Questo protocollo fornisce un metodo accurato e riproducibile per quantificare dieci diverse classi lipidiche di Saccharomyces cerevisiae utilizzando un unico metodo di estrazione e un singolo metodo LC-MS. Questo metodo consente il rilevamento e la quantificazione di specie lipidiche isobariche e isomeriche aventi diverse proprietà chimiche e fisiche. Per la coltura di Saccharomyces cerevisiae, aggiungere prima 5 ml di soluzione sterile di 20% di glucosio a ciascuno dei due contenitori Erlenmeyer contenenti mezzo YNB sterile a una concentrazione finale del 2% di glucosio.
Quindi, utilizzare una pipetta sterile per trasferire un volume di una coltura di lievito durante la notte contenente cinque per dieci alla settima parte del lievito in ogni pallone e colturare i contenitori per almeno 24 ore a 30 gradi Celsius con scuotimento rotazionale a 200 giri al minuto. Per l'estrazione lipidica, determinare il numero totale di cellule di lievito per millilitro di coltura e trasferire cinque volte dieci alla settima cellule in un tubo di centrifuga da 15 ml. Aggiungere acqua nano-pura ghiacciata per portare il volume totale fino a 15 ml e raccogliere le cellule per centrifugazione.
Sospendere il pellet di lievito in 15 ml di tampone di bicarbonato di ammonio isotonico freddo ghiaccio per una seconda centrifugazione e sospendere il pellet in 1,5 ml di soluzione di bicarbonato di ammonio freddo ghiaccio fresco. Al termine della centrifugazione, conservare il pellet a 80 gradi celsius fino all'estrazione. Per iniziare l'estrazione lipidica, scongelare il pellet cellulare sul ghiaccio prima di sospendere di nuovo le cellule in 200 microlitri di acqua nano-pura ghiacciata.
In una cappa aspirante, trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga superiore da 15 ml, ad alta resistenza, con cappuccio rivestito in politetrafluoroetilene e aggiungere 25 microlitri di una miscela interna di standard lipidici, preparati in metanolo cloroformio 2:1. 100 microlitri da 425 a 600 perline di vetro lavato con acido micromolare e 600 microlitri di un metanolo cloroformio 17:1 al tubo. Vortice il tubo ad alta velocità per cinque minuti a temperatura ambiente per interrompere le cellule.
Seguito da vortice per un'ora a bassa velocità a temperatura ambiente per facilitare l'estrazione lipidica. Al termine dell'estrazione, incubare il campione per 15 minuti sul ghiaccio, per favorire la precipitazione proteica e la separazione delle fasi acquose e organiche. Al termine dell'incubazione, centrifugare il campione per separare ulteriormente la fase acquosa superiore dalla fase organica inferiore e, nella cappa dei fumi, utilizzare una pipetta di vetro borosilicato per trasferire la fase organica inferiore in un nuovo tubo di centrifuga superiore a vite in vetro ad alta resistenza da 15 ml con cappuccio rivestito in polietilene.
Posizionare la fase organica inferiore sotto il flusso di gas azoto e, nella cappa dei fumi, aggiungere 300 microlitri di una miscela di metanolo cloroformio 2:1 alla fase acquosa superiore rimanente. Per facilitare il fosfatidipide, la fosfatidilserina, il fosfatidilinositolo e il vortice di estrazione cardio-lipidico il tubo vigorosamente per cinque minuti a temperatura ambiente prima di centrifugare il campione. Utilizzare una pipetta di vetro borosilicata per trasferire la fase organica inferiore nella fase organica inferiore sotto azoto ed evaporare il solvente nelle fasi organiche combinate nella cappa dei fumi.
Quindi, chiudere i tubi del film lipidico sotto il flusso di gas azoto e conservare i campioni a 80 gradi Celsius. Per la cromatografia liquida, separazione dei lipidi estratti a 500 microlitri di una miscela di acqua nano-pura aceto-nitrile-2-propanolo 63:35:5 al tubo di pellicola lipidica e vortice tre volte per dieci secondi per vortice a temperatura ambiente. Sottoseti il contenuto del tubo alla sonicazione ad ultrasuoni per 15 minuti prima di vortice del tubo tre volte per dieci secondi per vortice, come appena dimostrato.
