Questo metodo può rispondere a domande chiave sul fenotipo dei sottoinsiemi di celle T e B isolati patch peyer del mouse. In particolare, le popolazioni di cellule T follicolari e del centro germinale B. Il principale vantaggio di questa tecnica è che rinuncia a diversi laboriosi passaggi di preparazione come la digestione a base di collagenasi che compromettono la qualità e l'identità dei linfociti isolati.
Iniziare posizionando un topo in posizione supina e sterilizzando l'addome con il 70% di etanolo. Fare un'incisione addominale della linea mediana attraverso la pelle e il peritoneo dal pube alla gabbia toracica per aprire la cavità peritinale e localizzare il cieco e la giunzione ileocecale. Fare il più distale possibile tagliare alla giunzione per separare l'intestino tenue dal cieco.
Tagliare il mesentere con le forbici per rimuovere con cura l'intero intestino tenue fino allo sfintere pilorico. Tagliare la giunzione tra il piloro e il duodeno per staccare completamente l'intestino tenue dalla cavità addominale e posizionare l'intestino tenue isolato in un pozzo di una piastra a 6 po porsi contenente mezzo RPMI freddo integrato con siero bovino fetale al 10%, o FBS, sul ghiaccio. Quindi, agitare delicatamente i tessuti manualmente fino a quando tutti i segmenti non sono immersi nel mezzo freddo.
Quando tutto l'intestino è stato raccolto, utilizzare le forcep per afferrare il grasso mesenterico di un bordo dell'intestino e posizionare il campione, lato mesenterico verso il basso, su un tovagliolo di carta. Inumidire l'intero segmento intestinale con RPMI 10%FBS per evitare disidratazione e appiccicosa dei tessuti e individuare le chiazze del Peyer, che appaiono come aggregati multilobulati bianchi con una forma simile al cavolfiore sul lato anti-mesenterico della parete intestinale. Per raccogliere le patch del Peyer, usa forbici chirurgiche curve con la curva rivolta verso l'alto per asportare delicatamente ogni cerotto dai suoi bordi distale e prossimale, facendo attenzione ad escludere il tessuto intestinale circostante, e posiziona le chiazze del Peyer in singoli pozzi di una piastra da 12 pozzetti contenente RPMI ghiacciato 10% FBS sul ghiaccio man mano che vengono raccolti.
Una volta acquisite tutte le patch, utilizzare le forbici per tagliare la punta di una punta di micro pipetta da 1 millimetro in modo che il diametro sia abbastanza grande da aspirare le patch dei singoli Peyer e trasferire le patch del Peyer in tubi conici da 150 millimetri per mouse contenenti 25 millilitri di 37 gradi Celsius RPMI 10%FBS. Quindi posizionare il tubo in uno shaker orbitale a 37 gradi Celsius con agitazione continua a 125-150 giri/min per 10 minuti. Al termine dell'agitazione, trasferire le chiazze del Peyer su un filtro cellulare da 140 micrometri per mouse e utilizzare l'estremità in gomma di uno stantuffo per siringa da 10 millilitri per animale per interrompere delicatamente le chiazze del Peyer attraverso la rete in singoli tubi conici da 50 millilitri.
Risciacquare i filtri con 15-20 millilitri di RPMI freddo 10%FBS e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Dopo aver scartato attentamente il supernatante, resuspend le cellule a circa 1 per 10 fino alla 7 ° cellule per millilitro di concentrazione RPMI 10%FBS per il conteggio. Quindi trasferire 2-2,5 per 10 alla 6 ° celle per 200 microlitri di mezzo ad ogni pozzo di una piastra inferiore rotonda di 96 po 'e pelletare le cellule per centrifugazione.
Dopo aver scartato il supernatante con un leggero sfarfallio, la centrifuga lava le cellule in 200 microlitri di tampone in piedi. Etichettare le cellule in 100 microlitri di colorante di vitalità fissabile, diluiti in tampone privo di proteine per 30 minuti a 4 gradi Celsius, protetti dalla luce, seguiti da 2 lavaggi e tampone di colorazione fresco. Dopo aver scartato il supernatante, ha rimescolato i pellet in 20 microlitri di blocco FC per 15 minuti di incubazione a 4 gradi Celsius, seguito dall'aggiunta di 80 microlitri di cocktail di anticorpi superficiali primari di interesse, per 30 minuti sul ghiaccio, protetti dalla luce.
Al termine dell'incubazione dell'anticorpo superficiale, la centrifuga lava le cellule due volte in un volume in eccesso di tampone di colorazione e rimospende i pellet in 100 microlitri di soluzione di colorazione superficiale secondaria, integrata con streptavidina. Dopo 15 minuti su ghiaccio protetto dalla luce, la centrifuga lava le cellule 2 volte in tampone di colorazione fresco e risospende i pellet in 200 microlitri di fissazione, soluzione di lavoro permeablizzazione per un'incubazione non superiore a 20 minuti sul ghiaccio, protetta dalla luce. Al termine dell'incubazione, centrifugare immediatamente la piastra, seguita da una centrifuga era in 200 microlitri di tampone di permeablizzazione per pozzo.
Successivamente, rimospendare le cellule in 20 microlitri di blocco FC, diluiti in tampone di permeablizzazione come dimostrato, seguito dall'aggiunta di 80 microlitri del cocktail di anticorpi intracellulari di interesse, per 30 minuti a temperatura ambiente, protetti dalla luce. Lavare le celle con 100 microlitri di tampone di permeablizzazione, seguiti da un secondo lavaggio in 200 microlitri di tampone di permeablizzazione. Quindi, resostigliere i pellet in 200 microlitri di tampone di colorazione e trasferire le cellule negli appropriati tubi di analisi citometrica a flusso di 5 millilitri corrispondenti, in un volume finale di 400 microlitri di tampone di colorazione per tubo.
Le chiazze di Peyer non sono distribuite uniformemente in tutto l'intestino tenue, ma sono localizzate più densamente verso le estremità distali e prossimali del tessuto. Questo protocollo facilita l'isolamento della popolazione di linfociti patch di un Peyer che dimostra una distribuzione diffusa sul lato anteriore, simile a quella osservata per gli splenociti, con una vitalità cellulare superiore al 95%. Cd4 CD19 Le cellule double positive costituiscono circa l'1% della popolazione totale di linfociti cerotto di Peyer.
Questi esprimono alti livelli di CXCR5 e GL7, che, se non esclusi, possono portare a risultati falsi positivi nella ghiandolazione della cellula follicolare e germinale centrale B di T-helper, rispettivamente. Rispetto ad altri organi linfoidi secondari, le chiazze di Peyer mostrano un rapporto significativamente più elevato tra le cellule B centro germinali, ad un intervallo del 2-10% della popolazione totale di cellule B in condizioni di stato stazionario. Come le cellule B centro germinali, la frazione follicolare delle cellule T-helper varia anche nei singoli topi non immunizzati, con un intervallo del 10-20% del totale, la popolazione di linfociti T patch del PEYER positivo CD4.
La digestione enzimatica a base di collagenasi porta ad una massiccia riduzione dell'espressione cellulare follicolare di CXCR5 T-helper, lasciando inalterata l'espressione di altre molecole superficiali. Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada all'identificazione dei fattori cellulari chiave all'interno delle macchie del Peyer che sono coinvolti nell'immunità mucosa e omerale.
