分裂酵母Schizosaccharomyces pombeにおけるミトコンドリア呼吸鎖タンパク質の発現と複合体集合体の解析

分裂酵母 Schizosaccharomyces pombe は、ミトコンドリアを研究するための魅力的なモデルとして浮上しています。ここでは、 S. pombeのミトコンドリア呼吸複合体の存在量と集合体を解析するためのプロトコルについて説明します。これにより、ミトコンドリアの呼吸鎖における保存された遺伝子の新規機能の特性評価が可能になります。

ミトコンドリアの呼吸鎖は、細胞のエネルギー代謝に重要であり、酸化的リン酸化の中核として機能します。ミトコンドリアの呼吸鎖は、5つの酵素複合体とそれらの相互作用するスーパー複合体から構成されています。これらのタンパク質の発現と複合体の集合体の解析は、ミトコンドリアの機能を理解するために不可欠です。これは、ミトコンドリア生物学の研究のために出芽酵母への代償系を提供する優れたモデル生物分裂酵母 Schizosaccharomyces pombe (S. pombe)で生化学的方法と遺伝学的方法を組み合わせることによって研究することができます。ここでは、 S. pombe ミトコンドリアの単離と、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)および青色ネイティブPAGE(BN-PAGE)によるミトコンドリア呼吸器タンパク質の発現レベルと複合体集合の解析のための詳細なプロトコルを紹介します。簡単に説明すると、野生型および遺伝子変異体由来のミトコンドリアを精製し、次にそれらの複合体を可溶化してSDS-PAGE/BN-PAGEおよびイムノブロッティングにかけます。この方法により、ミトコンドリア呼吸鎖における遺伝子の新規機能の特性評価が可能になります。

ミトコンドリアは、エネルギーのための細胞呼吸、栄養代謝、^{細胞死など}、多様な生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしています1。ミトコンドリアの機能不全は、脳、筋肉、発達疾患に関連しています^2,3。したがって、ミトコンドリアに関する研究は、人間の老化と健康を改善するために不可欠です。

出芽酵母Saccharomyces cerevisiae(S. cerevisiae)は、ミトコンドリア4の遺伝子の機能を研究するために長い間使用されてきました^{。なぜなら、}呼吸に欠陥のある酵母変異体は、発酵によって生存のためのエネルギーをまだ生成できるからです。しかし、プチ陽性であり、ミトコンドリアDNA(mtDNA)がなくても増殖する可能性があります。その結果、ミトコンドリア遺伝子の発現に欠陥のある遺伝子変異体は、しばしばmtDNAを失い、さらなる研究を複雑にしています。一方、S. cerevisiaeから進化的に遠い分裂酵母Schizosaccharomyces pombe(S. pombe)は、生存のためにmtDNAを必要とするプチネガティブ酵母です。さらに、S. pombeのmtDNAとミトコンドリアmRNAの組織は、高等真核生物のものと類似^{している5。}S. cerevisiaeの必須遺伝子はわずか6つであるのに対し、S. pombeの多くの必須遺伝子(96)がミトコンドリア遺伝子の発現に必要である⁶。このように、S. pombeは、ミトコンドリアにおける遺伝子の新規機能を研究するための魅力的なモデルとして浮上しています。しかし、S. cerevisiaeのミトコンドリアを研究した論文の数は、S. pombeの約100倍であり、S. pombeのミトコンドリアを研究した方法やプロトコルも報告されていない⁷。