Trasferire 100 microlitri del campione in una fiala di vetro con un inserto utilizzato per una piastra da 24 pozza ed eliminare eventuali bolle all'interno dell'inserto. Posizionare l'inserto in un unico pozzo di una piastra a 24 porsi e caricare una CSH a colonna C18 in fase inversa accoppiata a una pre-colonna nel sistema di cromatografia liquida. Impostare la temperatura della colonna su 55 gradi celsius e il flusso su 300 microlitri al minuto.
Una volta impostati tutti i parametri, caricare dieci microlitri di un vuoto di estrazione prima di caricare il primo campione. Quindi, separare le diverse specie lipidiche utilizzando il gradiente di cromatografia liquida, come indicato. Verrà generato un cromatogramma ionico totale rappresentativo dai dati LC-MS per i lipidi estratti dalle cellule.
Per l'analisi spettrometrica di massa dei lipidi estratti, caricare i campioni su uno spettrometro di massa dotato di una sorgente ionica di ionizzazione elettro-spray riscaldata e impostare i parametri di analisi come delineato nella tabella. Utilizzare l'analizzatore di trasformazioni Di Fourier per rilevare ioni padre MS-1 con una risoluzione di 60.000 e nell'intervallo di massa di 150-2000 dalton. Quindi, rilevare gli ioni secondari MS-2 utilizzando le impostazioni come indicato nella tabella.
Per identificare e quantificare diversi lipidi da file LC-MS tandem di ampio livello, cercare file grezzi LC-MS contenenti dati MS-1 a scansione completa e dati MS-2 dipendenti dai dati per acidi grassi liberi e non sterizzati, cardio-lipidi, fitocerimide, fitosphyngocene, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolammina, fosfatidilglicerolo, fosfatidilinositolo, fosfatildlserina e triacilgilcerolo classi lipidiche utilizzando una massa divisa per tolleranza di carica di cinque parti per milione per gli ioni precursori e dieci parti per milione per gli ioni prodotto. Quindi, seguire le istruzioni fornite nel manuale d'uso del software per identificare gli standard lipidici interni e le specie lipidiche con composizioni di acidi grassi insolite. Questo delicato metodo tandem LC-MS consente l'identificazione e la quantificazione di specie molecolari di lipidi a concentrazioni fino a 0,165 picomolare per microlitro.
Questo limite di quantificazione differisce dalle diverse classi lipidiche all'interno di un'ampia gamma di concentrazioni. Questo metodo può essere utilizzato per aumentare l'efficienza della ionizzazione per i lipidi utilizzando additivi di fase mobili alternativi per la spettrometria di massa di ionizzazione elettrospray. Ognuno di questi additivi alternativi per fasi mobili può essere utilizzato sia per le colonne LC di fase normale che in fase inversa.
Il metodo di dissociazione indotto dalla collisione è utile se utilizzato in combinazione con l'additivo di fase mobile acetato di ammonio per il modo negativo di ionizzazione elettro-spray della spettrometria di massa, in quanto, in queste condizioni, consente l'aumento dell'efficienza della frammentazione ionica lipidica MS-1 nei prodotti MS-2. Al contrario, il metodo di dissociazione collisionale ad alta energia è favorevole se utilizzato in combinazione con l'additivo di fase mobile in formato ammonio per il modo positivo di ionizzazione elettro-spray della spettrometria di massa come in queste condizioni, consente un aumento dell'efficienza della frammentazione ionica lipidica MS-1 nei prodotti MS-2. Non mescolare le fasi durante la raccolta della fase organica.
Chiudere i tubi sotto il flusso di gas azoto. Eliminare qualsiasi bolla all'interno dell'inserto e collegare la colonna nella direzione corretta. Se l'identità di un picco non può essere determinata da LC-MS, MS-NMR può essere usato per dedurre la struttura di quella molecola.
