecundity. The methods presented here can be further adapted to track meal digestion over the course of days or to include multiple distinguishable markers added to different meals (like nectar and blood) to quantify the consumption of each meal by a single mosquito.
These methods allow researchers to singlehandedly perform high-throughput measurements to compare the meal volume consumed by hundreds of individual mosquitoes. These tools will therefore be broadly useful to the community of mosquito researchers for answering diverse biological questions.

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

The goal of this protocol is to deliver animal-derived and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes through an artificial membrane feeder and precisely quantify the volume of meal ingested.

Alimentación y cuantificación de sangre de origen animal y comidas artificiales en mosquitos Aedes aegypti

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

Heterologous Expression and Functional Analysis of Aedes aegypti Odorant Receptors to Human Odors in Xenopus Oocytes

The mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), a vector of many important human diseases including yellow fever, dengue fever and Zika fever, shows a strong preference for human hosts over other warm-blooded animals for blood meals. Olfactory cues play a critical role for mosquitoes as they explore their environment and seek a human host to obtain blood meals, thus transmitting human diseases. Odorant receptors (ORs) expressed in the olfactory sensory neurons are known to be responsible for the interaction of mosquito vectors with human odors. To gain deeper insights into Ae. aegypti&#8217;s olfactory physiology and investigate their interactions with humans at the molecular level, we used an optimized protocol of Xenopus Oocytes heterologous expression to functionally analyze Ae. aegypti odorant receptors in response to human odors. Three example experiments are presented: 1) Cloning and synthesizing cRNAs of ORs and odorant receptor co-receptor&#160;(Orco) from four to six days old Ae. aegypti antennae; 2) Microinjection and expression of ORs and Orco in Xenopus oocytes; and 3) Whole-cell current recording from Xenopus oocytes expressing mosquito ORs/Orco with a two-electrode voltage-clamp. These optimized procedures provide a new way for researchers to investigate human odor reception in Aedes mosquitoes and reveal the underlying mechanisms governing their host-seeking activity at a molecular level.

Heterologous Expression and Functional Analysis of Aedes aegypti Odorant Receptors to Human Odors in Xenopus Oocytes

A protocol is presented that functionally characterizes mosquito ORs in response to human odors using a Xenopus oocyte expression system coupled with a two-electrode voltage clamp, providing a powerful new technique for exploring the responses of mosquitoes ORs to exposure to human odors.

The mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), a vector of many important human diseases including yellow fever, dengue fever and Zika fever, shows a strong ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Un Experimental y Protocolo Bioinformática para análisis de ARN-ss de fotoperiódica diapausa en el Mosquito Tigre Asiático,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect fat body tissue is usually distributed throughout the insect body. However, it is often concentrated in the abdomen and attached to the abdominal body wall.
The mosquito fat body is the sole source of yolk proteins, which are critical for egg production. Therefore, the in vitro culture of mosquito fat body tissues represents an important system for the study of mosquito physiology, metabolism, and, ultimately, egg production. The fat body culture process begins with the preparation of solutions and reagents, including amino acid stock solutions, Aedes physiological saline salt stock solution (APS), calcium stock solution, and fat body culture medium. The process continues with fat body dissection, followed by an experimental treatment. After treatment, a variety of different analyses can be performed, including RNA sequencing (RNA-Seq), qPCR, Western blots, proteomics, and metabolomics.
In our example experiment, we demonstrate the protocol through the excision and culture of fat bodies from the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, a principal vector of arboviruses including dengue, chikungunya, and Zika. RNA from fat bodies cultured under a physiological condition known to upregulate yolk proteins versus the control were subject to RNA-Seq analysis to demonstrate the potential utility of this procedure for investigations of gene expression.

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The fat body is the central metabolic organ in insects. We present a live organ culture system that enables the user to study the responses of isolated fat body tissue to various stimuli.

Sistema de cultivo de órganos de grasa corporal en Aedes Aegypti, Vector del Virus Zika

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high quality and quantity DNA from a well-preserved individual mosquito sufficient for downstream whole genome sequencing. However, reliance on an expensive automated DNA extraction instrument can be prohibitive for many laboratories. Here, the study provides a budget-friendly magnetic-bead-based DNA extraction protocol, which is suitable for low to medium throughput. The protocol described here was successfully tested using individual Aedes aegypti mosquito samples. The reduced costs associated with high quality DNA extraction will increase the application of high throughput sequencing to resource limited labs and studies.

Described here is a DNA extraction protocol using magnetic beads to produce high quality DNA extractions from mosquitoes. These extractions are suitable for a downstream next-generation sequencing approach.

Un protocolo de extracción de ADN de mosquitos a base de perlas magnéticas para la secuenciación de próxima generación

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

Fisiológicos Grabaciones y RNA Secuenciación de los apéndices gustativas del mosquito de la fiebre amarilla

Resumen

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Capítulos en este video

Grabaciones solo Sensillum en los insectos Drosophila melanogaster Y Anopheles gambiae

La disección de las glándulas salivales y del intestino medio de Ae. aegypti

Un protocolo para la recolección y la tinción de los hemocitos del mosquito de la fiebre amarilla Aedes aegypti

Edición del genoma del mosquito Aedes aegypti de la fiebre amarilla mediante CRISPR-Cas9

Alimentación y cuantificación de sangre de origen animal y comidas artificiales en mosquitos Aedes aegypti

Heterologous Expression and Functional Analysis of Aedes aegypti Odorant Receptors to Human Odors in Xenopus Oocytes

Un Experimental y Protocolo Bioinformática para análisis de ARN-ss de fotoperiódica diapausa en el Mosquito Tigre Asiático,

Sistema de cultivo de órganos de grasa corporal en Aedes Aegypti, Vector del Virus Zika

Un protocolo de extracción de ADN de mosquitos a base de perlas magnéticas para la secuenciación de próxima generación

Administración efectiva de ARN oral de interferencia (ARNi) a mosquitos adultos Anopheles gambiae