ミトコンドリアの呼吸鎖は、細胞のエネルギー生産に重要であり、ミトコンドリア⁸の中核として機能します。これは、NADH-ユビキノン酸化還元酵素(Complex I)、コハク酸デヒドロゲナーゼ(Complex II)、ユビキノン-シトクロムc酸化還元酵素またはシトクロムbc1複合体(Complex III)、シトクロムcオキシダーゼ(Complex IV)、ATP合成酵素(Complex V)などの呼吸鎖複合体I-Vと、電子を運ぶ2つの中間基質、ユビキノン(CoQ)およびシトクロムc(Cyt c)⁹.それらはまた、相互作用して高次の超複合体を形成するが、その組み立てメカニズムはほとんど不明のままである^10,11。しかし、S. pombeは複合体Iを欠いており、これは外部のNADHデヒドロゲナーゼNde1および内部のNdi1に置き換えられる可能性がある12,13,14。S. pombeのミトコンドリアゲノムは、複合体IIIのサブユニット(Cob1)、複合体IVの3つのサブユニット(Cox1、Cox2、Cox3)、および複合体Vの3つのサブユニット(Atp6、Atp8、Atp9)をコードしています^15,16。私たちは最近、これらのタンパク質の発現と複合体の集合が、S. pombeのRNAヘリカーゼMss116 (Δmss116)¹⁶と集合因子Shy1 (Δshy1)¹⁵のそれぞれ欠失によって影響を受けることを報告しました。これらの方法を用いて、ミトコンドリア呼吸鎖におけるより多くの遺伝子の新規機能の発見を促進するために、ここでは、S. pombeのミトコンドリア呼吸鎖タンパク質の複合体集合体の発現レベルのSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)分析とBlue Native-PAGE(BN-PAGE)分析の詳細なプロトコルを提供します。

S. pombeからのミトコンドリアの単離の背後にある理論的根拠は、S. cerevisiae¹⁷で確立された方法に基づいています。スフェロプラストは、まず酵母細胞壁を消化することによって調製されます。それらは機械的に均質化され、ミトコンドリアは示差遠心分離¹⁸によって分画される。その後、ミトコンドリア呼吸鎖タンパク質をSDS-PAGEおよびBN-PAGEに従って可溶化し、免疫ブロットします。BN-PAGE技術は、もともと呼吸鎖複合体19,20,21などのミトコンドリア膜タンパク質の分離のために開発されました。保存された無傷の複合体を持つ膜タンパク質は、マイルドな非イオン性界面活性剤によって可溶化され、陰イオン性色素Coomassie G-250によって荷電されます。したがって、タンパク質複合体は、グラジエントネイティブ−PAGEゲル²²中でそれらの質量に従って分離される。この方法は、出芽酵母²³および哺乳類細胞^24,25のミトコンドリア呼吸鎖複合体の研究に広く使用されています。しかし、S. pombeミトコンドリアには広く適用されていません。

まとめて、ここでは、ミトコンドリアを S.pombe 細胞から単離し、ミトコンドリア呼吸鎖タンパク質をSDS-PAGEおよびBN-PAGEにかけた後、イムノブロッティングを行う方法を紹介します。実験フローチャートを図1に示します。高品質のミトコンドリアと抗体を用いて、 S. pombe に記載されているこの方法は、ミトコンドリア呼吸鎖タンパク質の発現および/または複合体集合に機能を持つ遺伝子をさらに同定するために、他の生物にも適用できる。

1. S. pombe spheroplastsの調製

1. 特定の菌株(WTまたはΔshy1)のサプリメントを含む酵母抽出物(YES)培地(表1)で、OD₆₀₀ = 0.05からOD₆₀₀ = 1.0まで1 LのS.pombe細胞を増殖させます。
   注: S. pombe 細胞は、溶解酵素によってスフェロプラストを形成するために消化するのが難しいため、OD₆₀₀ で2.0を超えて増殖させないでください。野生型(WT)株と遺伝子変異株の両方を並行して増殖させることで、同等の結果を得ることができます。
2. 4°C、3,000 x g で5分間遠心分離し、細胞を回収します。 ペレット化した細胞を500 mLのddH₂Oに再懸濁し、ペレット細胞を4°Cで3,000 x g で5分間遠心分離します。 細胞を1x洗浄します。
3. 細胞ペレットの湿重量を測定します(1,000個の_OD600 細胞に対して約2g)。8 mLの1x Sバッファー(表2;4 mLのSバッファー/g細胞)に細胞を再懸濁します。ジチオスレイトール(DTT)を10 mMに、フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)を1 mMに新たに添加します。
4. 細胞懸濁液に溶解酵素を添加して、 S. pombeの細胞壁を消化します。シェーカーで30°Cの時間、使用する溶解酵素に応じて回転させます。
   注:細胞壁の適切な消化は、高品質のミトコンドリアを単離するための重要なステップです。
   1. 溶解酵素については、細胞の湿重量1gあたり100mgの粉末を加え、約2時間インキュベートします。Lyticaseの場合は、湿重量1gあたり10 mgの粉末を加え、約1時間インキュベートします。Zymolyase-20T/100Tについては、湿重量1gあたり5 mg/1 mgの粉末を添加し、約1時間インキュベートします。Lallzyme MMXの場合、湿重量1gあたり1gの粉末を加え、約0.5時間インキュベートします。Vinotaste酵素については、湿重量1gあたり1gの粉末を加え、約2時間インキュベートします。
5. 顕微鏡法によるスフェロプラストの形成を観察します(40倍対物レンズ)。Sバッファーに20 μLの細胞懸濁液を取り込み、1 mLのddH₂Oに加えると、ほとんどの細胞が壊れていることを確認します(図2C)。
   注:通常の S.pombe 細胞は棒状をしています(図2A)。Sバッファー中のスフェロプラストの80%以上は、効率的な消化後、丸くなるはずです(図2B)。
6. ペレットスフェロプラストを1,000 x g 、4°Cで10分間遠心分離します。 スフェロプラストを氷冷した1x Sバッファー8 mLに再懸濁し、2回洗浄します。先端がカットされたピペットを使用して、スフェロプラストを穏やかに再懸濁します。

