Creación de un modelo de rata para la osteosarcopenia mediante ovariectomía

Este protocolo actual describe un procedimiento para crear un modelo de osteosarcopenia en ratas mediante ovariectomía.

La osteosarcopenia (OS), un trastorno degenerativo complejo, se caracteriza por la disminución simultánea de la masa muscular esquelética y la densidad mineral ósea (DMO), lo que representa un enorme peligro para la salud de la población anciana. A pesar de su relevancia clínica, los mecanismos fisiopatológicos subyacentes a la SG no se comprenden completamente, lo que subraya la necesidad de una comprensión más profunda de su etiología para facilitar estrategias de tratamiento eficaces. El desarrollo de un modelo animal fiable es fundamental en este esfuerzo. Este estudio presenta un protocolo refinado para la inducción de osteosarcopenia posmenopáusica en ratas a través de la ovariectomía bilateral, un método conocido por acelerar la aparición de la pérdida muscular y ósea relacionada con la edad. En este estudio, las ratas de 12 semanas de edad fueron estratificadas por peso corporal y asignadas aleatoriamente a un grupo de operación simulada o a un grupo ovariectomizado (OVX). Se recogieron sistemáticamente muestras de tejido de los músculos cuádriceps y tríceps de la extremidad posterior izquierda, así como del fémur izquierdo, a las 4, 8 y 12 semanas después de la cirugía. Este enfoque metódico garantiza una evaluación exhaustiva de los efectos de la ovariectomía en la salud muscular y ósea. La evaluación histológica de la atrofia de las fibras musculares y la morfología femoral se realizó mediante tinción con hematoxilina y eosina (HE), mientras que la densidad mineral ósea se cuantificó mediante absorciometría de rayos X de doble energía (DXA). La progresión temporal de la SG se monitoreó meticulosamente en los intervalos antes mencionados, lo que proporcionó información sobre la interacción dinámica entre la degeneración muscular y ósea. Este modelo no solo refleja con precisión las manifestaciones clínicas de la SG, sino que también sirve como una plataforma sólida para investigar nuevos enfoques terapéuticos y sus mecanismos subyacentes.

La osteosarcopenia es una enfermedad degenerativa multifacética que engloba las manifestaciones clínicas tanto de la osteoporosis como de la sarcopenia 1,2,3,4. La osteoporosis, un trastorno esquelético prevalente, se caracteriza por una disminución de la masa ósea, una microarquitectura comprometida y una mayor susceptibilidad a las fracturas. La sarcopenia, a menudo denominada síndrome de desgaste muscular, se caracteriza por una reducción de la fuerza y la masa muscular ^5,6. Los⁷ hallazgos de Maryam revelaron que la osteosarcopenia aumentó el riesgo de muerte en un 30% con respecto a la sarcopenia sola y en un 8% con la DMO baja sola. Las investigaciones han demostrado que el 16,4% de las personas de 60 años o más que viven en la comunidad se ven afectadas por la osteosarcopenia⁸. En Corea del Sur, la incidencia de osteosarcopenia entre las personas mayores de 60 años o más que han sufrido fracturas de cadera es del 27,2%⁹. Las personas con SG enfrentan mayores riesgos de caídas, fracturas, hospitalización e institucionalización, lo que supone una carga para el sistema de salud y la sociedad^10,11. Dada la gravedad de estas consecuencias, es crucial desarrollar e implementar medidas eficientes para la prevención y el tratamiento de la OS. A pesar de la urgencia, la investigación en este campo sigue siendo incipiente, con debates en curso en torno a los criterios diagnósticos y la eficacia de diversas modalidades de tratamiento. Por lo tanto, el desarrollo de modelos animales fiables es esencial para diseccionar la patogénesis de la SG y descubrir los fundamentos moleculares que podrían servir de base para enfoques de tratamiento más eficaces.

