Análisis de la Expresión y Ensamblaje de Complejos de las Proteínas de la Cadena Respiratoria Mitocondrial en la Levadura de Fisión Schizosaccharomyces pombe

La levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe está emergiendo como un modelo atractivo para el estudio de las mitocondrias. En este trabajo se describe un protocolo para analizar la abundancia y ensamblaje de los complejos respiratorios mitocondriales en S. pombe. Esto permite la caracterización de las nuevas funciones de los genes conservados en la cadena respiratoria mitocondrial.

La cadena respiratoria mitocondrial es crucial para el metabolismo energético celular, sirviendo como núcleo de la fosforilación oxidativa. La cadena respiratoria mitocondrial comprende cinco complejos enzimáticos y sus supercomplejos que interactúan. El análisis de la expresión y el ensamblaje de complejos de estas proteínas es vital para comprender la función mitocondrial. Esto se puede estudiar mediante la combinación de métodos bioquímicos y genéticos en un excelente organismo modelo, la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), que proporciona un sistema compensatorio a la levadura en ciernes para estudios de biología mitocondrial. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el aislamiento de mitocondrias de S. pombe y el análisis de los niveles de expresión y el ensamblaje de complejos de las proteínas respiratorias mitocondriales mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) y blue native-PAGE (BN-PAGE). En resumen, las mitocondrias de los mutantes de tipo salvaje y genes se purifican, y luego sus complejos se solubilizan y se someten a SDS-PAGE/BN-PAGE e inmunotransferencia. Este método permite caracterizar la nueva función de un gen en la cadena respiratoria mitocondrial.

Las mitocondrias desempeñan un papel importante en diversos procesos biológicos, como la respiración celular para obtener energía, el metabolismo nutricional^{y la muerte} celular. El mal funcionamiento de las mitocondrias está relacionado con enfermedades cerebrales, musculares y del desarrollo ^2,3. Por lo tanto, los estudios sobre las mitocondrias son vitales para mejorar el envejecimiento y la salud humana.

La levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) se ha utilizado durante mucho tiempo para estudiar las funciones de los genes en las mitocondrias⁴ porque los mutantes de levadura defectuosos en la respiración aún pueden producir energía para sobrevivir mediante la fermentación. Sin embargo, es petite-positivo y puede proliferar sin ADN mitocondrial (ADNmt). En consecuencia, los mutantes genéticos defectuosos en la expresión génica mitocondrial a menudo pierden su ADNmt, lo que complica los estudios posteriores. Por el contrario, la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), que es evolutivamente distante de S. cerevisiae, es una levadura pequeña negativa que requiere ADNmt para sobrevivir. Además, la organización del ADNmt y del ARNm mitocondrial de S. pombe es similar a la de los eucariotas superiores⁵. Muchos (96) genes esenciales en S. pombe, en comparación con solo seis genes esenciales en S. cerevisiae, son necesarios para la expresión génica mitocondrial⁶. Por lo tanto, S. pombe está emergiendo como un modelo atractivo para estudiar nuevas funciones de genes en las mitocondrias. Sin embargo, el número de publicaciones que estudian las mitocondrias en S. cerevisiae es aproximadamente 100 veces mayor que el de S. pombe, y los métodos y protocolos reportados que estudian las mitocondrias en S. pombe también son escasos⁷.

La cadena respiratoria mitocondrial es crucial para la producción de energía celular y sirve como núcleo de las mitocondrias⁸. Comprende los complejos de la cadena respiratoria I-V, como la NADH-ubiquinona oxidorreductasa (Complejo I), la succinato deshidrogenasa (Complejo II), la ubiquinona-citocromo c oxidorreductasa o el complejo citocromo bc1 (Complejo III), la citocromo c oxidasa (Complejo IV) y la ATP sintasa (Complejo V), junto con dos sustratos intermedios portadores de electrones, la ubiquinona (CoQ) y el citocromo c (Cyt c)⁹. También interactúan y forman supercomplejos de orden superior, cuyos mecanismos de ensamblaje siguen siendo en gran medida poco claros^10,11. Sin embargo, S. pombe carece del complejo I, que puede ser reemplazado por las deshidrogenasas externas de NADH Nde1 y Ndi1 internas 12,13,14. El genoma mitocondrial de S. pombe codifica una subunidad del complejo III (Cob1), tres subunidades del complejo IV (Cox1, Cox2, Cox3) y tres subunidades del complejo V (Atp6, Atp8, Atp9)^15,16. Recientemente hemos reportado que la expresión y el ensamblaje de complejos de estas proteínas se ven afectados por la deleción del ARN helicasa Mss116 (Δmss16)¹⁶ y del factor de ensamblaje Shy1 (Δshy1)¹⁵ en S. pombe, respectivamente. Para facilitar el descubrimiento de nuevas funciones de más genes en la cadena respiratoria mitocondrial utilizando estos métodos, aquí proporcionamos un protocolo detallado para el análisis de los niveles de expresión de los niveles de expresión de SDS-poliacrilamida en gel de electroforesis (SDS-PAGE) y el análisis de blue native-PAGE (BN-PAGE) del ensamblaje de complejos de las proteínas de la cadena respiratoria mitocondrial en S. pombe.