2. S. pombe spheroplastsの機械的均質化

1. 1xプロテアーゼ阻害剤を含む8 mLの氷冷1xホモジナイゼーションバッファー(表3;4 mLのホモジナイゼーションバッファー/g細胞)にスフェロプラストを再懸濁します。細胞を予め冷却したガラスホモジナイザーに移します(乳棒と試験管を備えたオンスティッシュグラインダー)。
2. 細胞を機械的に均質化するには、ぴったりとフィットする乳棒で上下に約15回のストロークを行います。ミトコンドリアタンパク質の分解を防ぐには、脳卒中中の気泡を避け、常にホモジナイザーバッファーとホモジナイザーを氷上でインキュベートしてください。
   注:試験管にしっかりとフィットする乳棒と緩い乳棒の2種類があります。緩い乳棒を使用する場合は、最大25回のストロークが必要になる場合があります。ストロークが多すぎるとミトコンドリア膜が損傷する可能性があり、ストロークが少なすぎるとミトコンドリアの収量が減少するため、ストロークの数を最適化する必要があります。
3. 球状体の細胞膜の破損を顕微鏡(40倍対物レンズ)で確認します。
   注:ほとんどの球状形成体は屈折形状を失い、均質化バッファー内でゴースト細胞になります。ミトコンドリアはまだ無傷です。

3. 遠心分離による S. pombe ミトコンドリアの単離

1. 均質化された懸濁液を遠心分離チューブに移し、壊れていない細胞や破片を1,000 x g 、4°Cで5分間遠心分離してペレット化します。
2. 得られた上清を3,000 x g 、4°Cで5分間遠心分離し、核をペレット化します。ペレットが形成されなくなるまで、この手順を1回繰り返します。
3. 上清を新しい遠心分離チューブに移し、ミトコンドリアおよびその他の汚染されたオルガネラをペレット化し、4°Cで12,000 x g で15分間遠心分離します。
4. 上清をデカントし、ペレットを氷冷した1 mLの1x Sorbitol-EDTA-MOPS(SEM)緩衝液に再懸濁します(表4)。12,000 x g 、4°Cで15分間遠心分離し、ミトコンドリアを洗浄します。
5. ペレットを氷冷した1x SEMバッファー1 mLに再懸濁し、将来の実験のためにミトコンドリアを分注します。
   注:このペレットには粗ミトコンドリアが含まれています。-80°Cで保存して、後でSDS-PAGEおよびBN-PAGEの実験を行うことができます。粗ミトコンドリアは、他の実験目的のためにスクロース密度勾配超遠心分離によって精製することもできます。

