Caratterizzare l'espressione genica a livello trascrittomico è la chiave per comprendere la funzione cellulare in salute e malattia. Il nostro metodo si concentra sulla cattura delle cellule endoteliali, lo strato cruciale della parete vascolare, dalle arterie menesteriche dei donatori umani per la profilazione trascrittomica con una risoluzione a singola cellula e spaziale. Esiste una popolazione arricchita di cellule endoteliali da un vaso senza una fase di smistamento, che può causare la perdita di cellule.
Inoltre, esistono altri tipi di cellule che consentono lo studio delle interazioni cellula-cellula nel contesto tissutale. Abbiamo usato questa tecnica per studiare i cambiamenti arteriosi nel diabete e nell'obesità. A seconda della disponibilità della nave, queste tecniche possono anche essere riproposte per esplorare la biologia in altre malattie vascolari e di altro tipo.
Se è la prima volta, due passaggi chiave richiedono la maggior parte della pratica. Uno, raschiando, anche se una forza adeguata dovrebbe essere esercitata per rimuovere le cellule integrali senza staccare gli strati più profondi. E due, il sezionamento criostato.
Assicurarsi che le sezioni siano fredde, piatte e rientrino nei confini della diapositiva specializzata. A dimostrare la procedura saranno Yingjun Luo e Xiaofang Tang, due ricercatori post-dottorato del mio laboratorio. Per iniziare a lavare il tessuto con DPBS.
Con pinze sterili e forbici di dissezione, rimuovere il grasso e i tessuti connettivi esterni fino a quando il vaso non è pulito. Misura la lunghezza della nave con un righello posto all'esterno del piatto e scatta registrazioni fotografiche. Tagliare l'arteria mesenterica longitudinalmente con le forbici per aprire verticalmente il lume del vaso.
Usando gli aghi, attaccare il vaso alla cera nera su tutti e quattro gli angoli, esponendo l'intima. Aggiungere un millilitro di tampone di digestione preriscaldato all'intima. Usando un bisturi sterile, raschiare delicatamente il lume della nave due volte.
Trasferire il tampone di digestione in un tubo. Aggiungere un millilitro di tampone di digestione all'intima e pipettare su e giù con attenzione per raccogliere le cellule rimanenti e trasferire la sospensione cellulare in un tubo. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per cinque minuti in un'incubatrice o su un bilanciere.
Aggiungere il mezzo M199 alla sospensione cellulare per spegnere la reazione enzimatica e mescolare delicatamente. Centrifugare la sospensione per cinque minuti a quattro gradi Celsius e 600 volte G.At fine della centrifugazione, rimuovere e conservare il surnatante separatamente come coltura di controllo per osservare se tutte le cellule vengono catturate nel pellet. Quindi, sospendere nuovamente il pellet di cella in un millilitro di mezzo M199.
Valutare la vitalità cellulare mescolando 10 microlitri di tripano blu con 10 microlitri di stock cellulare. Osservare la morfologia cellulare e contare le cellule usando un emocitometro. Rivestire due pozzetti di una piastra a sei pozzetti pipettando 500 microlitri di reagente di attacco in pozzetti per 30 minuti a temperatura ambiente.
Dopo aver lavato i pozzetti con DPBS sterile, erogare l'intero stock cellulare in un pozzo e il surnatante viene mantenuto come controllo nel secondo pozzo. Centrifugare il materiale cellulare precedentemente preparato a quattro gradi Celsius e 600 volte G per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e sospendere nuovamente il pellet delicatamente con una pipetta P-1000 in 0,04% BSA in DPBS.
Mescolare bene per garantire una sospensione monocellulare. Passare la soluzione attraverso un filtro da 40 micrometri per rimuovere i detriti cellulari. Quindi, centrifugare la sospensione e rimuovere il surnatante come dimostrato.
Sospendere nuovamente il pellet in 500 microlitri dello 0,04% BSA in DPBS utilizzando una pipetta P-1000 e miscelare bene per garantire una sospensione a cella singola. Come dimostrato in precedenza, valutare la vitalità cellulare usando il tripano blu. Utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare automatizzato, osservare la morfologia della sospensione monocellulare, verificare la presenza di detriti tissutali e calcolare il numero di cellule vive e morte.
Dopo aver aggiunto l'isopentano a un contenitore metallico, raffreddare in azoto liquido o ghiaccio secco. Versare il composto OCT in pozzetti di criomuffa in plastica etichettata, prevenendo la formazione di bolle. Lasciare raffreddare la criomuffa sul ghiaccio secco.
Tagliare almeno due sezioni coronali di un centimetro nella lunghezza della nave. Usando una pinza da 12 pollici, immergere il tessuto in isopentano fino a quando non viene congelato. Immergere rapidamente il tessuto in OCT all'orientamento con il lume visibile al centro.