La justificación del aislamiento de las mitocondrias de S. pombe se basa en los métodos establecidos en S. cerevisiae¹⁷. Los esferoplastos se preparan primero digiriendo las paredes celulares de la levadura. Se homogeneizan mecánicamente y las mitocondrias se fraccionan por centrifugación diferencial¹⁸. Posteriormente, las proteínas de la cadena respiratoria mitocondrial se solubilizan e inmunotranscriben siguiendo SDS-PAGE y BN-PAGE. La técnica BN-PAGE fue desarrollada originalmente para la separación de proteínas de la membrana mitocondrial, como los complejos de cadenas respiratorias 19,20,21. Las proteínas de membrana con complejos intactos conservados se solubilizan con detergentes no iónicos suaves y se cargan con el colorante aniónico Coomassie G-250. Por lo tanto, los complejos de proteínas se separan de acuerdo con su masa en un gel PAGE nativo de gradiente²². Este método ha sido ampliamente utilizado para el estudio de complejos de cadenas respiratorias mitocondriales en S. cerevisiae²³ y células de mamíferos^24,25; sin embargo, no se ha aplicado ampliamente a las mitocondrias de S. pombe.

En conjunto, aquí presentamos un método en el que las mitocondrias se aíslan de las células de S. pombe , y las proteínas de la cadena respiratoria mitocondrial se someten a SDS-PAGE y BN-PAGE seguidas de inmunotransferencia. El diagrama de flujo experimental se ilustra en la Figura 1. Con mitocondrias y anticuerpos de alta calidad, este método descrito en S. pombe también se puede aplicar a otros organismos para identificar más genes con funciones en la expresión y/o ensamblaje de complejos de proteínas de la cadena respiratoria mitocondrial.

1. Preparación de esferoplastos de S. pombe

1. Cultive 1 L de células de S. pombe en el medio de Extracto de Levadura con Suplementos (YES) (Tabla 1) para una cepa particular (WT o Δshy1) de OD₆₀₀ = 0.05 a OD₆₀₀ = 1.0.
   NOTA: No cultive las células de S. pombe con OD₆₀₀ más de 2.0, ya que son difíciles de digerir por las enzimas líticas para formar esferoplastos. Tanto las cepas de tipo salvaje (WT) como las genéticas mutantes se pueden cultivar en paralelo para obtener resultados comparables.
2. Recolección de células por centrifugación durante 5 min a 3.000 x g a 4 °C. Vuelva a suspender las células peletizadas en 500 mL de ddH₂O y las células granuladas por centrifugación durante 5 min a 3.000 x g a 4 °C. Lavar las celdas 1 vez.
3. Mida el peso húmedo del pellet de celda (aproximadamente 2 g para 1,000 OD₆₀₀ celdas). Vuelva a suspender las células en 8 mL de tampón 1x S (Tabla 2; 4 mL de tampón S/g de células). Agregue ditiotreitol (DTT) a 10 mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) a 1 mM fresco.
4. Agregue enzimas líticas a la suspensión celular para digerir la pared celular de S. pombe. Gire en un agitador a 30 °C durante el tiempo que dependa de la enzima lítica utilizada.
   NOTA: La digestión adecuada de la pared celular es un paso crucial para aislar mitocondrias de alta calidad.
   1. Para la enzima lisante, agregue 100 mg de polvo por g de peso húmedo de células e incube durante aproximadamente 2 h. Para la Lyticase, agregue 10 mg de polvo por g de peso húmedo e incube durante aproximadamente 1 h. Para el Zymolyase-20T/100T, agregue 5 mg/1 mg de polvo por g de peso húmedo e incube durante aproximadamente 1 h. Para el Lallzyme MMX, añadir 1 g de polvo por g de peso húmedo e incubar durante unas 0,5 h. Para la enzima Vinotaste, añadir 1 g de polvo por g de peso húmedo e incubar durante unas 2 h.
5. Observar la formación de esferoplastos por microscopía (objetivo 40x). Tome 20 μL de suspensión celular en tampón S y agregue 1 mL de ddH₂O, observe que la mayoría de las células están rotas (Figura 2C).
   NOTA: Las células normales de S. pombe tienen forma de bastoncillos (Figura 2A). Más del 80% de los esferoplastos en el tampón S, después de una digestión eficiente, deberían volverse redondos (Figura 2B).
6. Esferoplastos de pellets por centrifugación durante 10 min a 1.000 x g a 4 °C. Vuelva a suspender los esferoplastos en 8 ml de tampón 1x S helado y lave 2 veces. Vuelva a suspender los esferoplastos suavemente con pipetas con puntas cortadas.