En la actualidad, los modelos comúnmente utilizados para los estudios preclínicos sobre la osteosarcopenia incluyen el modelo de envejecimiento, que simula el proceso de envejecimiento humano sin intervención farmacológica. Este enfoque está más cerca del proceso natural y es rentable; sin embargo, exige una importante inversión de tiempo para su maduración¹². El método de inyección de drogas químicas ofrece ciertos beneficios, como un ciclo de modelado corto, resultados estables y bajo costo. Sin embargo, también presenta desafíos, incluyendo la determinación precisa de la dosis de hormonas, la habilidad técnica requerida para la inyección y los efectos variables de las intervenciones hormonales^13,14. Los modelos de ingeniería genética pueden involucrar organismos genéticamente modificados que pueden ser genéticamente defectuosos y costosos. Aunque estos modelos son muy específicos, son notablemente más complejos y costosos de producir¹⁵. Los modelos de desuso simulan los efectos del reposo prolongado en cama en pacientes clínicos¹⁶. Los modelos en desuso son efectivos y rentables para tratar la pérdida muscular, pero se asocian con complicaciones como coágulos de sangre y úlceras por presión. Estos modelos se monitorean de manera rutinaria para prevenir la necrosis de las extremidades^17,18 y los modelos con deficiencia de hormonas; Existe un acuerdo prevaleciente dentro de la comunidad científica de que la ovariectomía bilateral sirve como un método eficaz para establecer un modelo animal de osteoporosis^19,20.

Las investigaciones indican que los tejidos óseos y musculares también pueden interactuar entre sí a través de mecanismos autocrinos, endocrinos y paracrinos²¹. La acumulación de tejido adiposo en el músculo y la médula ósea sirve como indicador de la reducción de la masa ósea y muscular en el contexto de la osteosarcopenia². La sarcopenia en los adultos mayores se asocia directamente con una reducción de la densidad ósea y el deterioro de la microarquitectura ósea. Además, la disminución de la masa muscular sirve como un factor de riesgo independiente para la degradación de la microestructura ósea²². Esta metodología ha sido reconocida como una estrategia viable para el modelado de la sarcopenia^23,24, que potencialmente podría servir como un modelo combinado para ambas condiciones²⁵. A pesar del limitado cuerpo de investigación sobre la aplicación de la ovariectomía como medio para inducir osteosarcopenia, este enfoque demuestra una eficacia potencial. Los beneficios de utilizar la ovariectomía en estudios preclínicos abarcan un proceso de modelado rápido, la eliminación de intervenciones farmacológicas, la creación de un modelo experimental estable, una implementación sencilla y una relación costo-efectividad.

El presente estudio tiene como objetivo delinear el procedimiento para crear un modelo preclínico en ratas hembras a través de la extirpación de un segmento de trompas de Falopio y ovarios en individuos no embarazadas. Este enfoque es una herramienta valiosa para investigar los fundamentos moleculares de la SG y para evaluar los beneficios terapéuticos de las intervenciones en un entorno experimental controlado.

Las ratas hembras Sprague Dawley (n = 36), de 12 semanas de edad y con un peso aproximado de 200-240 g, se alojaron individualmente en jaulas ventiladas en una sala de animales libre de patógenos específicos (SPF) con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Tenían libre acceso a alimento SPF y agua estéril. A las ratas se les permitió aclimatarse al medio ambiente durante una semana antes de los experimentos. Usando la asignación aleatoria, las ratas se dividieron en grupos ovariectomizados (OVX) (cada uno con 6 ratas) y grupos simulados (cada uno con 6 ratas) durante 4, 8 y 12 semanas después de la cirugía. Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo siguiendo las directrices aprobadas por el comité de bienestar animal de la Universidad de Medicina Tradicional China de Liaoning (Nº 21000042021040).

1. Ovariectomía en ratas

NOTA: El aparato quirúrgico utilizado en este protocolo se encuentra en la Figura 1.

