卵巣摘出術による骨サルコペニアのラットモデルの作成

この現在のプロトコルは、卵巣摘出術を使用して骨肉減少症のラットモデルを作成するための手順を概説しています。

骨サルコペニア(OS)は、複雑な変性疾患であり、骨格筋量と骨密度(BMD)が同時に低下することを特徴とし、高齢者に多大な健康被害をもたらします。その臨床的関連性にもかかわらず、OSの根底にある病態生理学的メカニズムは完全には理解されておらず、効果的な治療戦略を促進するためには、その病因をより深く理解する必要性が強調されています。この取り組みでは、信頼性の高い動物モデルの開発が極めて重要です。この研究は、ラットの閉経後骨サルコペニアの誘導のための洗練されたプロトコルを提示します 両側卵巣摘出術、加齢に伴う筋肉および骨量の減少の発症を加速することが知られている方法。この研究では、12週齢のラットを体重別に層別化し、偽手術群または卵巣摘出群(OVX)のいずれかに無作為に割り付けた。左後肢の大腿四頭筋と上腕三頭筋、および左大腿骨からの組織サンプルは、手術後4、8、および12週間で体系的に収集されました。この系統的なアプローチにより、卵巣摘出術が筋肉と骨の健康に及ぼす影響を包括的に評価することができます。筋線維の萎縮と大腿骨の形態の組織学的評価は、ヘマトキシリンとエオシン(HE)染色を使用して実施され、骨ミネラル密度はデュアルエネルギーX線吸収測定法(DXA)を使用して定量化されました。OSの時間進行は、前述の間隔で綿密に監視され、筋肉と骨の変性の間の動的な相互作用についての洞察を提供しました。このモデルは、OSの臨床症状を正確に反映するだけでなく、新しい治療アプローチとその根底にあるメカニズムを調査するための堅牢なプラットフォームとしても機能します。

骨サルコペニアは、骨粗鬆症とサルコペニア 1,2,3,4 の両方の臨床症状をカプセル化する多面的な変性疾患です。骨粗鬆症は、一般的な骨格障害であり、骨量の減少、微細構造の損傷、骨折に対する感受性の高まりを特徴としています。サルコペニアは、しばしば筋消耗症候群と呼ばれ、筋力と体重の減少に代表されます^5,6。マリアムの⁷つの調査結果は、骨サルコペニア単独よりも死亡リスクが30%、低BMD単独よりも8%増加したことを明らかにしました。調査によると、60歳以上の地域住民の16.4%が骨サルコペニアの影響を受けています⁸。韓国では、股関節骨折を患った60歳以上の高齢者の骨サルコペニアの発症率は27.2%と報告されています⁹。OSの人は、転倒、骨折、入院、施設入所のリスクが高く、医療制度や社会に負担がかかっている^10,11。これらの結果の重大性を考えると、OSの予防と治療のための効率的な対策を開発および実施することが重要です。緊急性にもかかわらず、この分野の研究はまだ初期段階にあり、診断基準やさまざまな治療法の有効性をめぐる議論が続いています。したがって、OSの病因を解剖し、より効果的な治療アプローチに情報を提供できる分子基盤を明らかにするためには、信頼性の高い動物モデルの開発が不可欠です。

現在、骨サルコペニアに関する前臨床研究によく使用されているモデルには、薬物の介入なしに人間の老化プロセスをシミュレートする老化モデルがあります。このアプローチは自然なプロセスに近く、費用対効果が高いです。しかし、それは成熟¹²のためのかなりの時間の投資を必要とします。化学薬品注入法には、モデリングサイクルが短い、安定した結果が得られる、低コストになるなど、一定の利点があります。しかし、ホルモンの投与量の正確な決定、注射に必要な技術的スキル、ホルモン介入の変動する効果など、課題も提示しています^13,14。遺伝子工学モデルには、遺伝的に欠陥があり、コストがかかる可能性のある遺伝子組み換え生物が含まれる場合があります。これらのモデルは非常に特殊ですが、¹⁵を製造するには著しく複雑で高価です。廃用モデルは、臨床患者に対する長期の安静の影響をシミュレートします¹⁶。廃用モデルは、筋肉の減少に対処するには効果的かつ費用対効果が高いですが、血栓や褥瘡などの合併症に関連しています。これらのモデルは、四肢壊死^17,18およびホルモン欠乏モデルを予防するために定期的に監視されています。科学界では、両側卵巣摘出術が骨粗鬆症の動物モデルを確立するための効果的な方法として機能するという一般的な合意があります^19,20。