2. Homogeneización mecánica de esferoplastos de S. pombe

1. Resuspenda los esferoplastos en 8 mL de tampón de homogeneización 1x helado (Tabla 3; 4 mL de tampón de homogeneización/g de células) con inhibidores de la proteasa 1x. Transfiera las células a un homogeneizador de vidrio preenfriado (triturador de pañuelos Dounce con un mortero y un tubo de ensayo).
2. Homogeneice las células mecánicamente haciendo aproximadamente 15 golpes hacia arriba y hacia abajo con el mortero bien ajustado. Para evitar la degradación de las proteínas mitocondriales, evite las burbujas durante los accidentes cerebrovasculares e incube siempre el tampón de homogeneización y el homogeneizador en hielo.
   NOTA: Hay dos tipos de morteros con ajuste apretado y suelto en el tubo de ensayo. Si se usa un mortero suelto, es posible que se necesiten hasta 25 golpes. El número de accidentes cerebrovasculares debe optimizarse porque demasiados accidentes cerebrovasculares podrían dañar las membranas mitocondriales, y muy pocos accidentes cerebrovasculares reducen el rendimiento mitocondrial.
3. Compruebe la membrana celular rota en los esferoplastos con un microscopio (objetivo 40x).
   NOTA: La mayoría de los esferoplastos pierden forma refractiva y se convierten en células fantasma en un tampón de homogeneización. Las mitocondrias siguen intactas.

3. Aislamiento de mitocondrias de S. pombe por centrifugación

1. Transfiera la suspensión homogeneizada a los tubos de centrífuga y granule las celdas y los residuos intactos mediante centrifugación durante 5 min a 1.000 x g a 4 °C.
2. Centrifugar el sobrenadante resultante durante 5 min a 3.000 x g a 4 °C y pellets núcleos. Repita este paso 1 vez hasta que no se formen gránulos.
3. Transfiera el sobrenadante a nuevos tubos de centrífuga y granulo, mitocondrias y otros orgánulos contaminados por centrifugación durante 15 min a 12.000 x g a 4 °C.
4. Decantar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 mL de tampón helado 1x Sorbitol-EDTA-MOPS (SEM) (Tabla 4). Centrifugar durante 15 min a 12.000 x g a 4 °C para lavar las mitocondrias.
5. Vuelva a suspender el pellet en 1 mL de tampón SEM 1x helado y alicuone las mitocondrias para futuros experimentos.
   NOTA: Este pellet contiene mitocondrias crudas. Se puede almacenar a -80 °C para experimentos SDS-PAGE y BN-PAGE posteriores. Las mitocondrias crudas también se pueden purificar mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad de sacarosa para otros fines experimentales.

