Name: physiological recordings and rna sequencing of the gustatory appendages of the yellow-fever mosquito aedes aegypti
Uploaded: 2014-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti at JoVE.com

The authors thank Bryan T. Vinyard of the USDA, Agricultural Research Service, Henry A. Wallace Beltsville Agricultural Research Center, Biometrical Consulting Service, Beltsville, MD for statistical analyses. This work was supported in part by a grant to J.C.D. from the Deployed War Fighter Protection (DWFP) Research Program funded by the Department of Defense through the Armed Forces Pest Management Board (AFPMB).

<html> 1. גידול Ae. מבוגרים aegypti <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצים בוקעים בכ ¾ אינץ &#39;מים במגש רדוד. צפיפות תקטין את הגודל של מבוגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זחלים אחוריים במהירות של 25 ° C (12-HL: 12-HD) ולהאכיל עם מזון לדגי קרקע. הערה: האכלת יתר עלולה להפחית את שיעורי הישרדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר גלמים בנפרד על ידי פיפטה פסטר היומית ולהעביר לצלחות פלסטיק (9 סנטימטרים × 5.5 סנטימטרים) בתוך דליי בלימה קטנים עם מכסי רשת בסדר, וכך יוצר 24 קבוצות גיל hr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10% תמיסת סוכרוז יתושים בוגרים Feed על ידי כדור צמר גפן שהונחה על קירות המסך של דיור כלוב היתושים בתא סביבתי על 27 מעלות צלזיוס ו -70% לחות יחסית באותם photoperiod כזחלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאלקטרופיזיולוגיה, להשתמש 5-10 ישנים בעלי חיים יום. באופן כללי, בעלי חיים גדולים יותר יפיקו תוצאות טובות יותר. לבידוד RNA, להשתמש בבעלי חיים הנמצאים בקיבוץ גיל 24 שעות בודדות בטווח הישן 5-10 היום. </li></ol>התחת = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. הכנת כימיקלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע ריכוז מתאים של אלקטרוליטים (למשל 1-10 מ&quot;מ) שמעורר פעילות מינימאלית מתאי עצב תחושתיים שנבחרו. 10 מ&quot;מ NaCl או 1 המ&quot;מ KCl הם אלקטרוליטים סבירים כדי לבדוק את הפעילות בסיסית כאשר מתחיל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים כל כימי ניסיוני בממס מתאים (אם לא מים, להשתמש באתנול או DMSO) שיש לו השפעה מועטת, אם בכלל, על פעילות ספייק בהשוואה לאלקטרוליט לבד. ריכוזים סופיים של 10% אתנול או DMSO 1% ריכוזים התחלה סבירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מתאים (למשל כינין למר או סוכרוז למתוק) כימיקלים שליטה המתוארות היטב הרתעה האכלה או ממריצים בחרקים. </li></ol> 3. אלקטרופיזיולוגיה (הקלטת טיפ 8; איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודות זכוכית טופס מכאני מושך נימי זכוכית. לייעל חום ולמשוך הגדרות למשוך זכוכית כדי ליצור recordi בצורה הולמתאלקטרודות ng. לשבור בזהירות את סוף אלקטרודת זכוכית באמצעות מלקחיים תחת מיקרוסקופ לנתח כדי ליצור קצה האלקטרודה פתיחה שהוא רחב מספיק כדי לעטוף Sensillum היעד, אך קטן מספיק כדי להימנע ממגע עם מבנים שכנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ, מבחינה ויזואלית לזהות על ידי מורפולוגיה ומקם את sensilla / Sensillum היעד כדי להבטיח את דירות של הקלטת קצה. בעלי החיים Prep כדי לאפשר גישה חופשית לsensilla מזווית כניסת האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרקים קרים מבוגרים להרדים במקפיא ב -20 ° C. למנוע נזק לתאי עצב היקפי על ידי חשיפה לטמפרטורות קרות. חותך רצועות צרות של קלטת צלופן עם סכין גילוח על שקופיות זכוכית. לשתק חרקים שלמים בשקופית זכוכית באמצעות רצועות צרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס תיל טונגסטן חידד כימי לתוך בית חזה הגב או עין לשמש את האלקטרודה אדישה (קרקע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא אלקטרודת זכוכית נעשתה בשלב 3.1 עם פתרון מגרה של עניין. באמצעות מזרק הוכנס, למלא כובעillary מקצה משך להקהות סוף. גרור את כל בועות האוויר, מחזיק סוף הוריד. הכנס חוט כסף (chloriding אופציונאלי) לאלקטרודת הזכוכית נעשתה בשלב 3.1 לשמש הקלטה והאלקטרודה מגרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר אלקטרודות למגבר קדם שנועד להקלטות מsensilla chemoreceptive קשר בחרקים. מגבר קדם זה (300 הרץ-3 מסנן bandpass kHz) יפחית את הזמן להתיישב כדי ללכוד פעילות עצבית קרובה לגירוי הקדמה ככל האפשר. לאסוף, לאחסן ולנתח אותות חשמליים באמצעות מייקרו-מחשב מצויד בתוכנת הקלטת ספייק. הערה: הארקת הגדרת ההקלטה כראוי עשויים לשפר בצורה דרסטית יחס אות לרעש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר sensilla עם פתרון שליטה (אלקטרוליט בלבד) כדי להבטיח פונקציונליות. רוזן קוצים מתחילים 200 אלפיות שניים הבאים חפץ הגירוי לכל ההכנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופן אקראי את סדר הכימיקלים מבחן עבור כל הניסויים, למעט מחקרי מנה-תגובה,לחסל את ההטיה. ללימודי מנה-תגובה, לחשוף sensilla להגדלת ריכוזים של חומר כימי ניסיוני. לאפשר מינימום של 3 דקות בין גירויים כדי להבטיח התאוששות נאותה. הערה: דרישה זו עשויה להשתנות בהתאם לחרקים וsensilla. סף מוגדר כריכוז שבי שגיאה סטנדרטית אינה חופפת עם שגיאת התקן לריכוז הנמוך ביותר שנבדק. </li></ol> 4. בידוד RNA ורצף (איור 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את עלי RNase ללא הדוק שלבש על ידי קירור אותם על קרח יבש לפני עלי RNase ללא ליווי הרקמה disruption.Prepare שמתאימים צינורות כובע הצמד בחוזקה. שמור צינורות איסוף סגורים, אלא אם כן באופן פעיל לנתח כדי למנוע התעבות עודפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות aspirator המסונן, מקום 30 עד 40 יתושים-הרדים קרים (15 שניות ב-20 ° C במקפיא) על במה קרה ולמיין לפי מין. בעלי חיים מקום מגבים בצד למטה, לתפוס כנפיים לא לפגוע נספחים טעם.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש בשני זוגות מלקחיים עדינים, לנתח labella זיווג או טרסי מזכרים או נקבות תחת מיקרוסקופ לנתח ולהגביל את ההכללה של רקמות סמוכות. הערה: 500 labella לזווג תשואה של כ 800-1,000 ננוגרם של mRNA הכולל. 400 טרסי הבודד (5 מגזרים כל אחד) להניב 1,200-1,800 ננוגרם של mRNA הכולל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג אחד של התנשמות-מלקחיים, קל לתפוס חוטם יתושים רק הפרוקסימלי לlabella חושף stylets הפנימי. באמצעות זוג אוסף-מלקחיים אחרים, להסיר labella ולהוסיף רקמה לצד שני של צינור איסוף קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג אחד של מלקחיים, קל לתפוס רגל יתוש בצומת של עצם השוק ומגזר tarsal הראשון. באמצעות זוג מלקחיים אחר, להסיר טרסי ולהוסיף רקמה לצד שני של צינור איסוף קר. הערה: קח בחשבון את סוגי התאים בממשק של רקמה רצתה ולא רצוי. אמנם חשוב להגביל את הכללת השכנה רקמה, זה חשוב לא פחות לא להשמיט חלקים מרקמה רצויה. Fiמדגם סופי חייב לייצג במדויק את כל האיבר של עניין. צור גבול מדויק עם המלקחיים האחיזה כך שמלקחי אוסף דווקא יכולים לשחרר על ידי גירוד או תופסים רק את הרקמה הרצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעת לעת, ספין למטה צינור איסוף בקצרה בצנטריפוגה C ° 0 ב9,000 XG לשמור רקמות בחלק תחתון של צינור. אם לחות מצטברת בצינורות איסוף במהלך נתיחה, להוסיף 50uL של מגיב Trizol הקר לכיסוי רקמה שנאספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סמן מעבדה אנטי כתם, באופן ברור לתייג מיליליטר RNase ללא אחד 1.5 להצמיד צינור כובע לכל סוג רקמה לאוסף. שימוש במתלת צינור 1.5 מיליליטר וחנקן נוזלי, להקפיא אז לטחון רקמות לאבקה דקה (חתיכות בסדר אם בTrizol). חזור פעם אחת. תביא נפח כולל של Trizol 1 מיליליטר ו resuspend רקמת קרקע על ידי vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 ul של כלורופורם ומערבבים היטב. אחרי 5 דקות בטמפרטורת חדר, ספין למטה בצנטריפוגות ב 4 ° C ו11,000 XG במשך 15 דקות. זהירותלהוסיף שכבה מימית ישירות לעמודת מסנן הדנ&quot;א הגנומי. ספין למטה ב11,000 x ז במשך 5 דקות. הוספת נפח שווה של אתנול 70% RNase ללא לזרום דרך ומערבבים על ידי pipet. העבר את הנוזל לעמודת אוסף RNA ולהמשיך הפקת RNA להוראות שסופקו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת ולהעריך את טוהר של RNA הכולל על ספקטרופוטומטר דיוק ולהמשיך בכל שיטת רצף RNA סטנדרטית. </li></ol> 5. כמותי RT-PCR אישור של RNA רצף (איור 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר גנים רבים ככל האפשר כדי להשוות רמות ביטוי גנים יחסי על פני טווח דינמי, הן בשפע רצף חזה ותפקוד גן chemosensory חזקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זוגות פריימר עיצוב עבור כל גן המטרה להגביר מוצר PCR 100-180 basepair ספציפי. תכלול ההגברה gDNA שאינו ספציפית על ידי הבטחת פריימר אחד לפחות לכל סט משתרע על פני גבול אינטרון. לחלופין, להשתמש בטיפול DNase כדי להפחית זיהום גנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוףרקמת חרקים כפי שתואר בסעיף קודם. לחשב כמה רקמות נדרש לספק מספיק RNA להשלים את כל תגובות qRT-PCR. הערה: בשלושה עותקים ביולוגיים ותגובות שלושה עותקים טכניים יספק ביטחון מרבי בתוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב כימות גן יחסי כיעד X - (CT [היעד] -Ct [התייחסות]) עבור כל גן המטרה וממוצע לכל לשכפל, ביולוגי וטכני. השתמש בגן ​​משק (ים) לנרמל ערכי ה- CT בין משכפל ביולוגי ולעקור את היקף ציר Y בהשוואות של ביטוי יחסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הדמיון של RNA-seq ומערכי נתוני qRT-PCR באמצעות מבוסס רגרסיה, הליך bootstrap שקילות 9, איטרטיבי מיושם, לנתונים מכל רקמה. הערה: הליך זה מזהה את &quot;האזור של דמיון&quot; הקטן ביותר שניתן לבנות סביב נתוני RNA-seq וqRT-PCR שנצפו, ולאפשר ביטוי גנים היחסי כפי שהיא נמדדת על ידי qRT-PCR כדי להיחשב מבחינה סטטיסטית שווה ערך למדידה של ביטוי גנים יחסי על ידי RNA-seq. </li></ol>