1. Mantenga a las ratas en la sala de animales con SPF y siga todos los procedimientos necesarios utilizando equipo esterilizado en un ambiente estéril.
2. Mezcle pentobarbital sódico, un polvo blanco, con agua destilada o una solución salina normal al 0,9 % para crear una solución anestésica. La dosis estándar es de 30 mg/kg; Llene la jeringa en consecuencia.
   NOTA: Es importante tener en cuenta que la solución es inestable y debe usarse de inmediato. Prepare la cantidad requerida para un experimento a la vez.
3. Eleva el abdomen de la rata por encima de su cabeza para desplazar las vísceras a la parte superior del abdomen. Con la mano dominante, coloque una jeringa a 1-1,5 cm del lado izquierdo (o derecho) de la línea media del abdomen e insértela en un ángulo de 45° en el cuerpo de la rata. Después de administrar la solución del medicamento, gire la aguja y luego retírela.
4. Después de la administración de anestesia, controle cuidadosamente la respiración de la rata y pellizque los dedos de los pies para confirmar que está completamente anestesiada.
   NOTA: Si hay algún signo de espasmos o convulsiones, es aconsejable esperar más tiempo antes de continuar.
5. Coloque a la rata en la mesa de operaciones, asegure sus extremidades y retire el pelo de ambos lados de su espalda con una recortadora (Figura 2A).
   NOTA: Si el efecto de depilación no es ideal, se puede utilizar crema depilatoria para la depilación.
6. Desinfecte el área donde se eliminó el vello con bolas de algodón empapadas en yodo.
   NOTA: El proceso de desinfección quirúrgica implica comenzar desde el centro y moverse hacia afuera en un patrón circular, generalmente repetido tres veces.
7. Haga una incisión en la espalda, a aproximadamente 1,0 cm de distancia de la línea central. Haga la incisión cerca de la unión entre la curvatura de la caja torácica y el borde de la columna vertebral, ligeramente más abajo entre 0,5 y 1 cm, separando la piel, la fascia y el músculo de ambos lados (Figura 2B).
   NOTA: Para acceder a la cavidad abdominal a través de la capa muscular más débil de la pared abdominal posterior, la incisión se mantiene lo más mínima posible.
8. Encontrar el ovario puede ser un desafío al principio. Comience por ubicar el oviducto y trazarlo hasta el extremo terminal del ovario, que está encerrado en una capa de tejido adiposo suelto.
   NOTA: El ovario derecho se coloca en el lado de la 4ª a 5ª vértebras lumbares, a 7-12 mm detrás del riñón y a 15 mm de distancia de la línea central. El ovario izquierdo está situado en el lado de la 5ª a la 6ª vértebra lumbar, a 3-5 mm detrás del riñón y a 11 mm de la línea central.
9. Levante con cuidado el ovario y el extremo del oviducto para sacarlos del cuerpo (Figura 2C). Aplique las pinzas hemostáticas en la región más constreñida entre el extremo uterino y el ovario. Use un hilo quirúrgico para atarlo y luego extirpe el ovario por completo con unas tijeras.
   NOTA: Es crucial ser cuidadoso al manipular el oviducto y el útero durante el procedimiento, evitando tirones excesivos. La ligadura utilizada antes de la ovariectomía debe estar firmemente asegurada, ya que el tejido lipídico blando alrededor del ovario puede hacer que se suelte fácilmente. Esta precaución es necesaria para prevenir el sangrado postoperatorio, que podría resultar en la muerte de las ratas. En el grupo simulado, se extirpó el tejido adiposo de igual volumen y tamaño adyacente al ovario, seguido de una sutura del músculo y la piel.
10. Libere las pinzas hemostáticas y devuelva suavemente el útero a la cavidad abdominal.
11. Administre penicilina en las heridas abdominales donde se ligadan los ovarios y las trompas de Falopio para evitar infecciones.
    NOTA: Administrar penicilina 80.000 unidades/rata una vez al día durante 3 días consecutivos.
12. Suturar individualmente (tamaño 3-0) las capas de piel y músculo (Figura 2D).
    NOTA: La esterilización debe realizarse 24-48 h después de la cirugía, espaciada entre 1 y 2 días.
13. Vuelva a colocar a la rata en una jaula desinfectada y vigílela hasta que recupere completamente la conciencia de la anestesia.
    NOTA: Continúe proporcionando soporte de calor durante el procedimiento hasta que el animal se haya recuperado completamente de la anestesia.
14. Para evitar la infección de la herida, administrar a las ratas de cada grupo una inyección intramuscular de penicilina sódica 80.000 unidades/rata una vez al día durante 3 días consecutivos²⁶.