4. SDS-PAGEとミトコンドリア呼吸鎖タンパク質のイムノブロッティング

1. BCAタンパク質定量キットを使用して、ミトコンドリア懸濁液を約25倍に希釈することにより、ミトコンドリアアリコートの総タンパク質濃度を測定します。
2. SDS-PAGEローディングバッファーを40 μLのミトコンドリア総タンパク質に加えます。適切な温度で指示された時間インキュベートすることにより、タンパク質を変性させます。
   1. S. pombe Cox1、Cox3、Cob1、およびAtp6を検出するには、ミトコンドリアタンパク質を45°Cで3分間変性させます。S. pombe Cox2およびHsp60を検出するには、ミトコンドリアタンパク質を90°Cで5分間変性させます。
3. 約20 μg(約4 μL)のミトコンドリアタンパク質を12% SDS-PAGEゲルにロードします。ステップ6¹⁵に記載されているように、適切な抗体を用いてミトコンドリア呼吸鎖タンパク質のイムノブロッティングを行います。
   注: S. pombe Cob1、Cox1、Cox2、Cox3、およびAtp6タンパク質はmtDNAによってコードされており、 S. pombeでも共通のエピトープでタグ付けするように編集することは困難です。したがって、これらのタンパク質を検出するためには特異的な抗体が必要です。単離されたミトコンドリアの純度と完全性を確認するために、これらの呼吸鎖タンパク質を上清で同時に試験することができます。上清には細胞質タンパク質と核タンパク質が含まれている必要があります。逆に、アクチンやヒストンH3などの代表的な細胞質および核タンパク質は、ミトコンドリアサンプルでテストできます。

5. BN-PAGEのミトコンドリア試料調製

1. ステップ3.5の前のアリコートからのペレットミトコンドリアを、4°Cで12,000 x g で15分間遠心分離することにより。 BN-PAGE解析には、2 mgのミトコンドリアタンパク質(約400 μLのミトコンドリアアリコート)を使用します。
2. ミトコンドリアを200 μLの3x BN-PAGEゲルバッファー(1.5 M 6-アミノカプロアイス酸、150 mM Bis-Tris、pH 7.0、HClで調整)に再懸濁します。2 μL の 100x PMSF と 1 μL の 1 M MgCl₂ を添加します。懸濁液を12,000 x g 、4°Cで15分間遠心分離します。
3. ミトコンドリアペレットを160 μLの5%(w / v)ジギトニン(DG)または64 μLの5%(w / v)n-ドデシル-β-D-マルトピラノシド(DDM)に再懸濁します。氷上で30分間インキュベートし、10分ごとに穏やかに混合します。
   1. S. pombeでの最初の試験では、ミトコンドリアタンパク質1mgあたり4mgのDG界面活性剤を添加してミトコンドリア膜を可溶化し、呼吸鎖スーパーコンプレックスを維持します。ミトコンドリアタンパク質1mgあたり1.6mgのDDM界面活性剤を添加して、個々のミトコンドリア呼吸鎖複合体を分離します。DGおよびDDM治療の濃度は、BN-PAGEのさまざまなタンパク質複合体の初期結果に応じて2倍に増減することにより調整します。
4. 懸濁液を20,000 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。 上清を移し、BCA定量キットで可溶化したタンパク質濃度を測定します。
5. DG処理上清約160 μLに3x BN-PAGEサンプルバッファー80 μL(界面活性剤容量1/2)を添加するか、DDM処理上清約64 μLに3x BN-PAGEサンプルバッファー32 μL(界面活性剤容量1/2)を添加します。
   注:SDS-PAGEとは異なり、BN-PAGEのタンパク質サンプルは沸騰によって変性することはできません。