<ol>
	<li>Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repellent+and+deterrent+effects+of+SS220,+picaridin,+and+DEET+suppress+human+blood+feeding+by+Aedes+aegypti,+Anopheles+stephensi,+and+Phlebotomus+papatasi.">Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi.</a> J. Med. Entomol. 43 (1), 34-39 (2006).</li><li>Dickens, J. C., Bohbot, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini+review:+Mode+of+action+of+mosquito+repellents.Pestic.">Mini review: Mode of action of mosquito repellents.Pestic.</a> Biochem. Physiol. 106 (3), 149-155 (2013).</li><li>Pitts, R. J., Rinker, D. C., Jones, P. L., Rokas, A., Zwiebel, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+chemosensory+appendages+in+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae+reveals+tissue-+and+sex-specific+signatures+of+odor+coding.">Transcriptome profiling of chemosensory appendages in the malaria vector Anopheles gambiae reveals tissue- and sex-specific signatures of odor coding.</a> BMC Genomics. 12 (271), (2011).</li><li>Zhou, X., Slone, J. D., Rokas, A., Berger, S. L., Liebig, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+and+transcriptomic+analysis+of+chemosensory+receptors+in+a+pair+of+divergent+ant+species+reveals+sex-specific+signatures+of+odor+coding.">Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding.</a> PLOS Genet. 8 (8), e1002930 (2012).</li><li>Shiao, M., Fan, W., Fang, S., Lu, M. J., Kondo, R., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+adult+Drosophila+antenna+by+high-throughput+sequencing.">Transcriptional profiling of adult Drosophila antenna by high-throughput sequencing.</a> Zoological Studies. 52 (42), (2013).</li><li>Bohbot, J., Pitts, R. J., Kwon, H. W., R&#252;tzler, M., Robertson, H. M., Zwiebel, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+Aedes+aegypti+odorant+receptor+gene+family.">Molecular characterization of the Aedes aegypti odorant receptor gene family.</a> Insect Mol. Biol. 16 (5), 525-537 (2007).</li><li>Kain, P., Boyle, S. M., Tharadra, S. K., Guda, T., Pham, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odour+receptors+and+neurons+for+DEET+and+new+insect+repellents.">Odour receptors and neurons for DEET and new insect repellents.</a> Nature. 502 (7472), 507-512 (2013).</li><li>Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+a+primary+chemoreceptor+unit.">The physiology of a primary chemoreceptor unit.</a> Science. 122 (3166), 417-418 (1955).</li><li>Robinson, A. P., Duursma, R. A., Marshall, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regression-based+equivalence+test+for+model+validation:+shifting+the+burden+of+proof.">A regression-based equivalence test for model validation: shifting the burden of proof.</a> Tree Physiol. 25 (7), 903-913 (2005).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-seq.</a> Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).</li><li>Trapnell, C., Williams, B. A., Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation.">Transcript assembly and quantification by RNA-seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat. Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).</li><li>Sanford, J. L., Shields, V. D. C., Dickens, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gustatory+receptor+neuron+responds+to+DEET+and+other+insect+repellents+in+the+yellow-fever+mosquito,+Aedes+aegypti.">Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Naturwiss. 100 (3), 269-273 (2013).</li><li>Sparks, J. T., Vinyard, B. T., Dickens, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gustatory+receptor+expression+in+the+labella+and+tarsi+of+Aedes+aegypti.">Gustatory receptor expression in the labella and tarsi of Aedes aegypti.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 43 (12), 1161-1171 (2013).</li><li>Kent, L. B., Walden, K. K. O., Robertson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Gr+family+of+candidate+gustatory+and+olfactory+receptors+in+the+yellow-fever+mosquito+Aedes+aegypti.">The Gr family of candidate gustatory and olfactory receptors in the yellow-fever mosquito Aedes aegypti.</a> Chem. Senses. 33 (1), 79-93 (2008).</li><li>Ramsk&#246;ld, D., Wang, E. T., Burge, C. B., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundance+of+ubiquitously+expressed+genes+revealed+by+tissue+transcriptome+sequence+data.">An abundance of ubiquitously expressed genes revealed by tissue transcriptome sequence data.</a> PLoS Comput. Biol. 5 (12), e1000598 (2009).</li><li>Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+based+criterion+for+gene+expression+calls+using+RNA-seq+data.">A model based criterion for gene expression calls using RNA-seq data.</a> Theory Biosci. 132 (3), 159-164 (2013).</li><li>Hart, T., Komori, H. K., LaMere, S., Podshivalova, K., Salomon, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+active+genes+in+deep+RNA-seq+gene+expression+studies.">Finding active genes in deep RNA-seq gene expression studies.</a> BMC Genomics. 14 (778), (2013).</li><li>Isono, K., Morita, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+designs+of+insect+taste+receptor+system.">Molecular and cellular designs of insect taste receptor system.</a> Front. Cellu. Neurosci. 