研究によると、骨組織と筋肉組織も、自己分泌、内分泌、およびパラクリンのメカニズムを通じて互いに相互作用することができることが示されています²¹。筋肉および骨髄における脂肪組織の蓄積は、骨サルコペニア²の文脈における骨および筋肉量の減少の指標として機能します。高齢者のサルコペニアは、骨密度の低下と骨の微細構造の悪化に直接関連しています。さらに、筋肉量の減少は、骨の微細構造の劣化の独立した危険因子として機能します²²。この方法論は、サルコペニア^23,24のモデリングのための実行可能な戦略として認識されており、これは潜在的に両方の条件²⁵の結合モデルとして役立つ可能性がある。骨サルコペニアを誘発する手段としての卵巣切除術の適用に関する研究は限られていますが、このアプローチは潜在的な有効性を示しています。前臨床研究で卵巣摘出術を利用する利点には、迅速なモデリングプロセス、薬理学的介入の排除、安定した実験モデルの作成、簡単な実装、および費用対効果が含まれます。

本研究は、妊娠していない個体の卵管と卵巣の両方のセグメントを切除することにより、雌ラットで前臨床モデルを作成する手順を説明することを目的としています。このアプローチは、OSの分子基盤を調査し、制御された実験環境での介入の治療上の利点を評価するための貴重なツールとして機能します。

12週齢、体重約200〜240gの雌Sprague Dawleyラット(n = 36)を、12時間の明暗サイクルで特異的病原体フリー(SPF)動物室の換気ケージに個別に収容しました。彼らはSPF飼料と滅菌水に無料でアクセスできました。ラットは、実験の1週間前に環境に順応することを許されました。無作為割り当てを使用して、ラットは手術後4週間、8週間、および12週間、卵巣摘出(OVX)グループ(それぞれ6匹のラット)と偽グループ(それぞれ6匹のラット)に分けられました。すべての動物処置は、遼寧省伝統中国医学大学の動物福祉委員会の承認されたガイドライン(第21000042021040号)に従って実施されました。

