La nostra ricerca sfrutta il modello del pesce zebra per studiare i disturbi del sangue umano, concentrandosi sull'identificazione di nuovi biomarcatori, bersagli terapeutici e trattamenti per condizioni come la leucemia. Utilizzando i vantaggi unici del pesce zebra, miriamo a esplorare i meccanismi molecolari alla base delle malattie ematologiche e a sviluppare strategie terapeutiche innovative per migliorare i risultati dei pazienti. L'iniezione endovenosa nel pesce zebra adulto è impegnativa a causa delle sue piccole dimensioni e della sua complessa vascolarizzazione.
Abbiamo sviluppato un metodo di iniezione endovenosa ottimizzato per la somministrazione precisa ed efficiente di sostanze o cellule in zebrafish adulti. Rispetto all'iniezione intracardiaca e retro-orbitale, il metodo IV che presentiamo qui ha portato a una migliore sopravvivenza dei pesci e a un migliore attecchimento cellulare. Questo metodo rende il pesce zebra adulto più utilizzabile per studi non a termine.
Superando alcuni limiti dei nuovi modelli, la tecnica IV migliorata aumenta l'accuratezza dei modelli di malattia e degli screening farmacologici, contribuendo a far progredire nuove terapie. Per iniziare, posizionare il pesce zebra transgenico mpo:EGFP soppresso su un tavolo da dissezione. Sezionare il pesce zebra per isolare il midollo renale.
Quindi trasferire il midollo renale in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente un mezzo di sospensione cellulare. Pipettare la sospensione per disaggregare le cellule del midollo renale. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare in nylon da 40 micrometri.
Quindi centrifugare le celle a 500 G per otto minuti e scartare il surnatante, prima di risospendere il pellet in 500 microlitri di terreno di sospensione cellulare. Utilizzando un contatore di cellule automatizzato, contare le cellule con un'aliquota di 10 microlitri. Lavare accuratamente la siringa di Hamilton tre o quattro volte con etanolo al 75%.
Quindi sciacquare la siringa tre o quattro volte con acqua ultrapura per assicurarsi che tutti i residui di etanolo vengano rimossi. Dopo aver somministrato l'anestesia al pesce zebra, confermare la profondità dell'anestesia diminuendo il movimento e perdendo le risposte riflesse. Posizionare il pesce con la parte dorsale rivolta verso l'alto con la testa orientata a sinistra su carta velina pulita e umida per stabilizzarla per l'iniezione.
Afferrare saldamente la siringa di Hamilton e inclinare l'ago a circa 45 gradi rispetto alla vena caudale. Per il pesce zebra Casper, mirare a una sezione visibile dell'imbarcazione attraverso il corpo traslucido. Inserire delicatamente l'ago nel recipiente e somministrare due microlitri di cellule di midollo renale intero isolate da pesce zebra transgenico mpo:EGFP.
Dopo l'iniezione, applicare una leggera pressione sul sito di iniezione con un batuffolo di cotone per 10 secondi per controllare il sanguinamento. Osservare il pesce zebra iniettato al microscopio per confermare i segnali GFP all'interno del vaso. Lasciare che il pesce zebra iniettato si riprenda in acqua di pesce appena sterilizzata per 10 minuti.
Quindi trasferire il pesce in una vasca statica. Il metodo dell'iniezione endovenosa ha prodotto il più alto tasso di successo con segnali GFP visibili in 41 pesci su 43. Mentre il metodo retro-orbitale ha rilevato la GFP solo in tre pesci su 37 e il metodo intracardiaco ha mostrato successo in 11 pesci su 40.
Il metodo dell'iniezione endovenosa ha portato a migliori tassi di sopravvivenza nei pesci iniettati, specialmente con dosi cellulari più elevate rispetto ai metodi retro-orbitali e intracardiaci. I segnali GFP sono stati rilevati già dal terzo giorno dopo il trapianto nei pesci iniettati per via endovenosa, mentre i metodi retro-orbitali e intracardiaci hanno mostrato un'insorgenza ritardata del segnale GFP. Entro il giorno 17, il pesce iniettato per via endovenosa ha mostrato i segnali GFP più importanti nel midollo renale.
La citometria a flusso del midollo renale ha mostrato circa il 18% di cellule positive alla GFP nei pesci iniettati per via endovenosa con tre volte 10 alla potenza di cinque cellule che si allineano con i livelli di GFP nel midollo renale del donatore. Al contrario, i metodi intracardiaci e retro-orbitali hanno mostrato rispettivamente il 5% e il 2% di cellule GFP positive.