4 (20), 1-16 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ההיבט המאתגר ביותר של פוטנציאל פעולת הקלטה מsensilla התעורר אצל הוא להחליט איזה תגובות הם &quot;נורמלים&quot;. כאשר העסקת קצה Sensillum התעורר אצל אחת הקלטה בפעם הראשונה לניתנו מיני חרקים, מספר הכולל ורגישויות של תאי עצב קולט התעורר אצל (GRNs) הם סביר להניח לא ידוע. הקלטות ראשוניות רבות נדרשות ראשון להחליט את הטווח וריכוזים של כימיקלים לבדיקה. במקרה זה, שהתחלנו עם התצפית כי GRN יחיד הגיב לריכוזים נמוכים של DEET (איור 1). בהמשך לכך, נבחנו תגובות בתוך אותו Sensillum לטווח ריכוזים של כימיקלים ידועים כמרים או מרתיע לחרקים אחרים, וצפו בצורה דומה ספייק ומשרעת (איור 1). תצפיות אלו הציעו כי תת סוג GRN אחת מגיב לתרכובות אלה מרתיעים. לשם השוואה, בדקנו תרכובות ממותקים ידועות לעורר האכלה בmosquitoes כדי לראות אם ספייק דומה התרחש. אנו הבחנו ספייק שונה, גדול יותר במקרה זה. כמו כן, אנו נצפו עלייה חדה שלישית, בגודל בינונית בתגובה לגירוי מלח, מביאים סך מספר תת סוג GRN לשלוש. הכנות הקלטת אלקטרו בחרקי מטבעם משתנים. sensilla התעורר אצל היעד הוא בדרך כלל קטן מאוד וחייב להיות ממוקם בזווית המתאימה להיכנס אליו עם האלקטרודה ההקלטה בלי לגעת זכוכית לציפורן. להקמת גשר מוליך לתאי עצב התעורר אצל, נקבוביות המסוף של Sensillum חייב להיות פתוח לימפה הכילה להקים קשר ישיר עם אלקטרוליט של האלקטרודה ההקלטה. אנו צפינו בחסימה של פתחי sensilla או על ידי זרה או פסולת מופרשת ומיובשת חומר מתוך Sensillum היעד. כדי להימנע ממכשולים אלה, יש לנקוט בזהירות בעת גידול וטיפול בחרקים להימנע ממגע עם sensilla היעד. בנוסף לChooלשיר חרקים ניזוק, בריאים בדיקה, גורמים ביולוגיים כגון גיל, האכלת מדינה, הזדווגות זמן מדינה וצייטגבר יש לשקול בעת קביעת בקרות כדי להפחית את השונות בהקלטות. זה עלול להיות קשה להשגת הכנה מגיבה באופן עקבי. ניסויים רבים עשויים להיות נחוצים כדי לשפר את מספיק יחס אות לרעש כדי לפתור קוצים בודדים. וריאציות ניסיוניות על ההכנות האמורות עלולות להוביל לתוצאות טובות יותר. מומלץ לקבוע תגובה חזקה במכשירי ההקלטה שלך למיני הבדיקה שלך באמצעות elicitor ספייק חרקים נפוץ, כמו סוכרוז או כינין. ברגע שהתעורר אצל Sensillum מגיב, התגובות הללו צריכים להיות לשחזור. האורך המינימאלי של זמן בין גירויים צריך להיקבע באופן ניסיוני בחינת דינמיקת ספייק תחת אילוצי זמן שונים. יש להימנע גירוי מוגזם לשמור על בריאות GRN וכדי למנוע השפלה הלימפה Sensillum. במקרה thaרגישות תגובת t יורדת במהירות לאחר הגירוי ראשון, מספר גדול יותר של preps יש לקבל לספק ביטחון כי תגובות אלה הן מבחינה פיזיולוגית אופייניות למין נתון. המסיסות של כמה כימיקלים מבחן יכולה ליצור קושי עושה אלקטרודות גירוי, כחלק מממסים עלולים להשפיע על פעילות GRN, גם בריכוזים נמוכים סופיים. ניתן לטפל שיקולים אלה בדרך של ניסוי וטעייה ועם בקרות מתאימות. כל חומר ממס היש להוסיף לאלקטרוליט השליטה ופתרונות בדיקה אחרים על מנת להבטיח עקביות של תגובות. חרקים קטנים משתקים, ובכך לספק גישה ישירה ליעד sensilla מבלי לפגוע ברקמות שבירות, עשוי לדרוש ניסוי וטעייה. המגבלה העיקרית של אלקטרופיזיולוגיה היא ההפרדה המצערת של תגובות עצביות שנצפו ותגובות התנהגותיות במורד הזרם פוטנציאלית. לכן, זה יתרון כדי לבדוק את התגובות לכימיקלים שbeen מוצג לעורר תגובות התנהגותיות ספציפיות כדי לדון במשמעות של התוצאות בהקשר אקולוגי. הקלטות טיפ מאפשרות זיהוי מדויק מאוד של פעילות תאית, מה שהופך את אידאל טכניקה זו להערכת בעלי חיים מהונדסים או אלה מציגים הבדלים פנוטיפי בהתנהגות. הקלטות אלה מציעים גם מידע נוסף על תגובות עצביות, כגון דינמיקה זמנית ומשרעת, מאשר מערכות הסתמכות על כתבים חזותיים של פעילות עצבית. במקרים מסוימים, ניתן לכמת תגובות עצביות בקלות רבה יותר מאשר נתונים התנהגותיים 12. אוסף רקמות לRNA-seq וqRT-PCR הוא פשוט אך דורש ריכוז ותשומת לב מתמידים לשימור חומר תאי באמצעות אחסון והימנעות מעודף הלחות קר. פעילות RNase יכולה להשפיע על איכות RNA; לכן רקמה רק צריכה לפנות משטחים נקיים לאורך כל אוסף והפקת RNA. למרות שפתרון הבעיות הנדרשות לqRT-PCR is מתועדת היטב, סביר להניח המלכודות להתרחש בתחילת התהליך בעת תכנון פריימרים ובחירת גני המטרה וניהול משק בית. גנים שצפויים לייצג נקודות מחולקות באופן שווה לאורך קו של רמת ביטוי היחסית שימושיים להשוואת RNA-seq ומערכי נתוני qRT-PCR (איור 3). לדוגמא, בחירת גנים לqPCR שמראים ערכי RPKM של 0, 10, 20, 30, וכו &#39;, בהתאמה, מציעים סדר צפוי של שפע להיבדק. RNA-seq היה מוצלח בהדגשה שפלה לבטא גנים בסקר של רקמות התעוררו אצלנו (איור 2). לבנות גן אמין עבור AE. aegypti (AaegL1.3, http://aaegypti.vectorbase.org/GetData/Downloads/) וגן chemoreception לפני זיהוי 14 גרם ביטוי גני הבקיע בקלות יחסית. למטרות אלה, חרקים עם ביאורי גן זמינים ומשפחות גנים מזוהות של עניין הם מערכות מודל בעל ערך. קביעת סף מדויקלביטוי גנים לעומת רעש רקע הוא ספקולטיבי, אבל שיטות של קביעת הפסקות סבירות זמינות 15-17. כאן אנו קובעים רמת RPKM של ביטחון מלא וברמה נמוכה יותר של אמון RPKM ירד מבוסס על תקדים 9 שבו אנו ממוסגרים הדיון בתוצאות שלנו. בעתיד, אנו מקווים לנתח רקמות chemosensory אחרות בשני היתושים וחרקים חשובים מבחינה כלכלית אחרים להרחיב את הידע של גני תיווך דחיית חרקים שלנו. הקמנו מספר גנים התעוררו אצל מועמד שככל הנראה תיווך תגובות לתרכובות מרתיעות על ידי השוואת רצפי גנים למינים עם נתונים תפקודיים זמינים 13. אנו מייצרים קווים מהונדסים של יתושים חסרים גני chemosensory הבודדים הללו. אנו נשתמש בהקלטות קצה להעריך את תפקידם של גנים אלה על יכולתו של בעל החיים כדי לזהות דוחי ידועים ולהעריך תגובות התנהגותיות של מוטציות אלה לrepellents. במקרה שגנים המועמדים אלה אינם משפיעים באופן משמעותי דחייה, יותר רזולוציה ייתכן שתהיה צורך לקבוע באופן מדויק יותר ביטוי גנים או נוכחות חלבון בSensillum או תא בודד. צנוע קולטני ביטאו עשוי להיות מטרות קריטיות לסינון דוחי רומן, יחד עם עמיתים לקולטנים הביעו בכל מקום. למרבה הצער, בכלאה באתר וimmunolocalization הוכיח קשה מאוד ברקמה התעוררה אצל חרקים 18. ברגע שהקמנו אילו גנים לתווך תגובות פיסיולוגיות והתנהגויות אלה, אנו עשויים לבטא את הגנים האלה במערכות סלולריים, כי הם ניתנים להקרנת תפוקה הגבוהה של חומרים דוחים מועמד. בגישות סיליקון המשתמשים במודלים מבניים מאי 7 גם להיות שימושי בחיזוי אילו סוגים של תרכובות יהיו לעורר תגובה חזקה מקולטנים ספציפיים.