1. ラットの卵巣摘出術

注:このプロトコルで使用される手術器具は 図1にあります。

1. ラットをSPFの動物室に保管し、滅菌済みの機器を使用して無菌環境で必要なすべての手順に従ってください。
2. 白い粉末であるペントバルビタールナトリウムを蒸留水または0.9%生理食塩水と混合して、麻酔薬溶液を作成します。標準用量は30 mg / kgです。それに応じてシリンジを満たします。
   注:ソリューションは不安定であるため、すぐに使用する必要があることに注意することが重要です。一度に 1 つの実験に必要な量を準備します。
3. ラットの腹部を頭より上に持ち上げて、内臓を上腹部に移します。利き手を使用して、腹部の正中線の左側(または右側)から1〜1.5 cmに注射器を配置し、ラットの体に45°の角度で挿入します。薬液を投与した後、針を回転させてから引き抜きます。
4. 麻酔の投与後、ラットの呼吸を注意深く監視し、つま先をつまんで完全に麻酔がかかっていることを確認します。
   注:けいれんやけいれんの兆候がある場合は、続行する前にさらに待つことをお勧めします。.
5. ラットを手術台に置き、手足を固定し、トリマーを使用して背中の両側の毛を取り除きます(図2A)。
   注:脱毛効果が理想的でない場合は、脱毛クリームを脱毛に使用できます。
6. ヨウ素に浸したコットンボールを使用して、脱毛した領域を消毒します。
   注:外科的消毒のプロセスには、中心から始めて円形のパターンで外側に移動することが含まれ、通常は3回繰り返されます。
7. 中心線から約1.0cm離れた背面に切開を行います。胸郭の湾曲と脊柱の境界との間の接合部に近づけて、両側の皮膚、筋膜、筋肉を分離して、切開部を0.5〜1cmわずかに下げます(図2B)。
   注:後腹壁の弱い筋肉層を介して腹腔にアクセスするために、切開は可能な限り最小限に抑えられます。
8. 卵巣を見つけるのは最初は難しいかもしれません。卵管の位置を特定し、緩い脂肪組織の層に包まれている卵巣の末端まで追跡することから始めます。
   注:右卵巣は、腎臓の7〜12 mm後ろ、中心線から15 mm離れた、第4〜5腰椎の側面に配置されています。左卵巣は、腎臓の3〜5 mm後ろ、中心線から11 mmのところにある第5〜6腰椎の側面にあります。
9. 卵巣と卵管の端を慎重に持ち上げて体から取り出します(図2C)。止血鉗子を子宮端と卵巣の間の最も狭窄した領域に適用します。外科用糸を使用して結び、はさみで卵巣を完全に切除します。
   注:処置中に卵管と子宮を取り扱うときは、過度に引っ張らないように、優しくすることが重要です。卵巣摘出術の前に使用する結紮糸は、卵巣の周りの柔らかい脂質組織が卵巣を緩めやすい原因となる可能性があるため、しっかりと固定する必要があります。この予防措置は、ラットの死につながる可能性のある術後出血を防ぐために必要です。偽のグループでは、卵巣に隣接する等しい体積とサイズの脂肪組織を切除し、続いて筋肉と皮膚を縫合しました。
10. 止血鉗子を離し、子宮を静かに腹腔に戻します。
11. 感染を避けるために、卵巣と卵管が結紮されている腹部の傷にペニシリンを投与します。.
    注:ペニシリン80,000ユニット/ラットを1日1回、3日間連続して投与します。.
12. 皮膚と筋肉の層を個別に縫合します(サイズ3-0)(図2D)。
    注:滅菌は、手術後24〜48時間で、1〜2日の間隔を空けて実施する必要があります。
13. ラットを消毒されたケージに戻し、麻酔から完全に意識を取り戻すまで監視します。
    注:動物が麻酔から完全に回復するまで、処置中も熱サポートを提供し続けます。
14. 創傷感染を避けるために、各グループのラットにペニシリンナトリウム80,000ユニット/ラットの筋肉内注射を1日1回、3日間連続して投与します²⁶。

2. 骨組織と筋肉組織の採取

注:ラットは、モデリング手術の4、8、および12週間後に、ペントバルビタールナトリウム(100-200 mg / kg)の過剰投与で安楽死させました。合計36のサンプルが収集されました。

1. 左ふくらはぎの上腕三頭筋と大腿四頭筋を露出させます。これらの筋肉を起点と終点で慎重に特定して解剖し、完全性を維持します。これに続いて、筋肉の湿った重量の平均を記録して計算し、筋肉の湿った重量係数を決定します。
   注:動物の体重と骨格筋湿重量係数=ラット筋湿重量/体重。
2. 関節包を大腿骨に沿って上向きにスライスすることにより、大腿骨を完全に取り外します。次に、近くの筋肉と靭帯組織を取り除きます。

3. 病理検査

1. 筋肉組織を10%中性緩衝ホルマリン溶液を含むレセプタクルに24時間浸します。その後、筋肉組織を流水で広範囲にすすぎ、固定液を取り除きます。
2. 左大腿骨を4%パラホルムアルデヒド溶液に1週間入れ、十分な量のエチレンジアミン四酢酸(EDTA)脱灰溶液に浸してカルシウム沈着物を除去し、バッファーを毎日交換します。
3. デュアルエネルギーX線吸収測定法(DXA)骨密度計を使用して骨密度の値を測定します。大腿骨を二重エネルギーX線に置きます。測定精度を Fineに設定し、モードを Small Animal-Specific Modeに調整し、付属のBMD解析ソフトウェアを使用してラット大腿骨のBMDを解析します。
4. サンプルをパラフィンワックスに入れます。定期的な組織学的検査のためのサンプルの切片²⁷。

