裂殖酵母粟酒裂殖酵母中线粒体呼吸链蛋白的表达和复合物组装分析

裂殖酵母 Schizosaccharomyces pombe 正在成为研究线粒体的有吸引力的模型。在这里，我们描述了一种用于分析 粟酒链球菌中线粒体呼吸复合物的丰度和组装的方案。这使得能够表征保守基因在线粒体呼吸链中的新功能。

线粒体呼吸链对细胞能量代谢至关重要，是氧化磷酸化的核心。线粒体呼吸链由五种酶复合物及其相互作用的超复合物组成。分析这些蛋白质的表达和复合物组装对于了解线粒体功能至关重要。这可以通过在优秀的模式生物裂殖酵母 Schizosaccharomyces pombe （S. pombe） 中结合生化和遗传方法来研究，它为出芽酵母提供了用于线粒体生物学研究的补偿系统。在这里，我们提出了一种详细的方案，用于分离 粟酒链球 菌线粒体，并通过 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 和蓝色天然 PAGE （BN-PAGE） 分析线粒体呼吸蛋白的表达水平和复合物组装。简而言之，纯化来自野生型和基因突变体的线粒体，然后溶解它们的复合物并进行 SDS-PAGE/BN-PAGE 和免疫印迹。这种方法能够表征基因在线粒体呼吸链中的新功能。

线粒体在多种生物过程中发挥着重要作用，例如细胞能量呼吸、营养代谢和细胞死亡¹。线粒体功能障碍与大脑、肌肉和发育疾病有关 ^2,3。因此，对线粒体的研究对于改善人类衰老和健康至关重要。

出芽酵母酿酒酵母 （S. cerevisiae） 长期以来一直被用于研究线粒体⁴ 中基因的功能，因为呼吸缺陷的酵母突变体仍然可以通过发酵产生生存能量。然而，它是娇小阳性的，可以在没有线粒体 DNA （mtDNA） 的情况下增殖。因此，线粒体基因表达缺陷的基因突变体通常会丢失其 mtDNA，这使得进一步研究复杂化。相比之下，裂殖酵母 Schizosaccharomyces pombe （S. pombe） 在进化上与酿酒酵母相去甚远，是一种需要 mtDNA 才能生存的小阴性酵母。此外，粟酒酵母的 mtDNA 和线粒体 mRNA 的组织与高等真核生物的组织相似⁵。粟酒链球菌中的许多 （96） 必需基因，而酿酒酵母中只有 6 个必需基因，是线粒体基因表达所必需的⁶。因此，粟酒链球菌正在成为研究线粒体中基因新功能的有吸引力的模型。然而，研究酿酒酵母中线粒体的出版物数量比粟酒酵母多出约 100 倍，并且研究粟酒酵母中线粒体的报道方法和方案也很稀缺⁷。

线粒体呼吸链对细胞能量产生至关重要，是线粒体⁸ 的核心。它由呼吸链复合物 I-V，如 NADH-泛醌氧化还原酶（复合物 I）、琥珀酸脱氢酶（复合物 II）、泛醌-细胞色素 c 氧化还原酶或细胞色素 bc1 复合物（复合物 III）、细胞色素 c 氧化酶（复合物 IV）和 ATP 合酶（复合物 V），以及携带电子的两个中间底物泛醌 （CoQ） 和细胞色素 c （Cyt c）⁹.它们还相互作用并形成高阶超复合物，其组装机制在很大程度上仍不清楚^10,11。然而，粟酒链球菌缺乏复合物 I，它可能会被外部 NADH 脱氢酶 Nde1 和内部 Ndi1 取代 12,13,14。粟酒链球菌的线粒体基因组编码复合物 III 的一个亚基 （Cob1）、复合物 IV 的三个亚基（Cox1、Cox2、Cox3）和复合物 V 的三个亚基（Atp6、Atp8、Atp9）^15,16。我们最近报道了这些蛋白质的表达和复合物组装分别受到粟酒链球菌中 RNA 解旋酶 Mss116 （Δmss116）¹⁶ 和组装因子 Shy1 （Δshy1）¹⁵ 缺失的影响。为了促进使用这些方法在线粒体呼吸链中发现更多基因的新功能，我们在这里提供了 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 表达水平分析和蓝色天然 PAGE （BN-PAGE） 分析线粒体呼吸链蛋白复合物组装的详细方案粟米贝。

从粟酒酵母中分离线粒体的基本原理是基于酿酒酵母¹⁷ 中建立的方法。原生质球首先通过消化酵母细胞壁来制备。它们被机械均质化，线粒体通过差速离心分离¹⁸。随后，线粒体呼吸链蛋白在 SDS-PAGE 和 BN-PAGE 后被溶解和免疫印迹。BN-PAGE 技术最初是为分离线粒体膜蛋白而开发的，例如呼吸链复合物 19,20,21。具有保留完整复合物的膜蛋白被温和的非离子去污剂溶解，并由阴离子染料考马斯 G-250 充电。因此，蛋白质复合物在梯度天然 PAGE 凝胶²² 中根据其质量分离。该方法已广泛用于研究酿酒酵母²³ 和哺乳动物细胞^24,25 中的线粒体呼吸链复合物;然而，它尚未广泛应用于 S. pombe 线粒体。