תרכובות כמו DEET, Picaridin, Citronellal וIR3535 הוכחו ביעילות להדוף יתושים, כולל Aedes וקטור מחלה החשוב aegypti 1,2. אנו רושמים פוטנציאל פעולה מתא עצב תחושתי הקשורים sensilla התעורר אצל ספציפי כדי לקבוע את התאים מעורבים עם דחיית יתושים. בשילוב עם רצף במורד הזרם של גנים המתבטאים ברקמות אלה, אנו עשויים לזהות את הגנים סביר להניח תיווך התגובות של תאים אלה כדי להקרין תרכובות חדשות ליכולות דחייה השתפרו. RNA-seq הוא כלי רב עוצמה, הופך סטנדרטי למעקב אחר שינויים של זמן ומרחב בביטוי גנים במהירות. RNA-seq ניתוחים של איברים chemosensory חרקים ואיברים שימשו לחשוף קולטנים מולקולריים בכמה מיני חרקים 3-5, שיפור משמעותי בגן מבוסס PCR קונבנציונלי חיפושים על ידי גן 6. חרקים מייצגים את מעמד בעלי החיים המגוון ביותר, מראשsenting הזדמנויות רבות ללמוד את הקשר בין גנים ופנוטיפים ייחודיים. טכנולוגית RNA-seq יכולה להיות מועסק על כל רקמת חרקים חיים. כמו כן, הקלטת אלקטרו מתאי חישה בתוך sensilla התעורר אצל uniporous ניתן להשיג במינים חרקים רבים ושונים. הזיווג של שתי הטכניקות הללו מאפשר לחוקרים כדי לצמצם גני הסט מעורבים בפנוטיפ chemosensory נצפה. מינים שונים יציגו אתגרים ספציפיים, אך עשוי להודיע ​​על הקשר בין גני קולט chemosensory והסתגלות chemosensory. הגודל והמורפולוגיה של sensilla chemosensory משתנה ועשוי לדרוש פתרון בעיות נרחבות בעת הקלטת פוטנציאל פעולה כדי להפחית את הרעש ולזהות אותות הדיר. ניתוחים של איברי chemosensory עשויים להיות טריוויאלי או עדין וזמן רב, בהתאם למורפולוגיה וגודל של החרק. שחזור של RNA באיכות גבוהה עשוי לדרוש כמה פתרון בעיות, כמו גם, כגון הימנעות פיגמנטים מסוימים במהלךאוסף רקמות. תוך שהם מפגינים את ההשפעות של תרכובות דוחה באמצעות ניסויים התנהגותיים הוא ישיר ואינפורמטיבי, גישה זו היא זמן אינטנסיבי ורחב ביחס למנגנון פעולה. אלקטרופיזיולוגיה בשילוב עם RNA-seq מאפשרת לניתוחים ספציפיים יותר של מה שמניע את התנהגויות הימנעות בחרקים. ברגע ש&quot; ארגז הכלים &quot;של אפליה כימית זוהה במיני חרקים, ניסיונות ספציפיים יותר על מנת לשפר את דוחי ידועים הם אפשריים. קולטנים וחלבונים הקשורים בתאי חישה אחראים להתנהגויות אלה עשויים לבוא לידי ביטוי heterologously להקרנה כימית ישירה. יתר על כן, הדמיה מולקולרית יכולה לנבא איזה כימיקלים יהיו לעורר תגובה חזקה מקולטנים אלה 7. תמונת המצב של כל הגנים הפעילים בקבוצה צרה של רקמות chemosensory יכול להיות גם שימושית בזיהוי גנים דומים במינים אחרים. באמצעות הומולוגיה ברצף וsi הביטויmilarities, חוקרים עלולים להיווצר סטים של קולטנים מולקולריים סביר להניח תיווך תגובות לדוחים שהם רחב אפקטיביים על חרקים. אנו מציגים את הפרוטוקול הבא כדי לעזור לחוקרים בפירוק מסלולי chemosensory חרקים ולשכנע יותר להתעמק neuroethology של אי-מודל וחרקים חשובים מבחינה כלכלית.