4. SDS-PAGE e inmunotransferencia de proteínas de la cadena respiratoria mitocondrial

1. Mida la concentración total de proteínas de una alícuota mitocondrial utilizando un kit de cuantificación de proteínas BCA diluyendo la suspensión de mitocondrias aproximadamente 25 veces.
2. Añada el tampón de carga SDS-PAGE en 40 μL de proteínas totales mitocondriales. Desnaturalizar las proteínas incubándolas durante el tiempo indicado a la temperatura adecuada.
   1. Para detectar S. pombe Cox1, Cox3, Cob1 y Atp6, desnaturalice las proteínas mitocondriales a 45 °C durante 3 min. Para detectar S. pombe Cox2 y Hsp60, desnaturalice las proteínas mitocondriales a 90 °C durante 5 min.
3. Cargue aproximadamente 20 μg (aproximadamente 4 μL) de proteínas mitocondriales en el gel SDS-PAGE al 12%. Realizar inmunotransferencia de proteínas de la cadena respiratoria mitocondrial con los anticuerpos adecuados, como se describe en el paso 6¹⁵.
   NOTA: Las proteínas Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 y Atp6 de S. pombe están codificadas por ADNmt, que es difícil de editar como el etiquetado con un epítopo común incluso en S. pombe. Por lo tanto, se requieren anticuerpos específicos para detectar estas proteínas. Para verificar la pureza e integridad de las mitocondrias aisladas, estas proteínas de la cadena respiratoria se pueden probar simultáneamente en el sobrenadante, que debe contener proteínas citoplasmáticas y nucleares. Por el contrario, las proteínas citoplasmáticas y nucleares representativas, como la actina y la histona H3, se pueden analizar en la muestra de mitocondrias.

5. Preparación de muestras mitocondriales para BN-PAGE

1. Mitocondrias en gránulos de las alícuotas anteriores en el paso 3.5 mediante centrifugación durante 15 min a 12.000 x g a 4 °C. Utilice 2 mg de proteínas mitocondriales (aproximadamente 400 μL de alícuotas mitocondriales) para el análisis BN-PAGE.
2. Vuelva a suspender las mitocondrias en 200 μL de tampón de gel BN-PAGE 3x (ácido 6-Aminocaproice 1,5 M; 150 mM de Bis-Tris, pH 7,0, ajustado con HCl). Agregue 2 μL de PMSF 100x y 1 μL de 1 M MgCl₂. Centrifugar la suspensión durante 15 min a 12.000 x g a 4 °C.
3. Resuspenda el gránulo de mitocondrias en 160 μL de digitonina (DG) al 5% (p/v) o 64 μL de n-dodecil-β-D-maltopiranósido (DDM) al 5% (p/v). Incubar en hielo durante 30 minutos con una mezcla suave cada 10 minutos.
   1. Para los primeros ensayos en S. pombe, agregue 4 mg de detergente DG por mg de proteínas mitocondriales para solubilizar las membranas mitocondriales y mantener los supercomplejos de la cadena respiratoria. Añadir 1,6 mg de detergente DDM por mg de proteínas mitocondriales para separar los complejos individuales de la cadena respiratoria mitocondrial. Ajuste la concentración del tratamiento DG y DDM aumentando o disminuyendo 2 veces de acuerdo con los resultados iniciales de diferentes complejos de proteínas en BN-PAGE.
4. Centrifugar la suspensión durante 5 min a 20.000 x g a 4 °C. Transfiera el sobrenadante y mida la concentración de proteína solubilizada con el kit de cuantificación de BCA.
5. Añadir 80 μL (1/2 volumen de detergente) de tampón de muestra BN-PAGE 3x (Tabla 5) a unos 160 μL de sobrenadante tratado con DG o añadir 32 μL (1/2 volumen de detergente) de tampón de muestra BN-PAGE 3x a unos 64 μL de sobrenadante tratado con DDM.
   NOTA: A diferencia de SDS-PAGE, las muestras de proteínas para BN-PAGE no se pueden desnaturalizar por ebullición.