Afferrare e posizionare i criostrelli sul ghiaccio secco e osservare il congelamento. L'OCT diventerà progressivamente bianco dall'esterno in uno o due minuti. Conservare queste sezioni in un contenitore protetto a meno 80 gradi Celsius per un massimo di sei mesi.
Impostare la temperatura criostatale desiderata per la camera e la testa del campione. Equilibrare sezioni di vasi incorporati nell'OCT, coltelli, spazzole e diapositive a meno 20 gradi Celsius nel criostato per circa 30 minuti. Durante l'equilibratura, pulire la macchina e tutte le attrezzature che possono toccare le sezioni, compresa la lama, con etanolo al 70% seguito da soluzione di decontaminazione RNasi.
Collegare il campione erogando una piccola quantità di OCT sul blocco criostato circolare e posizionando il campione sopra prima che si congeli. Dopo aver posizionato il blocco al centro della testa del campione, avvitare il blocco in posizione utilizzando l'alta maniglia nera a sinistra. Tagliare via qualsiasi PTOM in eccesso che circonda la nave.
Impostando lo spessore di taglio a 10 micrometri sul criostato, tagliare circa 60 sezioni e posizionarle in un tubo pre-raffreddato da 1,5 millilitri contenente reagente di estrazione dell'RNA. Vortice fino a quando le sezioni sono completamente dissolte. Estrarre l'RNA come descritto nel manoscritto di testo e sciogliere il pellet di RNA purificato in cinque microlitri di acqua priva di RNasi.
Tagliare sezioni spesse 10 micrometri con piastra antirollio in posizione. Capovolgere e appiattire con attenzione toccando delicatamente la sezione attraverso l'OCT circostante. Pulire il vetrino con etanolo e preriscaldare il retro dell'area di acquisizione con il dito.
Utilizzando direttamente le spazzole criostatiche prive di RNasi o il vetrino, posizionare la sezione del tessuto all'interno del quadrato utilizzando solo l'OCT circostante. Posizionare immediatamente un dito sul retro dell'area di acquisizione per fondere la sezione con la diapositiva. Una volta che la sezione aderisce, posiziona la diapositiva sulla barra criometrica per consentire alla sezione di congelarsi.
Tagliare sezioni di tessuto spesse 10 micrometri come dimostrato in precedenza su vetrini di ottimizzazione tissutale o di espressione genica. Trasferire la diapositiva su un mailer a scorrimento posto su ghiaccio secco. La figura raffigura EC isolati coltivati utilizzando il protocollo descritto che mostra una morfologia distinta simile a ciottoli con cellule contaminanti minime.
L'espressione della caderina endoteliale vascolare marcatore EC è stata confermata utilizzando l'immunofluorescenza visualizzando le giunzioni cellula-cellula. Circa l'80% delle cellule erano CD31-positive, indicando che le EC arteriose mesenteriche umane costituivano la maggior parte della popolazione cellulare appena isolata. Gli isolamenti non riusciti provocano cellule con morfologia disturbata, che potenzialmente esprimono marcatori mesenchimali o si allungano come uno stato fibroblastico.
La figura mostra un'approssimazione e una proiezione rappresentative di varietà uniformi isolate per l'arteria mesenterica utilizzando il presente protocollo per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula su ECS arterioso mesenterico umano isolato, con il 34% di cellule raggruppate come EC utilizzando PECAM1 e VWF come marcatori. L'RNA di alta qualità dovrebbe mostrare un numero di integrità dell'RNA non inferiore a sei e il rapporto tra le bande di RNA ribosomiale 28S e 18S è il più vicino possibile a due. Una debolezza o assenza di questi segnali di RNA ribosomiale può essere osservata quando gli RNA sono degradati.
La colorazione di ematossilina ed eosina ha visualizzato la morfologia della nave, consentendo di identificare le regioni di interesse. L'espressione genica è stata visualizzata con ancoraggio spaziale sul vaso macchiato di ematossilina ed eosina. Maneggiare attentamente il tessuto e il patrimonio cellulare per mantenere la qualità dell'RNA, in particolare per la profilazione del trascrittoma spaziale.
Assicurarsi che il tessuto sia posto su ghiaccio secco per ridurre la degradazione dell'RNA. Inoltre, maneggiare le sezioni e il tessuto con strumenti pre-raffreddati. Siamo stati in grado di esplorare i cambiamenti dell'espressione genica EC, compresi gli LncRNA nel contesto del diabete e la loro interazione con altri tipi di cellule.
Possiamo dedurre la posizione di questi cambiamenti trascrittomici usando tecniche di profilazione del trascrittoma spaziale.