<table><tbody><tr><td>Glass capillary</td><td>A-M Systems</td><td>628000</td><td>Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4&quot;</td></tr><tr><td>Silver wire</td><td>A-M Systems</td><td>7875</td><td>.015&quot; bare</td></tr><tr><td>Tungsten wire</td><td>Alfa Products</td><td>369</td><td>0.127 mm diameter</td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252</td><td>#5SF Inox</td></tr><tr><td>Refridgerated stage</td><td>BioQuip Products</td><td>1429</td><td>Chill Table</td></tr><tr><td>Preamplifier</td><td>Syntech</td><td>Taste Probe</td><td>preamplifier</td></tr><tr><td>Software for electrophysiology</td><td>Syntech</td><td>Autospike</td><td>software for electrophysiology</td></tr><tr><td>TetraMin fish food</td><td>Tetra</td><td>Tropical fish food granules</td><td>fish food ground to fine powder</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>RNA isolation reagent</td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74136</td><td>includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns</td></tr><tr><td>Nanodrop spectrophotometer</td><td>Nano Drop Products</td><td>ND-1000</td><td>tabletop spectrometer</td></tr><tr><td>R statistics</td><td>freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka)</td><td>www.r-project.org</td><td>Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.</td></tr><tr><td>1.5 ml tube rack</td><td>Evergreen</td><td>240-6388-030</td><td>Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.</td></tr><tr><td>1.5 ml collection tubes with pestle</td><td>Grainger</td><td>6HAX6</td><td>RNase free</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>11178160</td><td>Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube.</td></tr><tr><td>Primer-BLAST Primer Designing tool</td><td>NCBI</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