2. Recolección de tejido óseo y tejidos musculares

NOTA: Las ratas fueron sacrificadas con una sobredosis de pentobarbital sódico (100-200 mg/kg) a las 4, 8 y 12 semanas después de la cirugía de modelado. Se recogieron un total de 36 muestras.

1. Exponga los músculos tríceps braquial y cuádriceps de la pantorrilla izquierda. Identifique y diseccione cuidadosamente estos músculos en sus puntos de origen y punto final para preservar su integridad. Después de esto, registre y calcule el promedio de los pesos húmedos de los músculos para determinar los coeficientes de peso húmedo de los músculos.
   NOTA: Peso corporal del animal y coeficiente de peso húmedo del músculo esquelético = peso húmedo del músculo de rata/peso corporal.
2. Separe completamente el fémur cortando la cápsula articular hacia arriba a lo largo del fémur. Luego, elimine el tejido muscular y ligamento cercano.

3. Examen anatomopatológico

1. Sumerja los tejidos musculares en un recipiente que contenga una solución de formalina tamponada neutra al 10% durante 24 h. Después de esto, enjuague abundantemente los tejidos musculares con agua corriente para eliminar el fijador.
2. Coloque el fémur izquierdo en una solución de paraformaldehído al 4% durante 1 semana, luego sumérjalo en una cantidad suficiente de solución de descalcificación de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) para eliminar los depósitos de calcio, con el cambio diario del tampón.
3. Mida los valores de densidad mineral ósea utilizando un densitómetro óseo de absorciometría de rayos X (DXA) de doble energía. Coloque el fémur en una radiografía de energía dual. Establezca la precisión de la medición en Fina, ajustando el modo al modo específico de animales pequeños, y analice la DMO de los fémures de rata utilizando el software de análisis de DMO adjunto.
4. Coloque la muestra en cera de parafina. Seccionar las muestras para el examen histológico de rutina²⁷.

4. Análisis estadístico

1. Presentar las variables continuas como media ±± desviación estándar (DE) y comparar entre los dos grupos utilizando la prueba t de muestra independiente. Todos los análisis estadísticos siguieron un enfoque bilateral, con una significación estadística de P < 0,05. Utilice un software de análisis de datos adecuado para realizar análisis de datos.

Este protocolo proporciona una descripción detallada del procedimiento de ovariectomía bilateral para establecer un modelo de osteosarcopenia en ratas. La Figura 3 muestra una disminución en el coeficiente de peso húmedo del músculo cuádriceps en el grupo OVX en comparación con el grupo simulado. Aunque no hubo varianza estadísticamente significativa en la DMO entre los dos grupos 4 semanas después de la cirugía, la DMO en el grupo OVX fue significativamente menor que la del grupo operado simuladamente a las 8 y 12 semanas después de la cirugía.

