La nostra ricerca si concentra sull'applicazione della spettrometria di massa cromatografica nel campo degli acidi nucleici, delle proteine peptidiche e della CDT. La sfida di questo esperimento risiede nella separazione di più componenti delle LNP e nella determinazione di componenti con concentrazioni diverse significative e problemi residui. Il vantaggio di questo protocollo è che consente di ottenere una buona separazione, un ampio intervallo lineare e una determinazione della corrente di LNP a basso costo.
Per iniziare, è necessario configurare un sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni, o HPLC, abbinato a un rivelatore a diffusione della luce evaporativa. Installare la colonna cromatografica seguendo la direzione della freccia sulla colonna. Collegare un'estremità all'uscita dell'autocampionatore e l'altra all'ingresso del rivelatore di diffusione della luce evaporativa.
Per preparare la fase A, misurare e trasferire con precisione 1.387 microlitri di trietilammina e scioglierla in 1000 millilitri di acqua. Mescolare bene e regolare il pH a sette usando l'acido acetico. Per preparare la Fase B, sciogliere 1.387 microlitri di trietilammina in 1000 millilitri di metanolo.
Mescolare accuratamente e regolare il pH a sette con acido acetico. Posizionare la fase A e la fase B nella teglia. Avvia il software LabSolutions e apri la finestra di analisi in tempo reale.
Fare clic su File e selezionare Nuovo per creare un nuovo file di metodo, modificare il tempo di arresto della cromatografia liquida a 15 minuti e fare clic su Applica a tutto il tempo di acquisizione. Quindi fare clic su Pompa e modificare i parametri della pompa. Selezionare la modalità di analisi come gradiente binario ad alta pressione, o BGE, e impostare la portata su un millilitro al minuto.
Impostare la concentrazione iniziale della pompa B all'80%Modificare il gradiente di fase mobile a tre minuti all'80%a quattro minuti all'85%da 5,5 a 12 minuti al 100% e a 12,1 minuti, lasciare che la pompa torni all'80%Ora fare clic su Colonna Forno e impostare la temperatura del forno a 55 gradi Celsius. Quindi fare clic su ELSD per modificare la temperatura del tubo di deriva a 40 gradi Celsius e salvare il metodo. Cliccare su Download e avvia per avviare ed equilibrare lo strumento.
Pesare con precisione 10 milligrammi di ciascuna delle quattro sostanze standard dei componenti delle nanoparticelle lipidiche separatamente. Sciogliere ciascuno in un millilitro di metanolo e vorticare fino a completa dissoluzione per ottenere soluzioni madre con una concentrazione di 10 milligrammi per millilitro per ciascun componente. Utilizzando una pipetta, trasferire accuratamente 100 microlitri di ciascuna soluzione madre in una fiala di campione.
Aggiungere 600 microlitri di metanolo e mescolare accuratamente per preparare una soluzione intermedia miscelata, con una concentrazione di 1000 microgrammi per millilitro. Ora, trasferire accuratamente 20 microlitri di ciascuna soluzione madre in una fiala di campione. Aggiungere 920 microlitri di metanolo e mescolare accuratamente per preparare una soluzione intermedia miscelata due con una concentrazione di 200 microgrammi per millilitro.
Preparare una serie di soluzioni standard a diverse concentrazioni mediante diluizione seriale. Quindi, utilizzando una pipetta, trasferire accuratamente 100 microlitri di campione in una fiala per campioni. Quindi aggiungere 900 microlitri di metanolo e mescolare bene per garantire una diluizione decuplicata delle nanoparticelle lipidiche e la loro dissociazione dal farmaco dell'acido nucleico.
Inserire le soluzioni standard e le soluzioni campione nell'autocampionatore del cromatografo liquido. Fare clic su batch in tempo reale nella barra degli strumenti dell'assistente della finestra di analisi in tempo reale. Quindi, fare clic su Nuovo nel menu File per creare una nuova tabella batch.
Nella tabella dei lotti, inserire il numero della fiala, il nome del vassoio, il file di dati e il volume di iniezione delle soluzioni standard e campione. Seleziona il file del metodo salvato e fai clic su Salva file batch nel menu File. Attendere che la pressione del cromatografo liquido e la linea di base del cromatogramma siano stabili.
Quindi fare clic su avvia batch in tempo reale nella barra degli strumenti dell'assistente per avviare l'acquisizione dei dati. Per l'analisi dei dati, aprire la finestra del browser del software LabSolutions. Trascinare i dati della soluzione standard nella vista dei risultati quantitativi per stabilire una curva di calibrazione.
Modificare i parametri di elaborazione dei dati facendo clic su Modifica nella vista del metodo. Nella finestra dei parametri di integrazione, modificare l'algoritmo di integrazione in I-PeakFinder e impostare il tipo di linea di base su Base a Base. Quindi, nei parametri di identificazione, modificare il metodo di identificazione in banda e impostare la larghezza di banda predefinita su 0,1 minuti.
Per modificare i parametri quantitativi, cambiare il metodo quantitativo in standard esterno. Impostare il numero di livelli di calibrazione su sette. Quindi selezionare il tipo di curva di calibrazione in modo esponenziale e modificare le impostazioni del composto.
Inserire i nomi e le concentrazioni di soluzione standard dei quattro componenti delle nanoparticelle lipidiche. Fare doppio clic sull'apice del picco per aggiornare i tempi di conservazione. Fare clic su Visualizza per completare la modifica dei parametri di elaborazione dei dati.
A questo punto, modificare il tipo di campione nella visualizzazione dei risultati quantitativi in punto di calcolo standard. Impostare i livelli della soluzione standard da uno a sette in base alle concentrazioni. Una volta stabilite le curve di calibrazione, fare clic su File nella barra dei menu e salvare il file del metodo.
Trascinare i dati di esempio nella visualizzazione dei risultati quantitativi della finestra del browser. Osservare i risultati della concentrazione visualizzati dei quattro componenti delle nanoparticelle lipidiche nei campioni. L'analisi della soluzione standard LNP ha raggiunto la separazione basale con un grado di separazione superiore a 1,5 per i quattro componenti e non sono stati osservati residui in soluzioni standard ad alta concentrazione.
La curva di calibrazione per i quattro componenti ha mostrato coefficienti di correlazione superiori a 0,999 nell'intervallo di concentrazione da cinque a 250 microgrammi per millilitro, indicando un'eccellente linearità. Il metodo ha mostrato un'elevata riproducibilità, con una deviazione standard relativa per un tempo di ritenzione inferiore allo 0,1% e una deviazione standard relativa per l'area del picco inferiore al 2% sulla base di sei iniezioni ripetute di 10 microgrammi per millilitro di soluzione standard. L'analisi dei campioni di LNP diluiti 10 volte con metanolo ha mostrato concentrazioni di componenti che vanno da 150 microgrammi per millilitro a 1.500 microgrammi per millilitro, ottenendo una separazione e una sensibilità costantemente elevate in più produttori.