physiological recordings and rna sequencing of the gustatory appendages of the yellow-fever mosquito aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

הקלטות שמץ של פוטנציאל פעולה מAe. sensilla התעורר אצל aegypti (איור 1) להדגים את היעילות של גירוי ישיר עם מגוון רחב של כימיקלים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לכמת את תגובות לכל גירוי כימי על ידי ספירת קוצים של משרעת ומשך נתון על פני טווח זמן סביר (בדרך כלל פחות מ -500 ms). הקלטות Trace חייבת להיות לשחזור בקלות תחת קבוצת נתונה של תנאי ניסוי. אחרת, התגובות הפיזיולוגיות שנצפו עשויות לייצג פנוטיפים נדירים בקרב אנשיו של מין המבחן. נתוני RNA-seq גלם דורש סינון ומיפוי מדויק לפני שהוצג כRPKM מעוגל (מספר ממופה קורא לאורך kilobase של תמליל למיליון כניסות ממופות) או FPKM (מספר שברי קריאה לאורך kilobase של תמליל למיליון כניסות ממופים) ערכים מספריים (איור 2). ההבחנה ביןשתי שיטות הנורמליזציה RNA-seq אלה שתוארו בשתי יצירות מכוננים 10,11. אחד יתרונות של כולל רצף mRNA הוא היכולת לזהות את הביטוי של משפחות גנים גדולות בו זמנית. ההצגה החזותית של הביטוי של גנים רבים בבת אחת מאפשרת להבנה ייחודית של הכלים המולקולריים לרקמה מסוימת. השוואות בין מינים, שלבי התפתחות או סוגי רקמות יכולות להתבצע במהירות. משכפל ביולוגי למערכי נתוני RNA-seq עשוי להיות מוגבל על ידי עלות או קושי של אוסף רקמות. qRT-PCR מציע את היכולת לאמת את תת קטנים בסך הכל ביטוי גנים בפחות עלות ודורש RNA מקור פחות. צד ידי השוואות נתונים צד (איור 3 א) לאפשר לביטחון רב יותר בתוצאות RNA-seq, כשתי שיטות להסתמך על chemistries שונה להערכת שפע גן. פונקציות סטטיסטי שקילות (איור 3) להפגין את גבולות ודאות בכל מקרה ומקרה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52088/52088fig1highres.jpg" /> איור 1: קלטות אלקטרו מSensillum בינוני שבפית של AE. נקבות aegypti, ששונו מהעבודה שצוטטה 12. עקבות להראות תגובות 100 מ&quot;מ NaCl, 100 מ&quot;מ סוכרוז, IR3535 כינין 1 מ&quot;מ, 0.8% DEET, 0.8% Picaridin, 0.8% ו -0.8% Citronellal. שלושה קוצים עם אמפליטודות או צורות שונות מסומנים, ב או ג. שלושת קוצים אלה מתאים עם שלושה תת-סוגי נוירון חושיים עם רגישויות שונות: מלח, סוכר, ומריר, בהתאמה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52088/52088fig2highres.jpg" /> איור 2:. לוח של ביטוי גני קולט התעורר אצל כפי שנקבעו על ידי RNA-seq במשך 8 דגימות רקמה, ששונה מהעבודה שצוטטה 13 תאים בודדים לדווח ערכי RPKM לכל הסברים התעוררו אצל גן, רקמות זכריות (משמאל) ורקמות נשיות (מימין). ערכים מספריים מעוגלים לעשירית הקרוב ביותר. עוצמת צבע חום-המפה מוגבלת בRPKM הגבוה ביותר ואת נקודת האמצע תשתנה לכל משפחת גן בנפרד. יש רק משפחה אחת הגן מוצגת במקרה זה. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52088/52088fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52088/52088fig3highres.jpg" /> איור 3:. השוואת נתוני qRT-PCR ונתוני RNA-seq, שונה מהעבודה שצוטטה 13 (א) כל גן chemoreception של הציר האופקי מיוצג על ידי שתי עמודות נתונים. העמודה השמאלית מייצגת ביטוי יחסי כפי שנקבע על ידי RNA-seq; ערכי RPKM של גני chemoreception חולקו על ידי זה של גן משק Aaeg LAsP ליצור פרופורציות מספריות ברקמה זו. תקיןעמודה מייצגת ביטוי יחסי כפי שנקבע על ידי qRT-PCR. ראשית, ערכי ה- CT לשכפל ביולוגי לגנים labella היו מנורמלים באמצעות Aaeg LAsP כסטנדרט. שנית, לשכפל ערכי ה- CT לכל גן ששמש בחישוב ערכי ביטוי יחסי (יעד E - (CT [היעד] -Ct [התייחסות])). הברים השגיאה מצביעים על סטיית התקן של ערכי ביטוי יחסי מחושבים בנפרד. מערכי נתונים (B) RNA-seq וqRT-PCR הושוו בניתוח נפרד. הצירים האנכיים מייצגים שפע גן יחסי כפי שהודגם על ידי נתוני RNA-seq, עם ערך של 1 מיוחס לגן משק Aaeg LAsP וכל ביטוי גנים האחר שדווח ביחס לערך זה. הצירים אופקיים מייצגים שפע גן יחסי כפי שחוזים qRT-PCR, עם ערך של 1 מיוחס לגן משק Aaeg LAsP וכל ביטוי גנים האחר שדווח ביחס לערך זה. קווים אדומים מייצגים שקילות מדויקות. קווים מקווקווים מייצגים גבולות &quot;האזור של דמיון&quot; למדרון, המחושב על ידי אלגוריתם השקילות הסטטיסטי 9. קווים שחורים מוצקים מייצגים את רגרסיה הריבועים הפחותים של שקילות qRT-PCR לכימות RNA-seq לגני המטרה 12 וגן משק Aaeg LAsP, כל מיוצג על ידי נקודת נתונים המעגל. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52088/52088fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti at JoVE.com