总的来说，我们在这里提出了一种方法，其中从 粟酒链球菌 细胞中分离线粒体，线粒体呼吸链蛋白进行 SDS-PAGE 和 BN-PAGE，然后进行免疫印迹。实验流程图如图 1 所示。凭借高质量的线粒体和抗体， 粟酒链球菌 中描述的这种方法也可以应用于其他生物体，以鉴定更多在线粒体呼吸链蛋白的表达和/或复合物组装中发挥作用的基因。

1. 粟酒链球 原生质球的制备

1. 对于特定菌株（WT 或 Δshy1），从 OD₆₀₀ = 0.05 到 OD₆₀₀ = 1.0，在含补充剂的酵母提取物 （YES） 培养基（表 1）中培养 1 L 粟酒链球菌细胞。
   注意：不要用 OD₆₀₀ 超过 2.0 培养粟酒链球菌细胞，因为它们很难被裂解酶消化形成原生质球。野生型 （WT） 和基因突变菌株可以平行生长以获得可比的结果。
2. 通过在 4 °C 下以 3,000 x g 离心 5 分钟来收获细胞。 将沉淀的细胞重悬于 500 mL ddH₂O 中，并在 4 °C 下以 3,000 x g 离心 5 分钟沉淀细胞。 洗涤细胞 1 次。
3. 测量细胞沉淀的湿重（1,000 个 OD₆₀₀ 细胞约 2 g）。将细胞重悬于 8 mL 的 1x S 缓冲液中（表 2;4 mL S 缓冲液/g 细胞）。新鲜加入二硫苏糖醇 （DTT） 至 10 mM，将苯甲基磺酰氟 （PMSF） 加入至 1 mM。
4. 向细胞悬液中加入裂解酶以消化 S. pombe 的细胞壁。在摇床中于 30 °C 旋转时间，具体取决于所使用的裂解酶。
   注意：细胞壁的正确消化是分离高质量线粒体的关键步骤。
   1. 对于裂解酶，每克湿重的细胞加入 100 毫克粉末并孵育约 2 小时。对于 Lyticase，每 g 湿重加入 10 mg 粉末并孵育约 1 小时。对于 Zymolyase-20T/100T，每 g 湿重加入 5 mg/1 mg 粉末并孵育约 1 小时。对于 Lallzyme MMX，每 g 湿重加入 1 g 粉末并孵育约 0.5 小时。对于 Vinotaste 酶，每克湿重加入 1 克粉末并孵育约 2 小时。
5. 通过显微镜观察原生质球的形成（40 倍物镜）。在 S 缓冲液中取 20 μL 细胞悬液，加入 1 mL ddH₂O，观察大多数细胞都已破裂（图 2C）。
   注意：正常的 粟酒链球菌 细胞具有杆状（图 2A）。S 缓冲液中超过 80% 的原生质球在有效消化后应变成圆形（图 2B）。
6. 通过在 4 °C 下以 1,000 x g 离心 10 分钟来沉淀原生质球。 将原生质球重悬于 8 mL 冰冷的 1x S 缓冲液中并洗涤 2 次。使用带有切割尖端的移液器轻轻重悬原生质球。

2. 粟酒酒样 球原生质球的机械均质化

1. 将原生质球重悬于 8 mL 冰冷的 1x 匀浆缓冲液（表 3;4 mL 匀浆缓冲液/g 细胞）中，含 1x 蛋白酶抑制剂。将细胞转移到预冷的玻璃匀浆器（带有杵和试管的 Dounce 组织研磨机）中。
2. 通过使用紧密贴合的研杵上下敲击大约 15 次，机械地匀浆细胞。为防止线粒体蛋白降解，请避免在中风期间产生气泡，并始终在冰上孵育匀浆缓冲液和匀浆器。
   注意：试管中有两种类型的杵，有紧密配合和松散配合。如果使用松散的杵，可能需要最多 25 次击打。应优化笔击次数，因为过多的笔触会损坏线粒体膜，而太少的笔触会降低线粒体产量。
3. 用显微镜（40 倍物镜）检查原生质球中破损的细胞膜。
   注：大多数原生质球在匀浆缓冲液中失去折射形状并成为幽灵细胞。线粒体仍然完好无损。