6. BN-PAGE e inmunotransferencia de complejos de cadenas respiratorias mitocondriales

1. Ensamblar el gel prefabricado nativo Bis-Tris (3%-12% de gradiente). Alternativamente, prepare el gel Bis-Tris nativo hecho a mano (3%-12% de gradiente) mezclando 3% y 12% de gel BN-PAGE (Tabla 6) en un mezclador de degradado.
2. Cargue muestras de proteínas tratadas con DG o DDM y el marcador de proteínas de alto peso molecular para PAGE nativo.
   1. Se requiere un total de 100 μg de proteínas mitocondriales solubilizadas para el análisis BN-PAGE de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial. Cargue aproximadamente 12 μL de muestra de proteína tratada con DG o 5 μL de muestra de proteína tratada con DDM en el gel BN-PAGE. Ajuste el volumen de carga para asegurarse de que las intensidades del control de carga, como la proteína de la matriz mitocondrial Mcp60 (Hsp60), sean iguales en todas las muestras después de la exposición final¹⁵.
3. Haga funcionar el gel a un voltaje/corriente constante de 80 V/6 mA durante unos 30 minutos utilizando un tampón de cátodo con Coomassie G-250 al 0,02% (p/v). Posteriormente, reemplace el tampón de cátodo azul por tampón de cátodo sin Coomassie G-250 y continúe funcionando a una corriente constante de 10 mA durante aproximadamente 3 h hasta que el frente de tinte azul Coomassie G-250 llegue al fondo del gel.
   1. Para evitar que los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial se degraden o se desensamblen, haga funcionar el gel con tampones preenfriados a 4 °C. Para el gel prefabricado, utilice el tampón de rodadura prefabricado. Para el gel hecho a mano, utilice el 1x tampón de rodadura de ánodo BN-PAGE (50 mM Bis-Tris, pH 7,0, ajustado con HCl) y 1x tampón de rodadura de cátodo BN-PAGE (15 mM Bis-Tris, pH 7,0, ajustado con HCl; 50 mM de tricina).
4. Corta el carril de gel cargado de marcador de proteínas. Tiñe el marcador con tampón Coomassie R-250 durante 15 min. Deñir hasta que el marcador sea visible.
   NOTA: El marcador de proteína de alto peso molecular para PAGE nativo no está teñido previamente. Será visible después de la tinción con Coomassie R-250.
5. Sumerja la otra parte del gel en el tampón de transferencia 1x BN-PAGE (Tabla 7) para equilibrar 30 min. Enjuague la membrana de PVDF del mismo tamaño de 0,45 μm con metanol al 100% y sumérjala en el tampón de transferencia BN-PAGE para equilibrar durante 10 minutos. Transfiera las proteínas del gel a una membrana de PVDF de 0,45 μm bajo una corriente constante de 300 mA durante 2 h.
   NOTA: No se recomienda la membrana de nitrocelulosa (NC) ya que la membrana NC se une muy fuertemente al colorante Coomassie G-250.
6. Enjuague la membrana de PVDF con metanol al 100% para lavar el tinte azul Coomassie G-250. Incubar la membrana de PVDF en el tampón de bloqueo a base de 1x TBS (50 mM Tris, pH 8,0, ajustado con HCl; 150 mM de NaCl) que contiene un 5% (p/v) de leche desnatada durante 1 h a 25 °C.
7. Incubar la membrana de PVDF con los anticuerpos primarios indicados contra los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial de S. pombe durante la noche a 4 °C.
   NOTA: La concentración del anticuerpo Cob1 para la detección del complejo III es de 1:1.000. La concentración del anticuerpo Cox1 para la detección del complejo IV es de 1:2.000. La concentración del anticuerpo Atp6 para la detección del complejo V es de 1:200.
8. Lave la membrana de PVDF con 1x tampón TBST (Tabla 8). Incubar la membrana de PVDF con el anticuerpo secundario a una concentración de 1:10.000 durante 1 h a 25 °C.
9. Lave la membrana de PVDF con 1x tampón TBST. Exponga y escanee la membrana de PVDF. Alinee la imagen expuesta del gel BN-PAGE con la imagen del marcador de proteína nativa para estimar los pesos moleculares de los complejos y supercomplejos de la cadena respiratoria mitocondrial.

Anteriormente utilizamos este protocolo para investigar los efectos de la deleción de shy1, el homólogo de S. pombe de SURF1 humano, en la expresión de proteínas de la cadena respiratoria codificadas por ADNmt y el ensamblaje de complejos de la cadena respiratoria mitocondrial. Encontramos que los niveles de estado estacionario de Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 y Atp6 se redujeron significativamente en la cepa Δshy1 (Figura 3...

En este estudio, presentamos un protocolo detallado para el aislamiento de mitocondrias de S. pombe y la realización de SDS-PAGE y BN-PAGE para analizar la expresión y el ensamblaje de complejos de proteínas de la cadena respiratoria mitocondrial.

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No tenemos conflictos de intereses.

Agradecemos al Dr. Ying Huang y al Dr. Ying Luo por su apoyo. Este trabajo fue apoyado por becas (32270048 a J. S. y 31900403 a G. F.) de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China.