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

באמצעות שתי שיטות להערכת ביטוי גנים בנספחים התעוררו אצל הגדולים של Aedes aegypti, זיהינו הקבוצה של גני putatively בסיס התגובות עצביות לתרכובות מרות ודוחות, כפי שנקבע על ידי בדיקת אלקטרו.

הקלטות פיסיולוגיות וRNA רצף של האיברים התעוררו אצל של יתוש הקדחת הצהובה<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

physiological-recordings-rna-sequencing-gustatory-appendages-yellow

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

8.0K Views.  United States Department of Agriculture.  באמצעות שתי שיטות להערכת ביטוי גנים בנספחים התעוררו אצל הגדולים של Aedes aegypti, זיהינו הקבוצה של גני putatively בסיס התגובות עצביות לתרכובות מרות ודוחות, כפי שנקבע על ידי בדיקת אלקטרו. 

Video: Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Sensillum הקלטות סינגל חרקים תסיסנית melanogaster ו אנופלס gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Neuroscience

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

Dissection של בלוטות הרוק midgut ו מ AE. aegypti יתושים

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

פרוטוקול איסוף מכתים Hemocytes מן יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Immunology and Infection

Genome Editing in the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti using CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering field and opened the doors for precise genome editing in multiple species, including non-model organisms. In the mosquito Aedes aegypti, loss-of-function mutations and DNA insertions have been accomplished with this technology. Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology, focusing on both the generation of gene knockout and knockin lines. In this protocol, quartz needles are filled with a mixture of guide RNA, recombinant Cas9, and a plasmid containing a DNA cassette encoding a gene for a fluorescent marker, if gene knockin is desired. Embryos at the preblastoderm stage are lined up onto a strip of double-sided sticky tape placed onto a coverslip, which is subsequently mounted onto a glass slide. With the help of a microinjector, the needles are inserted gently into the posterior end of the embryos and a small volume of the CRISPR mixture is dispensed. When the embryos are hatched, the larvae are checked under the fluorescent scope, and the pupae are sex-sorted and separated in different cages. Once the adults emerge, these are reciprocally crossed with wild-type individuals, blood-fed, and placed for egg laying. Once these eggs are hatched, the fluorescent larvae collected represent individuals with stable insertion of the DNA cassette into their genome. These larvae are then grown to the adult stage, outcrossed to wild-type individuals, and then further assessed through molecular techniques to confirm that the exact sequence of the DNA cassette is present at the desired site of the mosquito genome. Homozygous lines can also be obtained by following the provided pipeline of crossing schema and molecular screening of the mutations.

Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology.

עריכת גנום ביתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti באמצעות CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering ...

Genetics

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In the laboratory, researchers can deliver animal-derived and artificial blood meals to mosquitoes via membrane feeders, which allow for manipulation of meal composition. Here, we present methods for feeding blood and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes and quantifying the volume consumed by individual females.
Targeted feeding and quantification of artificial/blood meals have broad uses, including testing the effects of meal components on mosquito behavior and physiology, delivering pharmacological compounds without injection, and infecting mosquitoes with specific pathogens. Adding fluorescein dye to the meal prior to feeding allows for subsequent meal size quantification. The meal volume consumed by mosquitoes can be measured either by weight, if the females are to be used later for behavioral experiments, or by homogenizing individual females in 96-well plates and measuring fluorescence levels using a plate reader as an endpoint assay. Meal size quantification can be used to determine whether changing the meal components alters the meal volume ingested or if meal consumption differs between mosquito strains. Precise meal size quantification is also critical for downstream assays, such as those measuring effects on host attraction or fecundity. The methods presented here can be further adapted to track meal digestion over the course of days or to include multiple distinguishable markers added to different meals (like nectar and blood) to quantify the consumption of each meal by a single mosquito.
These methods allow researchers to singlehandedly perform high-throughput measurements to compare the meal volume consumed by hundreds of individual mosquitoes. These tools will therefore be broadly useful to the community of mosquito researchers for answering diverse biological questions.