3. 离心分离 粟酒链球菌 线粒体

1. 将匀浆悬浮液转移到离心管中，并在 4 °C 下以 1,000 x g 离心 5 分钟，沉淀未破碎的细胞和碎片。
2. 将所得上清液在 4 °C 下以 3,000 x g 离心 5 分钟，然后沉淀细胞核。重复此步骤 1 次，直到没有沉淀形成。
3. 将上清液转移到新的离心管中，并在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 15 分钟，使线粒体和其他受污染的细胞器沉淀。
4. 倒出上清液并将沉淀重悬于 1 mL 冰冷的 1x 山梨糖醇-EDTA-MOPS （SEM） 缓冲液中（表 4）。在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 15 分钟以洗涤线粒体。
5. 将沉淀重悬于 1 mL 冰冷的 1x SEM 缓冲液中，并将线粒体分装以备将来实验使用。
   注意：该颗粒含有粗线粒体。它可以储存在 -80 °C 下，用于以后的 SDS-PAGE 和 BN-PAGE 实验。粗线粒体也可以通过蔗糖密度梯度超速离心纯化，用于其他实验目的。

4. 线粒体呼吸链蛋白的 SDS-PAGE 和免疫印迹

1. 使用 BCA 蛋白定量试剂盒将线粒体悬浮液稀释约 25 倍，测量线粒体等分试样的总蛋白浓度。
2. 将 SDS-PAGE 上样缓冲液添加到 40 μL 线粒体总蛋白中。通过在适当的温度下孵育指定的时间来使蛋白质变性。
   1. 为了检测 粟酒链球菌 Cox1、Cox3、Cob1 和 Atp6，线粒体蛋白在 45 °C 下变性 3 分钟。为了检测 粟酒链球菌 Cox2 和 Hsp60，线粒体蛋白在 90 °C 下变性 5 分钟。
3. 将约 20 μg（约 4 μL）线粒体蛋白加载到 12% SDS-PAGE 凝胶中。如步骤 6¹⁵ 中所述，使用适当的抗体对线粒体呼吸链蛋白进行免疫印迹。
   注意： 粟酒链球菌 Cob1、Cox1、Cox2、Cox3 和 Atp6 蛋白由 mtDNA 编码，即使在粟酒 链球菌中也很难编辑，就像用共同表位标记一样。因此，需要特异性抗体来检测这些蛋白质。为了验证分离的线粒体的纯度和完整性，可以在上清液中同时测试这些呼吸链蛋白，上清液应包含细胞质和核蛋白。相反，可以在线粒体样品中检测代表性细胞质和核蛋白，如肌动蛋白和组蛋白 H3。

5. BN-PAGE 的线粒体样品制备

1. 通过在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 15 分钟，从步骤 3.5 中先前的等分试样中沉淀线粒体。 使用 2 mg 线粒体蛋白（约 400 μL 线粒体等分试样）进行 BN-PAGE 分析。
2. 将线粒体重悬于 200 μL 的 3x BN-PAGE 凝胶缓冲液（1.5 M 6-氨基己酸;150 mM Bis-Tris，pH 7.0，用 HCl 调节）中。加入 2 μL 的 100x PMSF 和 1 μL 的 1 M MgCl₂。在 4 °C 下以 12,000 x g 离心悬浮液 15 分钟。
3. 将线粒体沉淀重悬于 160 μL 5% （w/v） 洋地黄皂苷 （DG） 或 64 μL 5% （w/v） 正十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷 （DDM） 中。在冰上孵育 30 分钟，每 10 分钟轻轻混合一次。
   1. 对于 粟酒链球菌的第一次试验，每 mg 线粒体蛋白添加 4 mg DG 去污剂以溶解线粒体膜以维持呼吸链超复合物。每 mg 线粒体蛋白添加 1.6 mg DDM 去污剂，以分离单个线粒体呼吸链复合物。根据 BN-PAGE 中不同蛋白质复合物的初始结果，通过增加或减少 2 倍来调整 DG 和 DDM 处理的浓度。
4. 将悬浮液在 4 °C 下以 20,000 x g 离心 5 分钟。 转移上清液并用 BCA 定量试剂盒测量溶解蛋白浓度。
5. 将 80 μL（1/2 去污剂体积）的 3x BN-PAGE 样品缓冲液（表 5）添加到约 160 μL DG 处理的上清液中，或将 32 μL（1/2 洗涤剂体积）的 3x BN-PAGE 样品缓冲液添加到约 64 μL DDM 处理的上清液中。
   注：与 SDS-PAGE 不同，BN-PAGE 的蛋白质样品不能通过煮沸变性。

