Araştırmamız, nükleik asit, peptit proteini ve CDT alanında kromatografi kütle spektrometresinin uygulanmasına odaklanmaktadır. Bu deneyin zorluğu, LNP'lerin birden fazla bileşeninin ayrılmasında ve önemli ölçüde farklı konsantrasyonlara ve kalıntı sorunlarına sahip bileşenlerin belirlenmesinde yatmaktadır. Bu protokolün avantajı, iyi bir ayırma, geniş bir doğrusal aralık ve düşük bir maliyetle LNP'lerin mevcut bir şekilde belirlenmesini sağlamasıdır.
Başlamak için, evaporatif ışık saçılma detektörü ile birleştirilmiş yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi veya HPLC sistemi kurun. Kromatografik sütunu, sütun üzerindeki ok yönünü takip ederek takın. Bir ucunu otomatik örnekleyici çıkışına, diğer ucunu da evaporatif ışık saçılma dedektörü girişine bağlayın.
Faz A'yı hazırlamak için, 1.387 mikrolitre trietilamini doğru bir şekilde ölçün ve aktarın ve 1000 mililitre suda çözün. İyice karıştırın ve asetik asit kullanarak pH'ı yediye ayarlayın. Faz B'yi hazırlamak için, 1.387 mikrolitre trietilamini 1000 mililitre metanol içinde çözün.
İyice karıştırın ve pH'ı asetik asitle yediye ayarlayın. Faz A ve faz B'yi tepsiye yerleştirin. LabSolutions yazılımını başlatın ve gerçek zamanlı analiz penceresini açın.
Yeni bir yöntem dosyası oluşturmak için Dosya'ya tıklayın ve Yeni'yi seçin, sıvı kromatografisi durma süresini 15 dakika olarak değiştirin ve Tüm alım süresine uygula'ya tıklayın. Ardından Pompa'ya tıklayın ve pompa parametrelerini değiştirin. Analiz modunu ikili yüksek basınç gradyanı veya BGE olarak seçin ve akış hızını dakikada bir mililitre olarak ayarlayın.
İlk pompa B konsantrasyonunu %80'e ayarlayın Mobil faz gradyanını üç dakikada %80'e dört dakikada %85'e %100'de 5,5 ila 12 dakika arasında değiştirin ve 12,1 dakikada pompanın %80'e döndürülmesine izin verin Şimdi Sütunlu Fırına tıklayın ve fırın sıcaklığını 55 santigrat dereceye ayarlayın. Ardından, sürüklenme tüpü sıcaklığını 40 santigrat dereceye değiştirmek ve yöntemi kaydetmek için ELSD'ye tıklayın. Enstrümanı başlatmak ve dengelemek için İndir ve başlat'a tıklayın.
Dört lipid nanopartikül bileşenli standart maddenin her birinin 10 miligramını ayrı ayrı hassas bir şekilde tartın. Her birini bir mililitre metanol içinde çözün ve her bileşen için mililitre başına 10 miligram konsantrasyonda stok çözeltileri elde etmek için tamamen çözünene kadar girdap yapın. Bir pipet kullanarak, her bir stok çözeltisinden 100 mikrolitreyi bir numune şişesine doğru bir şekilde aktarın.
600 mikrolitre metanol ekleyin ve mililitre başına 1000 mikrogram konsantrasyonda karışık bir ara çözelti hazırlamak için iyice karıştırın. Şimdi, her bir stok çözeltisinden 20 mikrolitreyi bir numune şişesine doğru bir şekilde aktarın. 920 mikrolitre metanol ekleyin ve mililitre başına 200 mikrogram konsantrasyonda karışık bir ara çözelti hazırlamak için iyice karıştırın.
Seri seyreltme ile farklı konsantrasyonlarda bir dizi standart çözelti hazırlayın. Daha sonra, bir pipet kullanarak, numunenin 100 mikrolitresini bir numune şişesine doğru bir şekilde aktarın. Daha sonra 900 mikrolitre metanol ekleyin ve lipid nanopartiküllerinin on kat seyreltilmesini ve bunların nükleik asit ilacından ayrılmasını sağlamak için iyice karıştırın.
