Nossa pesquisa se concentra na aplicação da espectrometria de massa por cromatografia no campo de ácidos nucléicos, proteínas peptídicas e CDT. O desafio deste experimento está na separação de múltiplos componentes de LNPs e na determinação de componentes com diferentes concentrações significativas e problemas residuais. A vantagem deste protocolo é que ele alcança uma boa separação, uma ampla faixa linear e uma determinação de corrente de LNPs a um baixo custo.
Para começar, configure uma cromatografia líquida de alta eficiência, ou sistema HPLC, acoplado a um detector de espalhamento de luz evaporativo. Instale a coluna cromatográfica seguindo a direção da seta na coluna. Conecte uma extremidade à saída do amostrador automático e a outra à entrada do detector de espalhamento de luz evaporativa.
Para preparar a fase A, meça e transfira com precisão 1.387 microlitros de trietilamina e dissolva-a em 1000 mililitros de água. Misture bem e ajuste o pH para sete usando ácido acético. Para preparar a Fase B, dissolva 1.387 microlitros de trietilamina em 1000 mililitros de metanol.
Misture bem e ajuste o pH para sete com ácido acético. Coloque a fase A e a fase B na bandeja. Inicie o software LabSolutions e abra a janela de análise em tempo real.
Clique em Arquivo e selecione Novo para criar um novo arquivo de método, modifique o tempo de parada da cromatografia líquida para 15 minutos e clique em Aplicar a todo o tempo de aquisição. Em seguida, clique em Bomba e modifique os parâmetros da bomba. Selecione o modo de análise como gradiente binário de alta pressão, ou BGE, e defina a vazão para um mililitro por minuto.
Defina a concentração inicial da bomba B para 80%Modifique o gradiente de fase móvel em três minutos para 80%em quatro minutos para 85%de 5.5 a 12 minutos em 100%e em 12.1 minutos, deixe a bomba retornar a 80%Agora clique em Forno de Coluna e defina a temperatura do forno para 55 graus Celsius. Em seguida, clique em ELSD para modificar a temperatura do tubo de deriva para 40 graus Celsius e salve o método. Clique em Download e inicie para iniciar e equilibrar o instrumento.
Pesar com precisão 10 miligramas de cada uma das quatro substâncias padrão componentes de nanopartículas lipídicas separadamente. Dissolver cada um em um mililitro de metanol e vórtice até dissolver completamente para obter soluções de estoque com uma concentração de 10 miligramas por mililitro para cada componente. Usando uma pipeta, transfira com precisão 100 microlitros de cada solução estoque para um frasco de amostra.
Adicione 600 microlitros de metanol e misture bem para preparar uma solução intermediária mista com uma concentração de 1000 microgramas por mililitro. Agora, transfira com precisão 20 microlitros de cada solução estoque para um frasco de amostra. Adicione 920 microlitros de metanol e misture bem para preparar uma solução intermediária mista dois com uma concentração de 200 microgramas por mililitro.
Preparar uma série de soluções-padrão em diferentes concentrações por diluição em série. Em seguida, usando uma pipeta, transfira com precisão 100 microlitros da amostra para um frasco de amostra. Em seguida, adicione 900 microlitros de metanol e misture bem para garantir uma diluição de dez vezes das nanopartículas lipídicas e sua dissociação do medicamento de ácido nucleico.
Colocar as soluções-padrão e as soluções de amostra no amostrador automático do cromatógrafo líquido. Clique em lote em tempo real na barra de ferramentas do assistente da janela de análise em tempo real. Em seguida, clique em Novo no menu Arquivo para criar uma nova tabela de lotes.
Na tabela de lotes, insira o número do frasco, o nome da bandeja, o arquivo de dados e o volume de injeção das soluções padrão e de amostra. Selecione o arquivo de método salvo e clique em salvar arquivo em lote no menu Arquivo. Aguarde até que a pressão do cromatógrafo líquido e a linha de base do cromatograma estejam estáveis.
Em seguida, clique em iniciar lote em tempo real na barra de ferramentas do assistente para iniciar a aquisição de dados. Para análise de dados, abra a janela do navegador do software LabSolutions. Arraste os dados da solução padrão para a visualização de resultados quantitativos para estabelecer uma curva de calibração.
Modifique os parâmetros de processamento de dados clicando em Editar na visualização do método. Na janela de parâmetros de integração, altere o algoritmo de integração para I-PeakFinder e defina o tipo de linha de base para Base para Base. Em seguida, nos parâmetros de identificação, altere o método de identificação para banda e defina a largura de banda padrão para 0,1 minutos.
Para modificar os parâmetros quantitativos, altere o método quantitativo para padrão externo. Defina o número de níveis de calibração para sete. Em seguida, selecione o tipo de curva de calibração como exponencialmente e modifique as configurações do composto.
Insira os nomes e as concentrações da solução padrão dos quatro componentes das nanopartículas lipídicas. Clique duas vezes no ápice de pico para atualizar os tempos de retenção. Clique em Exibir para concluir a modificação dos parâmetros de processamento de dados.
Agora, modifique o tipo de amostra na exibição de resultados quantitativos para o ponto de cálculo padrão. Definir os níveis da solução-padrão de um a sete em função das concentrações. Depois que as curvas de calibração forem estabelecidas, clique em Arquivo na barra de menus e Salve o arquivo do método.
Arraste os dados de amostra para a exibição de resultados quantitativos da janela do navegador. Observe os resultados de concentração exibidos dos quatro componentes de nanopartículas lipídicas nas amostras. A análise da solução padrão LNP alcançou a separação da linha de base com um grau de separação maior que 1,5 para os quatro componentes, e nenhum resíduo foi observado em soluções padrão de alta concentração.
A curva de calibração para os quatro componentes exibiu coeficientes de correlação superiores a 0,999 dentro da faixa de concentração de cinco a 250 microgramas por mililitro, indicando excelente linearidade. O método apresentou alta reprodutibilidade, com um desvio-padrão relativo para um tempo de retenção inferior a 0,1% e um desvio-padrão relativo para a área do pico inferior a 2% com base em seis injeções repetidas de 10 microgramas por mililitro de solução-padrão. A análise de amostras reais de LNP diluídas 10 vezes com metanol mostrou concentrações de componentes variando de 150 microgramas por mililitro a 1.500 microgramas por mililitro, alcançando separação e sensibilidade consistentemente altas em vários fabricantes.