6. BN-PAGEとミトコンドリア呼吸鎖複合体の免疫ブロッティング

1. プレキャストネイティブBis-Trisゲル(3%-12%グラジエント)を組み立てます。あるいは、グラジエントミキサーで3%と12%のBN-PAGEゲル(表6)を混合することにより、手作りのネイティブBis-Trisゲル(3%-12%グラジエント)を調製します。
2. DGまたはDDM処理したタンパク質サンプルと、ネイティブPAGE用の高分子量タンパク質マーカーをロードします。
   1. ミトコンドリア呼吸鎖複合体のBN-PAGE解析には、合計100 μgの可溶化ミトコンドリアタンパク質が必要です。DG処理タンパク質サンプル約12μLまたはDDM処理タンパク質サンプル5μLをBN-PAGEゲルにロードします。ミトコンドリアマトリックスタンパク質Mcp60(Hsp60)のようなローディング制御の強度が、最終曝露後の全てのサンプル間で等しくなるように、ローディング量を調整する¹⁵。
3. 0.02%(w / v)Coomassie G-250のカソードバッファーを使用して、80 V / 6mAの定電圧/電流でゲルを約30分間実行します。その後、青色カソードバッファーをCoomassie G-250を含まないカソードバッファーに交換し、Coomassie G-250青色染料の前面がゲル底に達するまで、10mAの定電流で約3時間運転を続けます。
   1. ミトコンドリア呼吸鎖複合体の分解または分解を防ぐために、4°Cで事前に冷却したバッファーでゲルを泳動します。 プレキャストゲルには、プレキャストランニングバッファーを使用してください。手作りゲルには、1x BN-PAGEアノードランニングバッファー(50 mM Bis-Tris、pH 7.0、HClで調整)および1x BN-PAGEカソードランニングバッファー(15 mM Bis-Tris、pH 7.0、HClで調整、50 mM Tricine)を使用します。
4. プロテインマーカーを充填したゲルレーンを切断します。マーカーをCoomassie R-250バッファーで15分間染色します。マーカーが見えるまで汚れを落とします。
   注:ネイティブPAGE用の高分子量タンパク質マーカーは、事前に染色されていません。Coomassie R-250で染色すると見えます。
5. ゲルの他の部分を1x BN-PAGE転写バッファー(表7)に浸し、30分間バランスを取ります。同サイズの0.45 μm PVDFブロットメンブレンを100%メタノールですすぎ、BN-PAGEトランスファーバッファーに浸して10分間バランスを取ります。ゲル中のタンパク質を0.45 μm PVDFブロットメンブレンに300 mAの定電流で2時間移します。
   注:NCメンブレンはCoomassie G-250色素に非常にしっかりと結合するため、ニトロセルロース(NC)メンブレンは推奨されません。
6. PVDFメンブレンを100%メタノールですすぎ、Coomassie G-250ブルー染料を洗い流します。5%(w/v)スキムミルクを含む1x TBS(50 mM Tris、pH 8.0、HCl; 150 mM NaClで調整)ベースのブロッキングバッファーでPVDFメンブレンを25°Cで1時間インキュベートします。
7. S. pombeミトコンドリア呼吸鎖複合体に対する示された一次抗体とPVDFメンブレンをインキュベートします。4°Cで一晩。
   注:複合体IIIを検出するためのCob1抗体の濃度は1:1,000です。複合体IVを検出するためのCox1抗体の濃度は1:2,000です。複合体Vを検出するためのAtp6抗体の濃度は1:200です。
8. PVDFメンブレンを1x TBSTバッファーで洗浄します(表8)。PVDFメンブレンを二次抗体と1:10,000の濃度で25°Cで1時間インキュベートします。
9. PVDFメンブレンを1x TBSTバッファーで洗浄します。PVDFメンブレンを露出させてスキャンします。露光したBN-PAGEゲルの画像をネイティブタンパク質マーカーの画像に合わせ、ミトコンドリア呼吸鎖複合体およびスーパー複合体の分子量を推定します。

私たちは以前、このプロトコルを使用して、ヒトSURF1のS.pombeホモログであるshy1の欠失がmtDNAにコードされた呼吸鎖タンパク質の発現とミトコンドリア呼吸鎖複合体の組み立てに及ぼす影響を調査しました。その結果、Δshy1株では、Cob1、Cox1、Cox2、Cox3、Atp6の定常状態レベルが有意に低下していることがわかり(図3)、mtDN...

この研究では、 S. pombe ミトコンドリアを単離し、SDS-PAGEおよびBN-PAGEを実行して、ミトコンドリア呼吸鎖タンパク質の発現と複合体の集合を分析するための詳細なプロトコルを提示します。

共免疫沈降法(co-IP)は、タンパク質複合体の集合を検出するために一般的に使用されてきました。しかし、Co-IPがミトコンドリア膜タンパク質の集合を...

利益相反はありません。

Ying Huang博士とYing Luo博士のご支援に感謝いたします。この研究は、中国国立自然科学基金会からの助成金(J.S.に32270048、G.F.に31900403)によって支援されました。