En la Figura 4, se observa una atrofia significativa del músculo tríceps braquial en el grupo OVX, con un espacio de fibras musculares más amplio en comparación con el grupo simulado a las 12 semanas después del modelado. La Figura 5 demuestra que a las 4 semanas después de la cirugía, la densidad trabecular de la cabeza femoral en los grupos de OVX y cirugía simulada fue similar, mostrando una disposición regular y densa con buena conectividad. Sin embargo, a las 8 semanas después de la cirugía, las trabéculas en el grupo OVX comenzaron a disminuir en número, disponiéndose escasamente con un aumento del área de la cavidad de la médula ósea. La cantidad de adipocitos en la cavidad de la médula ósea fue mayor que en el grupo simulado. En el postoperatorio de 12 semanas, las trabéculas en el OVX mostraron una marcada reducción, mostrando interconexiones incompletas, una expansión notable en el área de la cavidad de la médula ósea y un recuento de adipocitos significativamente elevado en comparación con el grupo simulado.

Figura 1: Instrumental quirúrgico. (A) Portaagujas recto. (B) Tijeras rectas de mayonesa. (C) Bandeja desechable para cambiar medicamentos. (D) Bola de algodón estéril (E) Jeringas. f) Yodo. (G) Aguja de sutura. (H) Línea de sutura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Establecimiento del modelo OVX. (A) Depilación. (B) Se realizó una abertura quirúrgica de 1 cm de largo desde la piel hasta la capa subcutánea. (C) Ligadura que implica la extirpación de los ovarios y una parte de las trompas de Falopio. D) Herida cerrada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Peso muscular/corporal del cuádriceps y densidad mineral ósea. (A) Coeficiente de peso húmedo de los músculos cuádriceps. (B) Densidad mineral ósea (en comparación con el grupo simulado, * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Tinción HE de secciones de tejido de las fibras musculares del músculo tríceps de la pantorrilla. (A) Morfología muscular 4 semanas después del procedimiento de modelado en el grupo simulado. (B) Morfología muscular 8 semanas después del procedimiento de modelado en el grupo simulado. (C) Morfología muscular 12 siguiendo el procedimiento de modelado en el grupo simulado. (D) Morfología muscular 4 semanas después del modelado en el grupo OVX. (E) Morfología muscular 8 semanas después del modelado en el grupo OVX. (F) Morfología muscular 12 semanas después del modelado en el grupo OVX. Barras de escala: 1000 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Tinción HE de secciones de tejido de la cabeza femoral. (A) Morfología femoral 4 semanas después del modelado en el grupo simulado. (B) Morfología femoral 8 semanas después del modelado en el grupo simulado. (C) Femoral 12 semanas después de modelar en el grupo simulado. (D) Morfología femoral 4 semanas después del modelado en el grupo OVX. (E) Morfología femoral 8 semanas después del modelado en el grupo OVX. (F) Morfología femoral 12 semanas después del modelado en el grupo OVX. Barras de escala: 1000 μm. (G) Área de adiposidad cuantificada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El modelo animal ovariectomizado bilateral es fundamental para dilucidar los mecanismos subyacentes a la osteosarcopenia y evaluar posibles intervenciones terapéuticas. La osteoporosis inducida por la ovariectomía en ratas, que refleja la disminución abrupta de los niveles de estrógeno observada en las mujeres posmenopáusicas, se emplea comúnmente como modelo para la investigación de la osteoporosis. Además, la investigación ha puesto de manifiesto una asociación significativa entre la osteoporosis y la sarcopenia en las personas mayores, con la frecuente pérdida simultánea de músculo y hueso. En consecuencia, numerosos estudios han utilizado este modelo para investigar la sarcopenia^28,29. Como resultado, el presente estudio establece con éxito un modelo animal de osteosarcopenia.