Standart çözeltileri ve numune çözeltilerini sıvı kromatografın otomatik numune alma cihazına yerleştirin. Gerçek zamanlı analiz penceresinin asistan araç çubuğunda gerçek zamanlı toplu iş'e tıklayın. Ardından, yeni bir toplu iş tablosu oluşturmak için Dosya menüsünde Yeni'ye tıklayın.
Toplu iş tablosuna flakon numarasını, tepsi adını, veri dosyasını ve standart ve numune çözeltilerinin enjeksiyon hacmini girin. Kaydedilen yöntem dosyasını seçin ve Dosya menüsünde toplu iş dosyasını kaydet'e tıklayın. Sıvı kromatograf basıncı ve kromatogramın taban çizgisi stabil olana kadar bekleyin.
Ardından, veri toplamayı başlatmak için asistan araç çubuğunda gerçek zamanlı toplu iş başlat'a tıklayın. Veri analizi için LabSolutions yazılımının tarayıcı penceresini açınız. Bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için standart çözelti verilerini nicel sonuçlar görünümüne sürükleyin.
Yöntem görünümünde Düzenle'ye tıklayarak veri işleme parametrelerini değiştirin. Tümleştirme parametreleri penceresinde, tümleştirme algoritmasını I-PeakFinder olarak değiştirin ve temel türünü Base to Base olarak ayarlayın. Ardından, tanımlama parametrelerinde tanımlama yöntemini bant olarak değiştirin ve varsayılan bant genişliğini 0,1 dakika olarak ayarlayın.
Kantitatif parametreleri değiştirmek için, kantitatif yöntemi harici standart olarak değiştirin. Kalibrasyon seviyelerinin sayısını yedi olarak ayarlayın. Ardından kalibrasyon eğrisi türünü üstel olarak seçin ve bileşik ayarlarını değiştirin.
Dört lipid nanopartikül bileşeninin adlarını ve standart çözelti konsantrasyonlarını girin. Tutma sürelerini güncellemek için tepe noktasına çift tıklayın. Veri işleme parametrelerinin değiştirilmesini tamamlamak için Görüntüle'ye tıklayın.
Şimdi, nicel sonuçlar görünümündeki örnek türünü standart hesaplama noktasına değiştirin. Konsantrasyonlara göre standart çözeltinin seviyelerini bir ila yedi arasında ayarlayın. Kalibrasyon eğrileri oluşturulduktan sonra, menü çubuğunda Dosya'ya tıklayın ve Yöntem dosyasını kaydedin.
Örnek verileri tarayıcı penceresinin nicel sonuçlar görünümüne sürükleyin. Numunelerdeki dört lipid nanopartikül bileşeninin görüntülenen konsantrasyon sonuçlarını gözlemleyin. LNP standart çözelti analizi, dört bileşen için 1.5'ten daha büyük bir ayırma derecesi ile temel ayırma elde etti ve yüksek konsantrasyonlu standart çözeltilerde hiçbir kalıntı gözlenmedi.
Dört bileşen için kalibrasyon eğrisi, mililitre başına beş ila 250 mikrogram konsantrasyon aralığında 0.999'u aşan korelasyon katsayıları sergiledi ve bu da mükemmel doğrusallığı gösterdi. Yöntem, mililitre standart çözelti başına 10 mikrogramlık altı tekrarlanan enjeksiyona dayanarak,% 0.1'den daha az bir tutma süresi için nispi bir standart sapma ve% 2'den daha az bir nispi standart sapma ile yüksek tekrarlanabilirlik gösterdi. Metanol ile 10 kez seyreltilmiş gerçek LNP numunelerinin analizi, mililitre başına 150 mikrogram ile mililitre başına 1.500 mikrogram arasında değişen bileşen konsantrasyonları gösterdi ve birden fazla üreticide sürekli olarak yüksek ayırma ve hassasiyet elde etti.