6. 线粒体呼吸链复合物的 BN-PAGE 和免疫印迹

1. 组装预制的天然 Bis-Tris 凝胶（3%-12% 梯度）。或者，通过在梯度混合器中混合 3% 和 12% BN-PAGE 凝胶（表 6）来制备手工制作的天然 Bis-Tris 凝胶（3%-12% 梯度）。
2. 加载 DG 或 DDM 处理的蛋白质样品和用于天然 PAGE 的高分子量蛋白质标记物。
   1. 线粒体呼吸链复合物的 BN-PAGE 分析总共需要 100 μg 溶解的线粒体蛋白。将大约 12 μL DG 处理的蛋白质样品或 5 μL DDM 处理的蛋白质样品加载到 BN-PAGE 凝胶中。调整加载体积以确保加载控制的强度，例如线粒体基质蛋白 Mcp60 （Hsp60） 在最终曝光¹⁵ 后的所有样品中相等。
3. 使用含 0.02% （w/v） 考马斯 G-250 的阴极缓冲液，以 80 V/6 mA 的恒定电压/电流运行凝胶约 30 分钟。随后，用不含考马斯 G-250 的阴极缓冲液替换蓝色阴极缓冲液，并继续以 10 mA 的恒定电流运行约 3 小时，直到考马斯 G-250 蓝色染料前沿到达凝胶底部。
   1. 为防止线粒体呼吸链复合物降解或分解，请在 4 °C 下用预冷缓冲液运行凝胶。 对于预制凝胶，使用预制电泳缓冲液。对于手工制作的凝胶，使用1x BN-PAGE阳极电泳缓冲液（50mM Bis-Tris，pH 7.0，用HCl调节）和1x BN-PAGE阴极电泳缓冲液（15mM Bis-Tris，pH 7.0，用HCl调节;50mM Tricine）。
4. 切割装有蛋白质标记物的凝胶泳道。用考马斯 R-250 缓冲液对标记物染色 15 分钟。脱色直到标记可见。
   注：用于非变性 PAGE 的高分子量蛋白标记物未进行预染色。用考马斯 R-250 染色后可见。
5. 将凝胶的另一部分浸入 1x BN-PAGE 转移缓冲液（表 7）中以平衡 30 分钟。用 100% 甲醇冲洗相同大小的 0.45 μm PVDF 印迹膜，并将其浸入 BN-PAGE 转移缓冲液中以平衡 10 分钟。在 300 mA 的恒定电流下将凝胶中的蛋白质转移到 0.45 μm PVDF 印迹膜上 2 小时。
   注：不建议使用硝酸纤维素 （NC） 膜，因为 NC 膜与考马斯 G-250 染料的结合非常紧密。
6. 用 100% 甲醇冲洗 PVDF 膜，以洗掉考马斯 G-250 蓝色染料。将 PVDF 膜在含有 5% （w/v） 脱脂牛奶的 1x TBS（50 mM Tris，pH 8.0，用 HCl 调节;150 mM NaCl）的封闭缓冲液中孵育 1 小时。
7. 将 PVDF 膜与指定的针对 粟酒链球菌 线粒体呼吸链复合物的一抗在 4 °C 下孵育过夜。
   注：用于检测复合物 III 的 Cob1 抗体浓度为 1：1,000。用于检测复合物 IV 的 Cox1 抗体浓度为 1：2,000。用于检测复合物 V 的 Atp6 抗体浓度为 1：200。
8. 用 1x TBST 缓冲液洗涤 PVDF 膜（表 8）。将 PVDF 膜与浓度为 1：10,000 的二抗在 25 °C 下孵育 1 小时。
9. 用 1x TBST 缓冲液洗涤 PVDF 膜。曝光并扫描 PVDF 膜。将 BN-PAGE 凝胶的曝光图像与天然蛋白质标记物的图像对齐，以估计线粒体呼吸链复合物和超复合物的分子量。

我们之前使用该方案来研究人类 SURF1 的 S. pombe 同源物 shy1 缺失对 mtDNA 编码的呼吸链蛋白表达和线粒体呼吸链复合物组装的影响。我们发现 Δshy1 菌株中 Cob1 、 Cox1 、 Cox2 、 Cox3 和 Atp6 的稳态水平显著降低 （图 3），表明 Shy1 是 mtDNA 编码的呼吸链蛋白表达所必需的。此外，BN-PAGE 分析显示 DG 溶解的呼吸链超复合物 III2IV2 和...

在这项研究中，我们提出了一种分离 粟酒链 球菌线粒体并执行 SDS-PAGE 和 BN-PAGE 以分析线粒体呼吸链蛋白的表达和复合物组装的详细方案。

免疫共沉淀 （co-IP） 通常用于检测蛋白质复合物的组装;然而，co-IP 检测线粒体膜蛋白的组装具有挑战性。相反，BN-PAGE 有几个优点：（i） 一些抗体在 co-IP 期间无法识别隐藏在天然蛋白质复合物中的表位，...

我们没有利益冲突。

我们感谢 Ying Huang 博士和 Ying Luo 博士的支持。这项工作得到了中国国家自然科学基金的资助（32270048 给 JS 和 31900403 给 G.F.）。