Hay que tener en cuenta varios factores importantes a la hora de establecer un modelo fiable. Un modelo animal adecuado debe caracterizarse por su conveniencia, pertinencia y especificidad³⁰. Las ratas SD son los animales más utilizados en el modelado de la osteoporosis. Después de la extirpación de los ovarios, este mecanismo de transformación que ocurre en los huesos de las ratas se asemeja mucho al proceso de pérdida ósea posmenopáusica observado en los seres humanos^31,32. Las investigaciones indican que las ratas de entre 11 y 36 semanas de edad son óptimas para replicar los modelos de osteoporosis o sarcopenia 33,34,35,36. En cuanto al género, la prevalencia de osteosarcopenia entre las mujeres fue mayor con un 28% que entre los hombres con un 14%²¹; Por lo tanto, seleccionamos ratas hembras. Las ratas alcanzan la madurez sexual alrededor de las 6 semanas de edad de³⁷ años, por lo que seleccionamos ratas de 12 semanas de edad. Un estudio de investigación encontró que los volúmenes de los músculos cuádriceps se redujeron significativamente en los adultos mayores en comparación con los individuos más jóvenes, lo que sugiere que el envejecimiento tiene un impacto más perjudicial en el volumen³⁸ del cuádriceps. La osteoporosis utiliza la densidad mineral ósea femoral como el estándar de oro³². Por lo tanto, seleccionamos el músculo cuádriceps y el hueso femoral.

La consistencia en la técnica quirúrgica es crucial, y se recomienda que el mismo individuo realice todos los procedimientos para garantizar la uniformidad en la localización y el tamaño de la incisión. Todo el procedimiento consta de varios pasos cruciales. En primer lugar, la inyección intraperitoneal de anestésico debe evitar perforar los órganos internos. Antes de la administración del fármaco, es esencial aspirar para asegurarse de que la aguja no ha entrado en un vaso sanguíneo, para empujar el émbolo de la jeringa con precisión y para mantener la estabilidad y la velocidad durante todo el proceso. En segundo lugar, identificar el ovario rápidamente después de cortar el peritoneo puede ser un desafío, lo que requiere una comprensión integral de la anatomía de la rata por parte del operador. Una vez localizado el ovario, la ligadura y extirpación de parte del oviducto y del ovario es un paso vital para la supervivencia postoperatoria de la rata. Debido al tejido adiposo blando cerca del ovario, la sutura puede aflojarse fácilmente después de atarse, lo que provoca sangrado y potencialmente la muerte después de la cirugía. Por último, antes de la sutura, se recomienda la aplicación de penicilina en el sitio quirúrgico, con administración intramuscular adicional 3 días después de la cirugía como medida preventiva contra la infección.

Como resultado de los procedimientos quirúrgicos y la administración de anestesia, las ratas pueden experimentar un dolor intenso o incluso la muerte, lo que requiere su colocación en un entorno cálido, higiénico y bien ventilado hasta que recuperen la conciencia. El monitoreo vigilante es imperativo durante la semana postoperatoria inicial, con atención a la actividad conductual de las ratas durante todo el estudio.

Los beneficios de este modelo incluyen su naturaleza fácil de usar, capacidades de modelado eficientes, rentabilidad y capacidad para imitar el desarrollo natural de la osteoporosis y la pérdida muscular. No obstante, existen ciertas limitaciones asociadas con este modelo, como la rápida disminución de los niveles de estrógeno después de la cirugía de extirpación ovárica, ya que el estrógeno no se reconoce como un contribuyente directo a la sarcopenia. El presente experimento se llevó a cabo en ratas hembras y no involucró ratas macho. A pesar de estas limitaciones, el modelo animal de ovariectomía bilateral se ha convertido en un recurso valioso para investigar la SG y explorar vías para el avance de la enfermedad.

Cada autor declara que no tiene intereses financieros contrapuestos.

Este trabajo cuenta con el apoyo de subvenciones de (1) National Nature Science Foundation (82305275). (2) Programa de la Fundación Provincial de Ciencias Naturales de Liaoning (2022-YGJC-80 y 2022-YGJC-79). (3) Proyecto de construcción de la disciplina clave de la medicina china de alto nivel de la Administración Nacional de MTC (zyyzdxk-2023040).