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

The goal of this protocol is to deliver animal-derived and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes through an artificial membrane feeder and precisely quantify the volume of meal ingested.

האכלה וכימות של דם שמקורו בבעלי חיים וארוחות מלאכותיות יתושים Aedes aegypti

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

Heterologous Expression and Functional Analysis of Aedes aegypti Odorant Receptors to Human Odors in Xenopus Oocytes

The mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), a vector of many important human diseases including yellow fever, dengue fever and Zika fever, shows a strong preference for human hosts over other warm-blooded animals for blood meals. Olfactory cues play a critical role for mosquitoes as they explore their environment and seek a human host to obtain blood meals, thus transmitting human diseases. Odorant receptors (ORs) expressed in the olfactory sensory neurons are known to be responsible for the interaction of mosquito vectors with human odors. To gain deeper insights into Ae. aegypti&#8217;s olfactory physiology and investigate their interactions with humans at the molecular level, we used an optimized protocol of Xenopus Oocytes heterologous expression to functionally analyze Ae. aegypti odorant receptors in response to human odors. Three example experiments are presented: 1) Cloning and synthesizing cRNAs of ORs and odorant receptor co-receptor&#160;(Orco) from four to six days old Ae. aegypti antennae; 2) Microinjection and expression of ORs and Orco in Xenopus oocytes; and 3) Whole-cell current recording from Xenopus oocytes expressing mosquito ORs/Orco with a two-electrode voltage-clamp. These optimized procedures provide a new way for researchers to investigate human odor reception in Aedes mosquitoes and reveal the underlying mechanisms governing their host-seeking activity at a molecular level.

Heterologous Expression and Functional Analysis of Aedes aegypti Odorant Receptors to Human Odors in Xenopus Oocytes

A protocol is presented that functionally characterizes mosquito ORs in response to human odors using a Xenopus oocyte expression system coupled with a two-electrode voltage clamp, providing a powerful new technique for exploring the responses of mosquitoes ORs to exposure to human odors.

The mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), a vector of many important human diseases including yellow fever, dengue fever and Zika fever, shows a strong ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

ניסיוני וביואינפורמטיקה פרוטוקול לניתוח RNA-seq של Photoperiodic דיאפאוזה באסיה טייגר נגד יתושים,<em&gt; אדס המפוספס</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect fat body tissue is usually distributed throughout the insect body. However, it is often concentrated in the abdomen and attached to the abdominal body wall.
The mosquito fat body is the sole source of yolk proteins, which are critical for egg production. Therefore, the in vitro culture of mosquito fat body tissues represents an important system for the study of mosquito physiology, metabolism, and, ultimately, egg production. The fat body culture process begins with the preparation of solutions and reagents, including amino acid stock solutions, Aedes physiological saline salt stock solution (APS), calcium stock solution, and fat body culture medium. The process continues with fat body dissection, followed by an experimental treatment. After treatment, a variety of different analyses can be performed, including RNA sequencing (RNA-Seq), qPCR, Western blots, proteomics, and metabolomics.
In our example experiment, we demonstrate the protocol through the excision and culture of fat bodies from the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, a principal vector of arboviruses including dengue, chikungunya, and Zika. RNA from fat bodies cultured under a physiological condition known to upregulate yolk proteins versus the control were subject to RNA-Seq analysis to demonstrate the potential utility of this procedure for investigations of gene expression.

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The fat body is the central metabolic organ in insects. We present a live organ culture system that enables the user to study the responses of isolated fat body tissue to various stimuli.

תרבות הגוף השמן איברים במערכת Aedes Aegypti, וקטור של וירוס Zika

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high quality and quantity DNA from a well-preserved individual mosquito sufficient for downstream whole genome sequencing. However, reliance on an expensive automated DNA extraction instrument can be prohibitive for many laboratories. Here, the study provides a budget-friendly magnetic-bead-based DNA extraction protocol, which is suitable for low to medium throughput. The protocol described here was successfully tested using individual Aedes aegypti mosquito samples. The reduced costs associated with high quality DNA extraction will increase the application of high throughput sequencing to resource limited labs and studies.

Described here is a DNA extraction protocol using magnetic beads to produce high quality DNA extractions from mosquitoes. These extractions are suitable for a downstream next-generation sequencing approach.

פרוטוקול מיצוי DNA יתוש מבוסס חרוז מגנטי לרצף הדור הבא

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

הקלטות פיסיולוגיות וRNA רצף של האיברים התעוררו אצל של יתוש הקדחת הצהובה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Sensillum הקלטות סינגל חרקים תסיסנית melanogaster ו אנופלס gambiae

Dissection של בלוטות הרוק midgut ו מ AE. aegypti יתושים

פרוטוקול איסוף מכתים Hemocytes מן יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti

עריכת גנום ביתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti באמצעות CRISPR-Cas9

האכלה וכימות של דם שמקורו בבעלי חיים וארוחות מלאכותיות יתושים Aedes aegypti

Heterologous Expression and Functional Analysis of Aedes aegypti Odorant Receptors to Human Odors in Xenopus Oocytes

ניסיוני וביואינפורמטיקה פרוטוקול לניתוח RNA-seq של Photoperiodic דיאפאוזה באסיה טייגר נגד יתושים,

תרבות הגוף השמן איברים במערכת Aedes Aegypti, וקטור של וירוס Zika

פרוטוקול מיצוי DNA יתוש מבוסס חרוז מגנטי לרצף הדור הבא

מתן יעיל של הפרעת RNA דרך הפה (RNAi) ליתושים אנופלס גמביה בוגרים