4. 統計解析

1. 連続変数を平均±±標準偏差(SD)として表し、独立標本のt検定を使用して2つのグループ間を比較します。すべての統計解析は、統計的有意性をP < 0.05に設定した両面アプローチに従っていました。適切なデータ分析ソフトウェアを使用して、データ分析を実行します。

このプロトコルは、骨サルコペニアのラット モデルを確立するための両側卵巣摘出術手順の詳細な説明を提供します。 図3 は、OVX群の大腿四頭筋の湿式重量係数が偽群と比較して減少していることを示しています。手術後4週間の時点では、両群間でBMDに統計学的に有意な差は認められませんでしたが、術後8週および12週の時点で、OVX群のBMDは偽手術群のBMDよりも有意に低かった。

図4では、上腕三頭筋の有意な萎縮がOVXグループで観察され、モデリング後12週間で偽グループと比較して筋線維のギャップが広くなっています。図5は、術後4週間で、OVX手術群と偽手術群の両方で大腿骨頭の小柱密度が類似しており、良好な接続性を備えた規則的で密集した配置を示していることを示しています。しかし、術後8週間でOVX群の小柱の数が減少し始め、骨髄腔面積が増加してまばらに整列するようになった。骨髄腔内の脂肪細胞の量は、偽群よりも多かった。術後 12 週間で、OVX の小柱は顕著な減少を示し、不完全な相互接続、骨髄腔領域の顕著な拡大、および偽群と比較して脂肪細胞数が大幅に増加しました。

図1:手術器具(A)ストレートニードルホルダー。(B)ストレートマヨハサミ。(C)使い捨ての薬剤交換トレイ。(D)滅菌コットンボール(E)シリンジ。(f)ヨウ素。(G)縫合針。(H)縫合線。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:OVXモデルの確立 (A)脱毛(B)皮膚から皮下層までの長さ1cmの手術用開口部を作った。(C)卵巣と卵管の一部の除去を伴う結紮。(D)閉じた傷。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:大腿四頭筋/体重と骨密度。 (A)大腿四頭筋の湿った重量係数。(B)骨塩密度(偽群と比較して、* P<0.05、** P<0.01、*** P<0.001)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:ふくらはぎの上腕三頭筋の筋線維からの組織切片のHE染色。 (A)偽グループでのモデリング手順の4週間後の筋肉形態。(B)偽グループでのモデリング手順の8週間後の筋肉形態。(C)偽群におけるモデリング手順に従った筋肉形態12。(D)OVXグループでのモデリングから4週間後の筋肉形態。(E)OVXグループでのモデリングから8週間後の筋肉形態。(F)OVXグループでのモデリングから12週間後の筋肉形態。スケールバー:1000μmこの 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:大腿骨頭からの組織切片のHE染色(A)偽群でのモデリングから4週間後の大腿骨の形態。(B)偽群でのモデリングから8週間後の大腿骨の形態。(C)偽のグループでモデリングしてから12週間後の大腿骨。(D)OVXグループでのモデリングから4週間後の大腿骨の形態。(E) OVXグループでのモデリングから8週間後の大腿骨の形態。(F)OVXグループでのモデリングから12週間後の大腿骨の形態。スケールバー:1000μm.(G)定量化された肥満領域。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

両側卵巣摘出動物モデルは、骨サルコペニアの根底にあるメカニズムを解明し、潜在的な治療介入を評価するのに役立ちます。ラットの卵巣摘出術による骨粗鬆症は、閉経後の女性に見られるエストロゲンレベルの急激な低下を反映しており、骨粗鬆症研究のモデルとして一般的に採用されています。さらに、研究では、高齢者の骨粗鬆症とサルコペニアとの間に有意な関連性があることが強調されており、筋肉と骨の同時減少が頻繁に観察されます。その結果、多くの研究がこのモデルを利用してサルコペニアを調査してきました^28,29。その結果、本研究は骨サルコペニアの動物モデルを確立することに成功しました。

信頼性の高いモデルを確立する際には、いくつかの重要な要素を考慮する必要があります。適切な動物モデルは、利便性、関連性、および特異性によって特徴付けられなければならない³⁰。SDラットは、骨粗鬆症のモデリングで最も一般的に使用される動物です。卵巣の摘出後、ラットの骨で起こるこの形質転換のメカニズムは、ヒト^31,32で観察された閉経後の骨量減少の過程と非常によく似ている。研究によると、11週齢から36週齢のラットは、骨粗鬆症またはサルコペニアモデル^33,34,35,36のいずれかを再現するのに最適です。性別に関しては、女性の骨サルコペニアの有病率は28%で、男性の14%よりも高かった²¹。そこで、雌ラットを選抜しました。ラットは³⁷歳で約6週齢で性成熟するので、12週齢のラットを選びました。調査研究では、大腿四頭筋の筋肉の体積が若年者と比較して高齢者で大幅に減少していることがわかり、老化が大腿四頭筋^の体積38により悪影響を与えることが示唆されています。骨粗鬆症は、大腿骨の骨密度をゴールドスタンダード³²として使用します。そこで、大腿四頭筋と大腿骨を選択しました。

外科的手技の一貫性は非常に重要であり、切開の局在とサイズの均一性を確保するために、同じ個人がすべての手順を実行することが推奨されています。全体の手順は、いくつかの重要なステップで構成されています。まず、麻酔薬の腹腔内注射は、内臓に穴を開けないようにする必要があります。薬物投与の前に、針が血管に入らないように吸引し、シリンジプランジャーを正確に押し、プロセス全体で安定性と速度を維持することが不可欠です。第二に、腹膜を切除した後、すぐに卵巣を特定することは困難であり、オペレーターがラットの解剖学的構造を包括的に理解する必要があります。卵巣の位置が決まったら、卵管と卵巣の一部を結紮して除去することは、ラットの術後の生存にとって重要なステップです。卵巣の近くには柔らかい脂肪組織があるため、結束後に縫合糸が緩みやすく、出血や手術後に死亡する可能性があります。最後に、縫合に先立ち、手術部位にペニシリンを塗布し、感染予防策として手術後3日で追加の筋肉内投与を行うことが推奨されます。

外科的処置と麻酔の投与の結果として、ラットは激しい痛みや死に至ることさえあり、意識を取り戻すまで暖かく衛生的で換気の良い環境に置く必要があります。術後の最初の週には、研究全体を通してラットの行動活動に注意を払いながら、注意深いモニタリングが不可欠です。

このモデルの利点には、そのユーザーフレンドリーな性質、効率的なモデリング機能、費用対効果、骨粗鬆症や筋肉喪失の自然な進行を模倣する能力などがあります。それにもかかわらず、このモデルには、卵巣摘出手術後のエストロゲンレベルの急速な低下など、特定の制約が関連付けられており、エストロゲンはサルコペニアの直接的な寄与者として認識されていません。本実験は雌ラットで行われ、雄ラットは関与しませんでした。これらの制限にもかかわらず、両側卵巣摘出動物モデルは、OSを調査し、疾患の進行の道を探るための貴重なリソースとして浮上しています。

各著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

この研究は、(1)全米自然科学財団(82305275)からの助成金によってサポートされています。(2)遼寧省自然科学基金会プログラム(2022-YGJC-80および2022-YGJC-79)。(3)TCMの国家行政の高レベルの漢方薬主要分野建設プロジェクト(zyyzdxk-2023040)。